李鵬輝++費洪新++王立紅++許惠玉++張海燕

[摘要] 目的 構(gòu)建PDCD5基因真核表達載體，并電轉(zhuǎn)染BGC823細胞，獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞。 方法 設(shè)計合成PDCD5基因片段，將其插入經(jīng)EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切的pcDNA3.1+表達載體，菌落PCR和基因測序進行鑒定。重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)染BGC823細胞，G418篩選數(shù)周后PCR鑒定穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞。 結(jié)果 重組質(zhì)粒經(jīng)菌落PCR測序分析表明，PDCD5基因序列準確插入預(yù)期位置，且序列正確。重組質(zhì)粒成功電轉(zhuǎn)染BGC823細胞，并整合入細胞基因組DNA。結(jié)論 成功構(gòu)建了PDCD5基因真核表達載體，并整合進BGC823細胞基因組，為研究PDCD5基因的功能及胃癌的基因治療提供實驗基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞] PDCD5基因；pcDNA3.1+表達載體；電轉(zhuǎn)染；BGC823細胞系

[中圖分類號] R394 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2017）06-0033-03

[Abstract] Objective To construct eukaryotic expression vector of PDCD5 gene and transfect BGC823 cells to obtain stable transfected cells. Methods The PDCD5 gene fragment was designed and inserted into pcDNA3.1+ expression vector which was digested with EcoR Ⅰ and Xho Ⅰ. Colony PCR and sequencing were used for identification. The recombinant plasmid was electrically transfected into BGC823 cells， and PCR was used for identifying the stably transfected cells after G418 screening for weeks. Results It was suggested by colony PCR and sequencing analysis that the recombinant plasmid PDCD5 gene sequenc was accurately inserted into the desired position and the sequence was correct.Recombinant plasmids were successfully transfected into BGC823 cells and integrated into cell genomic DNA. Conclusion The eukaryotic expression vector of PDCD5 gene is successfully constructed and integrated into BGC823 cell genome， which provided experimental basis for studying the function of PDCD5 gene and gene therapy of gastric cancer.

[Key words] PDCD5 gene； pcDNA3.1+ expression vector； Electrical transfection； BGC823 cell line

程序性細胞死亡因子5（programmed cell death 5，PDCD5）原名為TFAR19，由北京大學(xué)人類疾病基因中心從白血病細胞株TF-1細胞中克隆得到，具有促進多種細胞凋亡和抑制增殖的效應(yīng)，其異常表達與多種腫瘤及自身免疫性疾病有相關(guān)性[1]。研究表明，PDCD5基因在膠質(zhì)瘤細胞[2]、前列腺癌細胞[3]、結(jié)腸癌[4]和胃癌[5]等多種惡性腫瘤組織中較正常組織表達水平下降，并且重組人PDCD5蛋白可以增強軟骨肉瘤細胞[6]和肺癌細胞[7]等腫瘤細胞對化療藥物的敏感性。胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，其5年生存率低于20%，是全球第二個癌癥死亡相關(guān)的原因，而我國每年因胃癌死亡病例占全球人口的47.8%[8]。本研究以PDCD5基因和BGC823胃癌細胞為研究對象，構(gòu)建pcDNA3.1+-PDCD5重組真核表達載體，電轉(zhuǎn)染BGC823細胞，并篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株，為進一步研究PDCD5基因的功能及進行胃癌的基因治療奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

BGC823細胞株和pcDNA3.1+質(zhì)粒由齊齊哈爾大學(xué)生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院邵淑麗教授惠贈；DNA回收試劑盒及細胞基因組DNA提取試劑盒由武漢金開瑞生物技術(shù)有限責(zé)任公司提供；RPMI 1640培養(yǎng)基干粉購于Gibco公司；胎牛血清、DNA Marker及各種工具酶購于上海生工；ECM830型電穿孔儀購于美國BTX公司。

