李云南，劉青

（1.山西省水產(chǎn)育種養(yǎng)殖科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，山西 清徐 030400；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山西 太谷 030801）

新型苯扎溴銨對(duì)克氏原螯蝦急性毒性的研究

李云南1，劉青2

（1.山西省水產(chǎn)育種養(yǎng)殖科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，山西 清徐 030400；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山西 太谷 030801）

本實(shí)驗(yàn)采用靜水式實(shí)驗(yàn)方法，克氏原螯蝦為受實(shí)動(dòng)物，研究新型苯扎溴銨對(duì)克氏原螯蝦的急性毒性，結(jié)果表明16℃時(shí)，新型苯扎溴銨對(duì)克氏原螯蝦的24、48、96 h半數(shù)致死濃度分別為14.0、9.0、7.0 μL/L，安全濃度為0.7 μL/L。

固著纖毛蟲??；苯扎溴銨；急性毒性

克氏原螯蝦的養(yǎng)殖過程中，養(yǎng)殖池塘的塘底和養(yǎng)殖水體常因環(huán)境變異而滋生細(xì)菌、病毒以及附生生物導(dǎo)致蝦病發(fā)生。新型苯扎溴銨作為蝦養(yǎng)殖過程中的疾病治療及水體消毒劑使用[1]。本實(shí)驗(yàn)就這種藥物在養(yǎng)殖過程中的作用效果及使用的安全劑量做一探討。

隨著養(yǎng)殖水環(huán)境及藥物濫用的發(fā)生，常引發(fā)各種疾病，而固著纖毛蟲病是蝦蟹養(yǎng)殖過程中的主要疾病，其由累枝蟲、聚縮蟲、鐘形蟲等附著類纖毛蟲寄生在蝦眼鰓及體表上引發(fā)的一類寄生蟲疾病。目前這類治療這類疾病的藥物不少，作為最早開始使用的藥物，孔雀石綠對(duì)固著纖毛蟲有很好的殺滅效果，但因其高毒性、用藥后生物體內(nèi)殘留時(shí)間長以及“三致”等毒副作用。早在2002年已被國家列入禁用藥清單。此外有硫酸銨、硫酸銅、高錳酸鉀、甲醛或戊二醛及代森類制劑還有傳統(tǒng)中草藥制劑，但這些藥物有的成本過高，有的毒副作用大，有的還是禁用藥[2]。因此新型藥物研發(fā)很有必要，新型苯扎溴銨具有高效、低毒等特點(diǎn)，主要通過其表面強(qiáng)效的活性作用改變病原體細(xì)胞膜的通透性來影響病原體的新陳代謝，另外也可引起蛋白質(zhì)變性起到抗菌殺蟲的作用[3]。因此在蝦蟹養(yǎng)殖中用于治療固著纖毛蟲病及對(duì)蝦肌肉壞死癥，又可以作為消毒劑抑制塘中有害細(xì)菌。但作為新型藥物在投放市場(chǎng)前需要了解其用藥安全問題。

1 材料及與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象克氏原螯蝦購自當(dāng)?shù)厮a(chǎn)貿(mào)易市場(chǎng)，體長（8.9±0.6）cm，體質(zhì)量（31.5±1.5）g/尾，體態(tài)正常、規(guī)格整齊、無病無傷。在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)用曝氣48 h以上的脫氯自來水馴養(yǎng)1周，每天正常投飼和換水，及時(shí)剔除攝食和運(yùn)動(dòng)不正常的個(gè)體，每天記錄病死率，當(dāng)病死率穩(wěn)定在5%以下時(shí)方可用于實(shí)驗(yàn)，在實(shí)驗(yàn)結(jié)束前一天停止投飼，正常換水，確保實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處于空腸狀態(tài)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥品新型苯扎溴銨瓶裝液體由山西益鑫泰生物科技有限公司提供。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)條件暫養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)期間的實(shí)驗(yàn)用水是經(jīng)過48 h以上曝氣處理的脫氯自來水，平均水溫（18±1）℃，pH值7.5，溶氧量4.5～5.5 μL/L，實(shí)驗(yàn)采用自然光照。實(shí)驗(yàn)容器是半透明水族箱，在使用之前用高錳酸鉀溶液清洗浸泡消毒，清洗晾干。實(shí)驗(yàn)之前用設(shè)計(jì)濃度實(shí)驗(yàn)藥品浸泡容器24 h，減少實(shí)驗(yàn)中容器對(duì)藥品的吸附，最后向每個(gè)容器中加入40 L實(shí)驗(yàn)用水并加入新配的相應(yīng)濃度藥品，從低濃度組向高濃度組依次各放入相同數(shù)量、規(guī)格一致、體質(zhì)健康的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

采用靜水實(shí)驗(yàn)法[4]對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行急性毒性實(shí)驗(yàn)，探討新型苯扎溴銨對(duì)克氏原螯蝦的安全濃度，需要通過96 h預(yù)實(shí)驗(yàn)得出全數(shù)致死下限濃度和全部存活上限濃度。

