楊玉新，韋鵬，李丹，楊婕，宋振*

（新疆中亞食品研發(fā)中心有限公司，新疆烏魯木齊830000）

新疆特色食品中優(yōu)良乳酸菌的篩選及分離鑒定

楊玉新，韋鵬，李丹，楊婕，宋振*

（新疆中亞食品研發(fā)中心有限公司，新疆烏魯木齊830000）

該研究利用傳統(tǒng)培養(yǎng)法從自然發(fā)酵的新疆特色食品中分離篩選出3株菌，通過菌株形態(tài)觀察、生理生化試驗(yàn)及16S rDNA序列分析對菌株進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明，菌株L-6、L-7和L-8分別被鑒定為腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）及短乳桿菌（Lactobacillus brevis）。產(chǎn)酸試驗(yàn)結(jié)果表明，這3株菌均具有較強(qiáng)的產(chǎn)酸能力，發(fā)酵12 h后發(fā)酵液pH值可達(dá)4.0以下，其中菌株L-7產(chǎn)酸能力最強(qiáng)，在15 h后其發(fā)酵液pH值在3.5以下，可用于辣椒醬或其他發(fā)酵食品發(fā)酵劑的研制。

新疆特色制品；乳酸菌；篩選；鑒定

乳酸菌是人類和動(dòng)物胃腸道內(nèi)的優(yōu)勢菌群，在機(jī)體的正常代謝與健康狀態(tài)的保持方面發(fā)揮著很大的作用，因其良好的益生性能在乳制品加工、發(fā)酵果蔬加工、釀造工業(yè)等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[1-3]。乳酸菌除了具有良好的益生性外，還具有優(yōu)良的發(fā)酵性能[4]，篩選優(yōu)良乳酸菌，并進(jìn)行發(fā)酵劑研究與開發(fā)，為世界各國所重視[5]。

新疆有著豐富的傳統(tǒng)發(fā)酵食品資源，如駱駝酸乳、馬奶、奶酪、自然發(fā)酵辣椒醬等獨(dú)特的民族特色傳統(tǒng)發(fā)酵制品，這些制品中含有豐富的乳酸菌[6]。采用純種菌株定向發(fā)酵替代自然發(fā)酵，能夠有效控制風(fēng)味品質(zhì)的穩(wěn)定性[7]，縮短發(fā)酵時(shí)間，從而實(shí)現(xiàn)以辣椒醬為代表的發(fā)酵果蔬工業(yè)化、規(guī)?；?、標(biāo)準(zhǔn)化發(fā)展。

新疆傳統(tǒng)的辣椒醬多采用自然發(fā)酵方式生產(chǎn)，自然發(fā)酵的菌種繁雜，其中的微生物存在復(fù)雜的互生、共生、拮抗等關(guān)系，在發(fā)酵過程中協(xié)調(diào)作用產(chǎn)生豐富的有益物質(zhì)，但由于自然發(fā)酵時(shí)間長，發(fā)酵過程難控制[5]，導(dǎo)致生產(chǎn)過程中勞動(dòng)強(qiáng)度大，衛(wèi)生條件差，自動(dòng)化水平低，產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定，生產(chǎn)效率低。

本研究以新疆少數(shù)民族的傳統(tǒng)食品為研究對象，采用菌株形態(tài)學(xué)、生理生化試驗(yàn)及16S rDNA序列分析相結(jié)合的方法[8]對分離出的產(chǎn)酸能力強(qiáng)的優(yōu)良乳酸菌進(jìn)行鑒定，以期為乳酸菌在發(fā)酵辣椒醬中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

駱駝酸乳、馬奶、自然發(fā)酵辣椒醬：新疆烏魯木齊南山農(nóng)牧民家；MRS培養(yǎng)基、MRS肉湯培養(yǎng)基、革蘭氏染色試劑盒：北京陸橋技術(shù)有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒：美國OMEGA公司；TaqDNA聚合酶、脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleosidetriphosphate，dNTP）、DL2000Marker：天為時(shí)代生物有限公司；碳酸鈣（CaCO3）：西安裕華生物科技有限公司；過氧化氫：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；其他化學(xué)藥品均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

OlympusBH-2光學(xué)顯微鏡：奧林巴斯有限公司；FE20pH計(jì)：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；UV-7200紫外分光光度計(jì)：尤尼科（上海）儀器有限公司；T-Gradient溫度梯度聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀：德國Biometra公司；BHG-8082型恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌的分離純化

取駱駝酸乳、馬奶和辣椒醬樣品各25 g于225 mL無菌生理鹽水中，充分混勻后，梯度稀釋成10-1、……、10-6濃度的樣液，分別取不同梯度稀釋樣液100μL涂布于含有2%CaCO3MRS培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)48 h。挑取單個(gè)、生長較快、有溶鈣圈的菌落，接種于MRS培養(yǎng)基中，重復(fù)分離純化6次[9]，取純化后典型菌落進(jìn)行革蘭氏染色、過氧化氫酶試驗(yàn)[10]，并進(jìn)行油鏡鏡檢，取革蘭氏染色陽性、過氧化氫酶試驗(yàn)陰性的菌株接種于MRS肉湯培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)24 h，將菌株進(jìn)行編號，轉(zhuǎn)接到甘油管中-80℃保存。