1.2 方法

1.2.1 PDCD5基因和引物的合成 PDCD5基因序列由NCBI數(shù)據(jù)庫提供的資料確定，并在序列5端和3端分別添加EcoRⅠ和XhoⅠ限制性酶切位點，序列全長383bp，連同pcDNA3.1+表達載體通用引物（pcDNA3.1-F：CTAGAGAACCCACTGCTTAC；pcDNA3.1-R：TAGAAGGCACAGTCGAGG）均送交武漢金開瑞生物技術(shù)有限公司合成。實驗時間為2015年6月～2016年6月。

1.2.2 重組載體的構(gòu)建 將pcDNA3.1+載體用EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切37℃、3 h；80℃、20 min。用EcoRⅠ單酶切質(zhì)粒作比對，電泳回收線性載體片段。用T4 DNA連接酶連接雙酶切載體與PDCD5基因16℃，12 h，反應(yīng)體系中雙酶切載體和PDCD5基因的摩爾比為1∶3。

1.2.3 重組載體的轉(zhuǎn)化及鑒定 將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)大腸桿菌，涂布于含60 μg/mL Amp的LB篩選平板上，37℃培養(yǎng)12～16 h。挑取部分轉(zhuǎn)化單菌落，以pcDNA3.1+載體通用引物進行菌落PCR：94℃預(yù)變性2 min；94℃ 變性30 s，55℃ 退火30 s，72℃延伸45 s，共34個循環(huán)；72℃ 延伸1 min，4℃保存。以未轉(zhuǎn)化的DH5α菌落作陰性對照，以pcDNA3.1+質(zhì)粒作陽性對照。將經(jīng)菌落PCR鑒定正確的菌落進行擴大培養(yǎng)，測序鑒定。

1.2.4 重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)染BGC823細胞 BGC823細胞于37℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)。取處于對數(shù)生長中晚期細胞，用無血清1640培養(yǎng)基調(diào)整細胞密度至5×106 個/mL，取400 μL加入0.4 cm電轉(zhuǎn)杯，加入經(jīng)線性化的重組載體30 μg，冰浴10 min，于185 V、30 ms電擊，電擊后冰浴10 min，將細胞移至培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。

1.2.5 轉(zhuǎn)染細胞的篩選和檢測 轉(zhuǎn)染細胞培養(yǎng)48 h后，以含500 μg/mL G418的培養(yǎng)基篩選培養(yǎng)8 d，以含250 μg/mL G418的培養(yǎng)基維持培養(yǎng)16 d后，收獲穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞。根據(jù)試劑盒說明提取穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞基因組DNA，以載體通用引物進行PCR反應(yīng)：94℃預(yù)變性2 min；94℃ 變性45 s，55℃ 退火45 s，72℃ 延伸45 s，共34個循環(huán)；72℃ 延伸3 min，4℃保存。以重組質(zhì)粒作陽性對照，以未經(jīng)轉(zhuǎn)染細胞基因組作陰性對照。

2 結(jié)果

2.1 重組載體的構(gòu)建

pcDNA3.1+質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物電泳圖顯示（封三圖4），單酶切產(chǎn)物大小約為5500bp，雙酶切產(chǎn)物略小于單酶切產(chǎn)物，兩者的條帶位置基本一致，與預(yù)期結(jié)果相符。pcDNA3.1+質(zhì)粒的電泳結(jié)果表現(xiàn)為復(fù)制中間體、開環(huán)、超螺旋等2～3條與線性DNA Marker不完全相對應(yīng)的電泳條帶，見封三圖4。

