王一雯，權(quán)淑靜，馬煥，陳國參，劉德海*

（1.河南省科學院生物研究所有限責任公司，河南鄭州450008；2.河南省工業(yè)酶工程技術(shù)研究中心，河南鄭州450008）

一株產(chǎn)海藻糖合酶假單胞菌菌株的分離及鑒定

王一雯1，2，權(quán)淑靜2，馬煥2，陳國參1，劉德海1*

（1.河南省科學院生物研究所有限責任公司，河南鄭州450008；2.河南省工業(yè)酶工程技術(shù)研究中心，河南鄭州450008）

由薄層層析法檢測試驗發(fā)現(xiàn)，從昆明磷礦粉中分離出的一株真細菌，其粗酶液能將麥芽糖異構(gòu)化為海藻糖。通過顯微觀察發(fā)現(xiàn)，該菌株為革蘭氏陰性菌，無色、桿狀、具有鞭毛；菌體直徑大小0.6～0.8 μm，長度約1.4～2.0 μm；胞內(nèi)沒有聚-β-羥丁酸（PHB）包含體；最佳生長溫度為30℃，最適生長pH為7.0。經(jīng)16S rRNA序列比對、DNA（G+C）mol%和DNA-DNA雜交等分子生物學技術(shù)以及生理生化特性檢測后，認定該菌株為假單胞菌屬（Pseudomonassp.）一種，將其命名為BIE-1。該菌株增加了假單胞菌屬菌種多樣性，為海藻糖生物合成真細菌菌株提供了新的選擇。

假單胞菌屬；16S rRNA；DNA-DNA雜交；薄層層析法；海藻糖

海藻糖對稱的雙分子結(jié)構(gòu)使其具有極強的穩(wěn)定性，因而被廣泛用于新型食品加工、醫(yī)療以及生物技術(shù)領域[1]。在一些真細菌中，麥芽糖可借助海藻糖合酶（trehalose synthase，TreS）發(fā)生分子內(nèi)結(jié)構(gòu)重排，將麥芽糖還原端的α-1,4糖苷鍵轉(zhuǎn)為α-1,1糖苷鍵生成海藻糖，這是完全不同于其他途徑的低能耗海藻糖合成方式[2-3]。分子內(nèi)的葡糖基轉(zhuǎn)移酶不僅利用低成本的麥芽糖為作用底物生成高產(chǎn)值海藻糖，且轉(zhuǎn)化步驟簡潔、操縱簡單易行，具有極強的工業(yè)利用價值[4-5]。因此，尋找更多可利用海藻糖合酶（TreS）的真細菌成為拓展該生產(chǎn)途徑的方向之一。

假單胞菌種類多、分布廣，一部分假單胞菌是人類、動物和植物的病原體，另一些則具有生物技術(shù)應用潛在價值[6]。為發(fā)掘高產(chǎn)海藻糖新菌株，從云南昆明市郊磷礦區(qū)的磷礦巖粉樣品中分離出二十余株真細菌菌株，利用薄層層析法篩選出一株通過TreS途徑將麥芽糖轉(zhuǎn)變?yōu)楹Ｔ逄堑恼婕毦?。通過形態(tài)學、理化特性和分子生物學對該菌株分類鑒定，不僅增加假單胞菌屬菌種多樣性，也為海藻糖生產(chǎn)菌提供更多選擇。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

從云南省昆明市郊磷礦廠采集磷礦石樣品，通過篩選分離得到若干菌株。參照菌株黃色海假單胞菌KMM1447T：俄羅斯海洋微生物保藏中心；施氏假單胞菌ATCC17588T：美國ATCC菌種保藏中心。

1.1.2 主要試劑

革蘭氏染色試劑盒：美國Thermo Fisher科技公司；API 20 NE細菌鑒定試劑條：法國生物梅里埃公司；基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）抽提試劑盒：美國Axygen公司；GNS-16革蘭氏陰性桿菌藥敏試劑檢測盒：康泰生物制品股份有限公司；其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