根據(jù)藥物的預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果在濃度間分別按等差和等比設(shè)計(jì)4個(gè)濃度梯度，用蒸餾水溶解實(shí)驗(yàn)藥品并按照設(shè)計(jì)濃度梯度配置成便于取用的高濃度母液。臨用時(shí)，用移液槍移取定量母液稀釋成最高濃度組的設(shè)計(jì)濃度，然后按照等比濃度梯度稀釋法稀釋得到剩下四個(gè)濃度的藥液。然后向各實(shí)驗(yàn)容器中加入40 L經(jīng)48 h曝氣自來水，再對(duì)應(yīng)加入配好藥液，從低濃度組向高濃度組依次放入規(guī)格一致、活潑健康的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物并設(shè)平行組和不加藥的空白對(duì)照組。每24 h換一次水，換水量為20 L，每次換水前按濃度要求配置好，換水時(shí)從低濃度向高濃度進(jìn)行。在實(shí)驗(yàn)過程中需要每天觀察記錄實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的反常行為、外觀變化、中毒癥狀、死亡等現(xiàn)象。中毒后，多次刺激后無反應(yīng)，放置在清水中30 min后仍無反應(yīng)則判定為死亡，及時(shí)撈出死亡個(gè)體記錄死亡數(shù)量計(jì)算病死率。根據(jù)改良寇氏法計(jì)算苯扎溴銨對(duì)克氏原螯蝦的安全濃度。

1.2.1 預(yù)實(shí)驗(yàn)將藥品稀釋或溶解配置成便于計(jì)算取用的高濃度母液，按照等比濃度梯度稀釋法配置藥液獲得5個(gè)濃度梯度，從各試管中移取一定體積藥液按標(biāo)記加入實(shí)驗(yàn)容器中形成5個(gè)濃度組，實(shí)驗(yàn)設(shè)一個(gè)不加藥物的對(duì)照組。新型苯扎溴銨實(shí)驗(yàn)組每個(gè)濃度組加入11尾規(guī)格一致、肢體健全、健康的克氏原螯蝦。觀察96 h，記錄24、48、72、96 h病死率，得到克氏原螯蝦對(duì)新型苯扎溴銨耐受濃度和100%致死的藥液濃度。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)藥品需要提前配制好便于計(jì)算取用的高濃度母液。容器需要進(jìn)行標(biāo)記編號(hào)，上面有實(shí)驗(yàn)藥品種類、濃度、開始時(shí)間。先用高錳酸鉀溶液消毒、再用對(duì)應(yīng)濃度的藥品浸泡24 h。用清洗消毒的水族箱盛滿自來水，48 h不間斷增氧曝氣脫氯用作實(shí)驗(yàn)用水。蝦在實(shí)驗(yàn)前暫養(yǎng)一周，馴養(yǎng)期間正常投飼、換水，實(shí)驗(yàn)前48 h停止喂食以排空腸道，在實(shí)驗(yàn)前對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物挑選、測(cè)量記錄體長體質(zhì)量。新型苯扎溴銨組每個(gè)濃度投放6尾克氏原螯蝦。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)開始新型苯扎溴銨實(shí)驗(yàn)藥液配置采用等比稀釋法，先取用一定量高濃度母液稀釋得到6號(hào)濃度組的加藥濃度。通過等比稀釋獲得新型苯扎溴銨的其余5個(gè)濃度的藥液。配好的藥液用移液管量取定量藥液加入對(duì)應(yīng)實(shí)驗(yàn)容器，配置好實(shí)驗(yàn)組溶液，然后按照低濃度到高濃度的方向放入實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。同一濃度設(shè)平行組，實(shí)驗(yàn)設(shè)不加藥的對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)時(shí)間不投飼，每24 h換1/2的水，并加藥保持原有濃度不變。實(shí)驗(yàn)開始后每24 h觀察記錄一次水溫、pH及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物活動(dòng)情況、中毒反應(yīng)、死亡情況。發(fā)現(xiàn)死亡個(gè)體及時(shí)記錄、撈出。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用Excel表格進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物死亡情況列表得出每個(gè)濃度的平均病死率，用改良寇氏法公式（1）計(jì)算半數(shù)致死濃度[5]。據(jù)此按公式（2）[6]計(jì)算安全濃度。

式中：Xm為最大劑量的對(duì)數(shù)；i為相鄰兩組對(duì)數(shù)量之差數(shù)；ΣPi為各組病死率之和。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 中毒癥狀