2.2 重組載體的鑒定

轉(zhuǎn)化單菌落PCR擴增產(chǎn)物，經(jīng)電泳分析發(fā)現(xiàn)擴增出561bp大小的條帶，與期望條帶大小一致，未轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α 菌落沒有擴增產(chǎn)物，pcDNA3.1+質(zhì)粒的引物擴增片段大小為211bp。在檢測結(jié)果中隨機選擇3個陽性克隆重復(fù)擴增，結(jié)果穩(wěn)定（封三圖5）。經(jīng)抗性平板和菌落PCR鑒定正確的陽性克隆的測序結(jié)果與合成序列一致，說明目的基因已正確插入載體，成功構(gòu)建重組質(zhì)粒（圖1）。

2.3 轉(zhuǎn)染細胞的PCR鑒定

提取轉(zhuǎn)染細胞基因組，以載體通用引物作PCR擴增，電泳顯示，擴增出561bp大小的條帶，與陽性對照擴增產(chǎn)物大小相同，陰性對照沒有擴增產(chǎn)物，與預(yù)期結(jié)果一致。見封三圖6。

3 討論

胃癌是嚴重危害我國人民健康的惡性腫瘤之一，其早期確診率較低，死亡率較高是胃癌臨床診斷和治療的突出特點。采用手術(shù)切除胃癌組織的方法治療中晚期胃癌，往往難以達到滿意的治療效果，因此化療是中晚期胃癌的主要治療手段，但是化療藥物的臨床應(yīng)用常導(dǎo)致多藥耐藥等反應(yīng)，造成腫瘤細胞對化療藥物的不敏感而難免復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。目前，多種靶向關(guān)鍵細胞信號傳導(dǎo)途徑的分子靶向療法越來越受到抗腫瘤研究人員的重視，其對于增強化療效果具有重要意義。

PDCD5基因是由北京大學(xué)人類疾病基因中心1999年在國際上首先報道的一個人類新基因，由白血病細胞株TF-1細胞中克隆得到。PDCD5的mRNA除了在造血系統(tǒng)外，在成人的心臟、腎臟、腎上腺、睪丸及胎盤中高度表達，其中胚胎組織的表達低于成年組織，腫瘤細胞的表達低于正常細胞[9]。PDCD5具有促進細胞凋亡的功能，主要定位于細胞核內(nèi)，其高表達在促細胞凋亡過程中有重要作用，并且研究發(fā)現(xiàn)PDCD5是凋亡促進劑，而不是凋亡誘導(dǎo)劑[10，11]?；诖髽颖緮?shù)據(jù)的分析表明，PDCD5基因的表達變化與胃癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，其有可能成為一種胃癌診斷與治療的新靶點[12]。為進一步研究PDCD5基因在胃癌細胞中的作用，本研究構(gòu)建PDCD5基因真核表達載體，并電轉(zhuǎn)染BGC823細胞。

在重組載體構(gòu)建中，雙酶切pcDNA3.1+質(zhì)粒，獲得與設(shè)計的合成的PDCD5基因片斷具有相同粘性末端的線性載體，PDCD5基因片斷定向連接到載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞，并利用質(zhì)粒的Amp抗性基因篩選陽性轉(zhuǎn)化子。挑取抗性平板上的單菌落，直接進行PCR檢測重組質(zhì)粒，省去了質(zhì)粒提取的繁瑣操作，避免了DNA制備過程中的某種試劑對擴增帶來的不良影響，能夠較為準確、快速的篩選出陽性克隆[13，14]。

外源DNA可通過瞬時轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染兩種方式導(dǎo)入真核細胞。瞬時轉(zhuǎn)染可以獲得目的基因暫時的高水平表達，轉(zhuǎn)染的DNA不必整合進宿主染色體，而穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的目的基因則整合到染色體DNA中，并利用外源DNA上帶有的抗性基因篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞。本實驗選用的pcDNA3.1+質(zhì)粒攜帶neo基因，能夠高效表達分解G418的抗性產(chǎn)物—氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶，從而使細胞能在含有G418的篩選培養(yǎng)基中生長。