菌種保藏培養(yǎng)基（LB培養(yǎng)基）：蛋白胨10.0 g，酵母提取物5.0 g，氯化鈉5.0 g，瓊脂15.0 g，水1 L，pH7.2。

產(chǎn)酶培養(yǎng)基：麥芽糖20.0 g，蛋白胨5.0 g，牛肉膏2.0 g，K2HPO41.0 g，NaH2PO41.0 g，MgSO4·7H2O 1.0 g，水1 L，pH7.2。

1.2 儀器與設備

Phenom G2 Pure飛納臺式掃面電鏡：美國FEI公司；BH-2熒光相差顯微鏡：日本Olympus公司；6850 N型氣相色譜系統(tǒng)：美國Agilent科技公司；T6新世紀紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；GF254硅膠板、薄層層析缸（10 cm×10 cm）：青島海洋化工有限公司；T-GradientThermoblock型聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增儀：德國Biometra公司；DYY-6C核酸電泳儀：北京六一儀器廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌株的篩選分離方法

將從昆明磷礦廠采集的樣品研磨過篩后，稱取1 g樣品稀釋10-3、10-4、10-5倍后涂布于LB培養(yǎng)基平板，30℃恒溫培養(yǎng)觀察菌落生長情況。待生長穩(wěn)定后，分別挑取平板內(nèi)可見菌落并對其編號。采用平板劃線法純化菌落至獲得形態(tài)一致的純菌株若干種。

純菌株分別轉(zhuǎn)接入發(fā)酵培養(yǎng)基，30℃、160 r/min培養(yǎng)48 h，發(fā)酵結(jié)束后6 000 r/min離心收集菌體，菌體加入適量溶菌酶破壁振蕩收集粗酶液，并向其中加同體積10%麥芽糖溶液混合，160 r/min、15 h酶解，10 000 r/min離心收集上清，薄層層析定性分析上清液中的糖成分，挑選并標記上清液中含有海藻糖的菌株。

1.3.2 菌株的海藻糖合酶TreS途徑驗證

含有海藻糖的菌株發(fā)酵粗酶液中分別加同體積5%麥芽糖溶液、5%葡萄糖溶液及ddH2O三種溶液進行酶解試驗，薄層層析定性檢驗海藻糖合成途徑[7]。

1.3.3 菌株分類鑒定

（1）菌株形態(tài)學及生理生化特性

菌株形態(tài)學及生理生化特性：采用革蘭氏染色法對菌體細胞染色并借助差相顯微鏡觀察菌體形態(tài)。參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[8]對菌株展開甲基紅試驗、乙酰甲基甲醇試驗（V-P試驗）、硫化氫產(chǎn)生試驗、明膠液化試驗、淀粉水解試驗、硝酸鹽還原試驗、碳源利用試驗和藥敏測試等各種生理生化特性檢測。

（2）菌株胞內(nèi)脂肪酸和醌類組分檢測

以氯仿∶甲醇∶鹽酸=1∶10∶1（V/V）作為提取液與菌體混合反應1 h，用正己烷萃取脂肪酸甲酯，將萃取液進行氣相色譜分析，檢測菌株胞內(nèi)脂肪酸組成[9]；通過液相色譜檢測菌株細胞中的醌類成分[10]。

16S rRNA序列擴增及測序：提取待測菌株全基因組DNA并以其為模板，以細菌通用引物F27/R1492進行聚合酶鏈式反應擴增16S rRNA基因片段。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析無誤后交至上海生工生物進行序列檢測。測序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫和EzTaxon-e數(shù)據(jù)庫中的16S rRNA基因序列比對，根據(jù)同源性高低列出相近序列及其所屬種或?qū)佟?/p>