1.3.2 菌株形態(tài)學(xué)鑒定

挑取純化后的菌落進(jìn)行革蘭氏染色和過氧化氫酶接觸試驗(yàn)。革蘭氏染色陽性且過氧化氫酶陰性者初步判斷為乳酸菌[11]，觀察菌落形態(tài)，通過革蘭氏染色鏡檢圖片記錄記錄菌落大小、顏色、凹凸等情況，在光學(xué)顯微鏡觀察菌體形態(tài)特征。

1.3.3 菌種產(chǎn)酸量的測定

將分離菌株按5%的接種量接種于MRS肉湯培養(yǎng)基中，37℃、3 000 r/min搖床培養(yǎng)，每隔3 h檢測一次各菌株發(fā)酵液的pH值，以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，菌株發(fā)酵液pH值為縱坐標(biāo)繪制產(chǎn)酸速率曲線[12]。

1.3.4 生理生化特性鑒定

分離菌株的硝酸鹽還原、吲哚、精氨酸水解、葡萄糖產(chǎn)酸、明膠液化等生理生化試驗(yàn)均參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[13]中的方法進(jìn)行鑒定。

1.3.5 菌株的16S rDNA序列分析

使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取分離菌株的基因組DNA。16S rDNA擴(kuò)增引物采用細(xì)菌通用引物：正向引物為5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，反向引物為5'-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3'。PCR擴(kuò)增體系為：10×Buffer 0.5μL，正向引物2μL，反向引物2μL，模板4μL，三磷酸脫氧核糖核苷（dNTP）MIX 2 μL，聚合酶0.3 μL，補(bǔ)充去離子水至50μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min，94℃變性50s，52℃退火50s，72℃延伸50s，33個(gè)循環(huán)，72℃延伸17 min。PCR產(chǎn)物的核苷酸序列測定按試劑盒說明書進(jìn)行。擴(kuò)增反應(yīng)完畢后，取PCR產(chǎn)物與6×Loading Buffer混合加樣，1.0%的瓊脂糖凝膠點(diǎn)樣孔中，上機(jī)電泳，電泳液為0.5×TBE，溴化乙錠（ethidium bromide，EB）染色30 min，電泳結(jié)束后將膠板置于凝膠成像系統(tǒng)中觀察。若PCR擴(kuò)增成功，則會(huì)在1 500 bp處見到條帶并拍照。

系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建[14]：將得到PCR產(chǎn)物交由中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院進(jìn)行測序，測序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對分析，以確定其與模式菌種的同源關(guān)系。確定并下載各模式菌種的有效序列后，采用ClustalX1.83進(jìn)行多序列比對后，使用MEGA 5.0軟件中的鄰接法（Neighbor-joining）進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，進(jìn)行1 000次的相似度重復(fù)計(jì)算，發(fā)育樹節(jié)點(diǎn)只顯示Bootstrap值＞50%數(shù)值。

2 結(jié)果與分析

2.1 新疆特色食品中乳酸菌的篩選及產(chǎn)酸速率的測定

從駱駝酸乳、馬奶、辣椒醬樣品中共分離出9株乳酸菌，其革蘭氏染色陽性、過氧化氫酶試驗(yàn)陰性，符合乳酸菌的特征。從MRS培養(yǎng)基上挑取9個(gè)有溶鈣圈且外觀不同的菌落，分別命名為菌株L-1～L-9。

產(chǎn)酸速率與產(chǎn)酸量是篩選優(yōu)良乳酸菌的重要指標(biāo)，本試驗(yàn)對新疆自然發(fā)酵食品中篩選出的乳酸菌的產(chǎn)酸特性進(jìn)行研究，9株分離菌株產(chǎn)酸速率曲線如圖1所示。

圖19 株菌產(chǎn)酸速率曲線Fig.1 Acid-producing speed curves of nine strains

由圖1可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，9株菌發(fā)酵液的pH值均呈逐漸下降趨勢，其中0～12h降低幅度最大，發(fā)酵12 h時(shí)發(fā)酵液pH值即可達(dá)到3.6～5.0，繼續(xù)發(fā)酵，發(fā)酵液pH值下降減緩。其中菌株L-6、L-7、L-8發(fā)酵液pH值在12 h后均下降至4.0以下，15 h后，菌株L-7、L-8pH值分別達(dá)到3.5、3.7，其中菌株L-7產(chǎn)酸能力最強(qiáng)。因此，選擇對菌株L-6、L-7和L-8進(jìn)行后續(xù)研究。

2.2 形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果

將菌株L-6、L-7和L-8接種于MRS培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)48 h，進(jìn)行菌株的形態(tài)學(xué)鑒定，結(jié)果見圖2。