雖然環(huán)狀與線狀DNA均可電穿孔轉(zhuǎn)染，但線性DNA無論瞬時表達還是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的水平都要高一些[15]。因此，本研究將構(gòu)建的pcDNA3.1+-PDCD5重組質(zhì)粒線性化后電轉(zhuǎn)染，經(jīng)G418篩選獲得重組質(zhì)粒隨機整合到宿主細胞基因組中的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染BGC823細胞，進而為后續(xù)研究PDCD5基因在胃癌細胞中的功能，以及胃癌的診斷和治療提供實驗基礎(chǔ)。

[參考文獻]

[1] Liu H，Wang Y，Zhang Y，et al. TFAR19，a novel apoptosis-related gene cloned from human leukemia cell line TF-1，could enhance apoptosis of some tumor cells induced by growth factor withdrawal[J]. Biochem Biophys Res Commun，1999，254（1）：203-210.

[2] Li HYS，Zhang Xi，Song XG，et al. PDCD5 promotes cisplatin-induced apoptosis of glioma cells via activating mitochondrial apoptotic pathway[J]. Cancer Biology & Therapy，2012，13（9）：822-830，

[3] Du YJ，Xiong L，Lou Y，et al. Reduced expression of programmed cell death 5 protein in tissue of human prostate cancer[J]. Chin Med Sci J，2009，24（4）：241-245.

[4] 楊麗，鮑曉蕾，孫遠杰，等. 凋亡相關(guān)基因PDCD5在結(jié)腸癌組織中表達的意義[J]. 中國臨床研究，2014，27（12）：1445-1447.

[5] 胡營濱，劉群，吳愛杰，等. PDCD5蛋白在胃腺癌及其癌前病變中的差異性表達研究[J]. 濱州醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2015，38（1）：7-9，60.

[6] Han Xr，Sun Y，Bai XZ. The anti-tumor role and mechanism of integrated and truncated PDCD5 proteins in osteosarcoma cells[J]. Cellular Signalling，2012，24（8）：1713-1721.

[7] 蘇帆，李煥煥，趙丹寧，等. PDCD5蛋白聯(lián)合順鉑對A549細胞凋亡影響研究[J]. 中華腫瘤防治雜志，2015，22（8）：595-598.

[8] 鮑曉蕾，潘留蘭，楊麗，等. 凋亡相關(guān)基因PDCD5在胃癌組織的表達及臨床意義[J]. 中國實用醫(yī)藥，2016，11（9）：63-64.

[9] 劉永蕊，劉靜蕾，唐國棟，等. PDCD5基因與非小細胞肺癌的研究進展[J]. 中國腫瘤，2015，24（4）：302-306.

[10] Zhang X，Wang X，Song X，et al. Clinical and prognostic significance of lost or decreased PDCD5 expression in humanepithelial ovarian carcinomas[J]. Oncol Rep，2011， 25（2）：353-358.

[11] Wang LL，Wang CJ，Su BN. Recombinant human PDCD5 protein enhances chemo-sensitivity of breast cancer in vitro and in vivo[J]. Biochem Cell Biol，2013，91（6）：526-531.

[12] 王巍，張志常，宋曉雯，等. 基于數(shù)據(jù)挖掘分析PDCD5表達對胃癌預(yù)后的影響[J]. 現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2016，24（24）：3957-3959.

[13] 張德全，劉涵，廖勇，等. 菌落PCR改良技術(shù)快速鑒定阿薩希毛孢子菌的實驗研究[J]. 中國真菌學(xué)雜志，2015， 10（1）：6-10.

[14] 李旭艷，惲冬澤，邵淑麗. 單菌落PCR在發(fā)夾RNA重組克隆鑒定中的應(yīng)用[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，53（1）：220-221，235.

[15] 肖越，邵淑麗，李鵬輝，等. 沉默MDR1基因表達逆轉(zhuǎn)肺癌A549/DDP細胞對順鉑的耐藥性[J]. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2016，（11）：1-10.

（收稿日期：2016-11-23）