（3）DNA（G+C）mol%含量檢測

采用熱變性溫度測定法檢測待測菌株基因組DNA的（G+C）mol%，以大腸桿菌K12的Tm測定值為參照。根據(jù)變性過程中各溫度和對應的相對吸光度值繪制成DNA熱變性曲線，DNA相對吸光度的中點值所對應的溫度即為Tm值；所測Tm值帶入特定公式計算細胞染色體DNA的（G+C）mol%含量[11]。

（4）DNA-DNA雜交試驗

采用十六烷基三甲基溴化銨法（hexadecyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）混合抽提菌體DNA，制樣。參照公式（Tor=47.0+0.51×（G+C）%）測定DNA最適復變溫度（Tor），按公式計算待測菌株與模式菌株KMM1447T、ATCC17588T間的同源性，公式如下：

式中：Va、Vb為不同的DNA樣品每分鐘吸光值的減少值，△A/min；Vm為混合樣品每分鐘吸光值的減少值，△A/min。

（5）系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

采用DNAStar軟件包中的MegAlign程序計算樣本間的遺傳距離。由GenBank中得到相關菌株序列，與本研究分離菌株所測序列一起輸入ClusTalx1.8程序進行DNA同源序列排列[12]，以鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，1 000次重復取樣進行穩(wěn)定性驗證。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離、篩選及海藻糖生成定性檢測

將從昆明磷礦廠采集的樣品研磨過篩后，通過稀釋平板劃線法最終純化篩選出二十余株純菌株，純菌株轉(zhuǎn)接入發(fā)酵培養(yǎng)基，溶菌酶破壁提取粗酶液，薄層層析定性分析酶反應上清液中含有海藻糖的菌株，最終篩選出一株菌株，將其命名為BIE-1，其薄層層析結(jié)果如圖1所示。

圖1 菌株BIE-1產(chǎn)海藻糖薄層層析色譜圖Fig.1 TLC chromatogram of trehalose produced by strain BIE-1

2.2 菌株BIE-1海藻糖合酶TreS途徑驗證

將菌株BIE-1粗酶液分別與5%葡萄糖、5%麥芽糖以及ddH2O混合反應，其結(jié)果見表1。

表1 菌株BIE-1不同底物反應體系的薄層層析定性分析Table 1 TLC qualitative analysis of strain BIE-1 in different substrates reaction system

由表1可知，該菌株可利用麥芽糖生成海藻糖，是一株通過海藻糖合酶（TreS）途徑生產(chǎn)海藻糖的菌種。將該菌株于-80℃凍存并進行物種鑒定。

2.3 菌株BIE-1的分類鑒定

2.3.1 菌株BIE-1形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察

顯微觀察結(jié)果（圖2）發(fā)現(xiàn)，菌株BIE-1是革蘭氏陰性菌、無色、桿狀、有一個極性鞭毛。菌落直徑大小0.6～0.8μm，長度1.4～2.0 μm；胞內(nèi)沒有聚-β-羥丁酸（poly-β-hydroxybutyrate，PHB）包含體。培養(yǎng)2 d后，菌落呈圓環(huán)狀，不透明且有淡黃色的放射狀褶皺。