實(shí)驗(yàn)中，向32 μL/L濃度組中放入試驗(yàn)蝦后，出現(xiàn)中毒初期癥狀，蝦活動(dòng)劇烈，快速移動(dòng)，此時(shí)用玻璃棒刺激會(huì)出現(xiàn)正常的抵御反應(yīng)；藥物作用一段時(shí)間后，活動(dòng)能力減弱，螯足附肢收縮、僵硬、附肢出現(xiàn)抽搐，有的能爬行，行進(jìn)非常緩慢，且動(dòng)作僵硬不連貫，有的側(cè)躺、仰臥，失去運(yùn)動(dòng)能力，用玻璃棒刺激尾部無任何抵御反應(yīng)；24 h內(nèi)全部死亡，死亡時(shí)螯足、附肢僵硬呈收縮緊抱狀態(tài)，正常缺氧致死的蝦肢腳呈伸展癱瘓狀態(tài)。8 μL/L和16 μL/L濃度組出現(xiàn)中毒癥狀，活動(dòng)能力減弱，瀕死的個(gè)體側(cè)躺、仰臥，失去運(yùn)動(dòng)能力，在48～96 h期間大規(guī)模出現(xiàn)蝦的回避反應(yīng)，側(cè)身附著在箱壁露出水面。

2.2 結(jié)果

新型苯扎溴銨對(duì)克氏原螯蝦的急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。

在新型苯扎溴銨中克氏原螯蝦24、48、72、96 h的LC50分別為14.0、9.0、8.4、7.0 μL/L。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)公式SC=96 h LC50×0.1得到安全濃度SC為0.7 μL/L，如表2。LC50隨藥物作用時(shí)間的延長越來越小，對(duì)克氏原螯蝦的急性毒性作用越來越大。急性毒性隨藥作用時(shí)間延長而增加呈正相關(guān)變化，在相同作用時(shí)間下病死率隨水中藥物濃度升高而遞增。同其他藥物急性毒性效果相同，隨濃度升高、作用時(shí)間延長而增加。整個(gè)過程2 μL/L組未出現(xiàn)死亡，與對(duì)照組相同。隨著藥物濃度的增大，實(shí)驗(yàn)蝦開始出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，在24 h內(nèi)32 μL/L濃度組的病死率為100%，24 h內(nèi)4 μL/L濃度組病死率為0，隨著藥物作用時(shí)間的延長，72 h開始出現(xiàn)死亡，病死率為27.3%，正是由于藥物在體內(nèi)的富集超過一定程度引起的。

表1 新型苯扎溴銨對(duì)克氏原螯蝦的急性毒性

表2 新型苯扎溴銨的半數(shù)致死濃度LC50及安全濃度SC

以96 h半致死質(zhì)量濃度為評(píng)判對(duì)象，依據(jù)國家環(huán)境保護(hù)局給出的新化學(xué)藥品對(duì)魚類急性毒性的危害等級(jí)標(biāo)準(zhǔn)（見表3）可知新型苯扎溴銨制劑屬于高毒藥物。

3 分析和討論

表3 新化學(xué)藥品對(duì)魚類急性毒性危害等級(jí)標(biāo)準(zhǔn)

根據(jù)新型溴銨產(chǎn)品說明，其治療固著纖毛蟲病如蟹居江氏偽鐘蟲的潑灑濃度0.35 μL/L，施用濃度低于其對(duì)克氏原螯蝦的安全濃度0.7 μL/L。因此在一定濃度范圍施用是不會(huì)對(duì)克氏原螯蝦造成影響的。但是新型苯扎溴銨作為高毒藥物，在施用時(shí)應(yīng)控制好用量，避免施用時(shí)全池潑灑，而是采用短時(shí)間浸浴進(jìn)行疾病的防治。其中成蝦對(duì)苯扎溴銨安全濃度高于幼蝦安全濃度，致毒能力幼蝦大于成蝦[1，7]，因此對(duì)幼齡階段的個(gè)體要注意施藥用量。新型苯扎溴銨的主要成分是苯扎溴銨，苯扎溴銨是消毒液的主要成分，為廣譜殺菌劑，對(duì)金黃色葡萄球菌具有良好的殺菌效果，對(duì)大腸桿菌、枯草桿菌以及源弧菌均有抑制作用，并且隨時(shí)間的延長易分解，因此該藥也可用于放養(yǎng)前池壁及水體的消毒[1，8-10]。

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Model of benzalkonium bromide on Procambarus clarkii study on acute toxicity

Li Yunnan1.Liu Qing2
（1.Aquaculture Breeding Science Experimental Center of Shanxi Province，Qingxun 030400，China；2.College of Animal Science and Technology,Shanxi Agricultural University，Taigu 030801，China）

The experiment stuided with routine bidogical toxicity method under the condition of indoor with still water.The results showed that：on 16℃the median tolerance concentration at 24 h，48 h，72 h and 96 h of Model of Benzalkonium bromide on Procambarus clarkii were 14.0，9.0，7.0 μL/L，the safe concentration was 0.7 μL/L.

fixing ciliate；benzalkonium bromide；acute toxicity

S948

A

1004-2091（2017）04-0031-04

10.3969/j.issn.1004-2091.2017.04.007

2016-06-30）

山西省水利廳事業(yè)發(fā)展類項(xiàng)目（2014JSCW340）、山西農(nóng)業(yè)大學(xué)橫向項(xiàng)目（2013HX102）

李云南（1984-），男，助理工程師，研究方向：水產(chǎn)養(yǎng)殖疾病防治.E-mail：632416015@qq.com

劉青（1980-），男，講師.E-mail:liuqing_sxau@126.com