圖2 菌株BIE-1透射電鏡顯微圖Fig.2 Transmission electron micrographs of strain BIE-1

2.3.2 菌株BIE-1生理生化特性

菌株BIE-1與模式菌株黃色海假單胞菌KMM1447T、施氏假單胞菌ATCC17588T和78-123T[13]3株假單胞菌理化特性比較見表2。

由表2可知，菌株BIE-1好氧，最佳生長溫度為30℃，生長溫度區(qū)間4～42℃；最適pH為7.0，可適應pH區(qū)間為5.0～9.0；耐鹽濃度范圍0～6%。其常規(guī)檢測結(jié)果表明，明膠液化試驗、甲基紅試驗、V-P試驗、硫化氫產(chǎn)生試驗為陰性反應；淀粉水解試驗和硝酸鹽還原試驗為陽性反應。API-ZYM試劑條及碳源利用試驗共同檢測菌株BIE-1可利用碳源有D-葡萄糖、甘露糖、甘露醇、D-麥芽糖、丙三醇、乙醇、L-脯氨酸、L-丙氨酸、L-精氨酸、L-亮氨酸、L-天冬酰胺和蘋果酸等12種；擴散法檢測BIE-1藥敏性發(fā)現(xiàn)該菌株受到標準濃度下氯霉素、紅霉素、青霉素、利福平、萬古霉素、新霉素、桿菌肽、新生霉素、諾氟沙星和環(huán)丙沙星抗生素等10種抗生素抑制，但會對卡那霉素產(chǎn)生抗性。表2比較結(jié)果顯示，菌株BIE-1與3株假單胞菌模式菌株理化特性相近。

表2 菌株BIE-1與近緣屬假單胞菌的理化特性比較Table 2 Comparison of physicochemical properties of strain BIE-1 and strains closely related speciesPseudomonassp.

2.3.3 菌株BIE-1胞內(nèi)脂肪酸和醌類成分檢測

提取菌株BIE-1胞內(nèi)脂肪酸，將脂肪酸皂化、甲基化后進行成分鑒定。菌株BIE-1和三株模式菌種胞內(nèi)脂肪酸不同成分的含量比較見表3，由表3可知，脂肪酸含量在10%以上的有C18：1ω7c（30.5%）、C16：0（23.6%）及C16：1ω7c/C16：1ω6c（20.5%），最主要的羥基脂肪酸是C12：03-OH（3.6%）。黃色海假單胞菌KMM1447T、施氏假單胞菌ATCC17588T和78-123T的這3種脂肪酸含量也均在10%以上。而泛醌類成員輔酶Q-9則為該菌株胞內(nèi)主要的醌類成分，經(jīng)檢測菌株BIE-1與假單胞菌屬三株模式菌種均含有輔酶Q-9，推測菌株BIE-1應為假單胞菌屬菌種。

表3 菌株BIE-1與近緣屬假單胞菌的胞內(nèi)脂肪酸成分及含量比較Table 3 Comparison of intra cellular fatty acids compositions and contents of strain BIE-1 and its closely related species Pseudomonassp.%

2.3.4 菌株BIE-1 DNA的（G+C）mol%

以大腸桿菌K-12的（G+C）mol%含量（51.2%）為參照，由公式計算出菌株BIE-1染色體DNA中的（G+C）mol%含量為60.3%。已知的黃色假單胞菌KMM1447T（G+C）mol%含量為59.1%，施氏假單胞菌ATCC17588T（G+C）mol%含量為61%～66%，待測菌株與二者相比，（G+C）mol%含量差別依次為1.2%、0.7%～5.7%，均低于10%，可確定待測菌株為同屬假單胞菌。

2.3.5 菌株BIE-1與菌株KMM1447T、菌株ATCC17588T的

DNA-DNA雜交試驗

在一個配有溫控設備的Beckman DU 800分光光度計中進行DNA-DNA雜交試驗。結(jié)果顯示，菌株BIE-1與黃色假單胞菌KMM1447T進行DNA-DNA雜交后，二者關聯(lián)度為（34.18±0.82）%；與施氏假單胞菌ATCC17588T的關聯(lián)度為（38.92±3.44）%。菌株BIE-1與以上兩菌株的DNA同源性小于70%，說明待測菌株是與二者不同種的新菌株。

2.3.6 16S rRNA序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹中菌株BIE-1與近緣種間的位置關系，結(jié)果見圖3。

菌株BIE-1的16S rRNA基因序列全長1 498 bp。將該序列與已公布序列比較，發(fā)現(xiàn)該菌株雖然屬于假單胞菌屬，但與該屬其他菌株在16S rRNA基因序列上出現(xiàn)明顯差異。其中，待測菌株與黃色假單胞菌KMM1447T的16S rRNA基因序列相似性最高，為98.9%；與施氏假單胞菌ATCC17588T的相似性為98.06%。由16SrRNA基因序列的相似性關系可知該菌株確為假單胞菌屬成員。綜合多項分類鑒定分析，認定該菌株BIE-1為假單胞菌屬（Pseudomonassp.）中的一種。

圖3 菌株BIE-1的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain BIE-1

3 結(jié)論與展望

對從云南昆明采集磷礦石樣品分離出一株產(chǎn)海藻糖合酶的真細菌進行物種鑒定，顯微觀察發(fā)現(xiàn)該菌株為革蘭氏陰性菌，無色、桿狀，有一個極性鞭毛，直徑約0.6～0.8 μm，長度約1.4～2.0 μm；體內(nèi)沒有聚-β-羥丁酸（PHB）包含體，培養(yǎng)兩天后，菌落呈圓環(huán)狀、不透明且有淡黃色的放射狀褶皺，該菌株經(jīng)16S rRNA序列比對、DNA（G+C）mol%和DNA-DNA雜交等分子生物學技術(shù)以及生理生化特性檢測后，認定該菌株為假單胞菌屬（Pseudomonassp.）一種，將其命名為BIE-1。

有關假單胞菌產(chǎn)海藻糖的研究大多見于海洋假單胞菌和惡臭假單胞菌兩大菌株[14-18]，稀缺的菌種資源限制了海藻糖的多樣高產(chǎn)研發(fā)。菌株BIE-1的發(fā)現(xiàn)有利于增加產(chǎn)海藻糖假單胞菌的多樣性，便于從中比較挑選出高產(chǎn)、高轉(zhuǎn)化率以及轉(zhuǎn)化性能穩(wěn)定的優(yōu)良菌株。將麥芽糖通過分子內(nèi)結(jié)構(gòu)異位轉(zhuǎn)為海藻糖的海藻糖合酶（TreS）途徑已使假單胞菌成為眾多產(chǎn)海藻糖微生物中的優(yōu)勢菌種，麥芽糖轉(zhuǎn)化率可達80%以上，其潛在的商業(yè)價值隨著利用真細菌生產(chǎn)海藻糖的大規(guī)模生產(chǎn)而日益顯現(xiàn)。

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Screening and identification of trehalose synthase-producingPseudomonassp.

WANG Yiwen1,2,QUAN Shujing2,MA Huan2,CHEN Guocan1,LIU Dehai1*
(1.Institute of Biology Co.,Ltd.,Henan Academy of Science,Zhengzhou 450008,China; 2.Henan Engineering Research Center of Industrial Enzymes,Zhengzhou 450008,China)

A eubacterium was isolated from ground phosphate rock in Kunming,the detection results of thin layer chromatography(TLC)showed that the strain crude enzyme liquid could iosmerize maltose heterogeneous into trehalose.Through microscopic observation,the strain was gram-negative bacterium,colourless,rod-shaped,with a flagellum,0.6-0.8 μm in diameter and about 1.4-2.0 μm in length.No accumulation of poly-β-hydroxybutyrate(PHB)granules as inclusion bodies was observed.The optimal growth temperature of the strain was 30℃and the optimal pH was 7.0.The strain was identified asPseudomonassp.and named BIE-1 by biological techniques(including 16S rRNA sequence analysis,DNA(G+C)mol%, DNA-DNA hybridization,etc.)and physiological-biochemical characteristic.It increased the species diversity ofPseudomonassp.,which provided new choice for the trehalose biosynthesis by eubacteria.

Pseudomonassp.;16S rRNA;DNA-DNA hybridization;thin layer chromatography;trehalose

Q785

0254-5071（2017）04-0058-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.04.013

2017-01-09

2015年河南省科技創(chuàng)新杰出人才項目（154200510025）

王一雯（1989-），女，碩士，研究方向為酶工程。

*通訊作者：劉德海（1970-），男，研究員，本科，研究方向為酶工程。