由圖2可知，菌株L-6菌落呈白色、圓形、表面光滑、不透明、邊緣整齊，菌體成球形或橢球型，呈短鏈或長鏈排列。菌株L-7菌落呈白色、近圓形、表面光滑、不透明、邊緣整齊，菌體成桿狀，成對或成鏈排列。菌株L-8菌落呈白色、近圓形、表面光滑、不透明、邊緣整齊，菌體成短桿狀，成對或成堆排列。

圖2 菌株L-6、L-7和L-8的菌落特征（A）和菌株形態(tài)（B）Fig.2 Colony characteristics(A)and strain morphology(B)of strains L-6,L-7 and L-8

2.3 生理生化特性鑒定結(jié)果

菌株L-6、L-7和L-8生理生化鑒定結(jié)果見表1。

表1 菌株L-6、L-7、L-8生理生化試驗(yàn)鑒定結(jié)果Table 1 Identification results of physiological and biochemical experiments of strains L-6,L-7 and L-8

由表1可知，菌株L-7可以利用葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)酸不產(chǎn)生氣體、不產(chǎn)生吲哚、不液化明膠、不還原硝酸鹽、分解精氨酸不產(chǎn)生氨氣。菌株L-6、L-8同樣可以利用葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)酸同時(shí)產(chǎn)生氣體、不產(chǎn)生吲哚、不液化明膠、不還原硝酸鹽、分解精氨酸不產(chǎn)生氨氣。通過與標(biāo)準(zhǔn)菌株的生化特性對比發(fā)現(xiàn)[15]，菌株L-7屬于同型發(fā)酵乳酸桿菌，其特性與植物乳酸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株試驗(yàn)結(jié)果一致。菌株L-6、L-8屬于異型發(fā)酵乳酸桿菌，其特性與腸膜明串珠菌、短乳桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株試驗(yàn)結(jié)果一致。

2.4 菌株16SrDNA基因序列測定結(jié)果及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

將篩選的3株菌L-6、L-7和L-8的基因組DNA提取后進(jìn)行目的片段擴(kuò)增，對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果見圖3。

圖3 分離菌株16S rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.3 Agarose gel electrophoresis of 16S rDNA PCR amplification products of isolated strains

由圖3可知，3株菌經(jīng)PCR擴(kuò)增后，在1 500 bp處均出現(xiàn)特異性條帶，與預(yù)期片段大小一致，說明擴(kuò)增成功，而且條帶比較純，不用再純化。利用Blast程序與GenBank中已登錄的基因序列進(jìn)行對比，獲得已定名的與之相似的屬、種的相關(guān)信息。采用MEGA 5.0軟件中的鄰接法構(gòu)建發(fā)育樹和同源性分析結(jié)果見圖4。

圖4 分離菌株16S rDNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of 16S rDNA gene sequences of isolated strains

由圖4可知，3株菌株的16S rDNA序列擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列與Genebank中序列比對，同源性均＞99%。因此L-8與短乳桿菌（Lactobacillus brevis）AB548884.1的相似度為99%；菌株L-7與植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）的親緣關(guān)系比其他菌株近，菌株L-6與腸膜明串珠菌（Lactobacillus mesenteroides）M23035具有較高的同源性。結(jié)合菌株的菌落形態(tài)、生理生化特性及16S rDNA序列分析，確定菌株L-6、L-7和L-8分別被鑒定為腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、短乳桿菌（Lactobacillus brevis）。

3 結(jié)論

本研究從自然發(fā)酵駱駝酸乳、馬奶、自然發(fā)酵辣椒醬中分離得到了3株高產(chǎn)酸菌株，并采用形態(tài)學(xué)、生理生化特性和16S rDNA序列分析對其進(jìn)行鑒定。菌株L-6、L-7和L-8分別被鑒定為腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）、植物乳桿菌（Lactobacillusplantarum）、短乳桿菌（Lactobacil lusbrevis）。產(chǎn)酸試驗(yàn)結(jié)果表明，這3株菌均具有較強(qiáng)的產(chǎn)酸能力，發(fā)酵12 h后發(fā)酵液pH值可達(dá)4.0以下，其中菌株L-7產(chǎn)酸能力最強(qiáng)，在15 h后其發(fā)酵液pH值在3.5以下，符合乳酸菌劑的篩選標(biāo)準(zhǔn)，為乳酸菌在果蔬發(fā)酵中的應(yīng)用奠定了菌種基礎(chǔ)，對新疆乳酸菌資源的收集和積累具有重要意義。參考文獻(xiàn)：

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Selection,isolation and identification of lactic acid bacteria from Xinjiang speciality foods

YANG Yuxin,WEI Peng,LI Dan,YANG Jie,SONG Zhen*
(Xinjiang Central Asia Food Research and Development Centre,Urumqi 830000,China)

Three strains were isolated and screened from naturally fermented foods in Xinjiang foods by traditional culture method,and were identified by strain morphological,physiological and biochemical experiments and 16S rDNA sequence analysis.The results showed that strains L-6,L-7 and L-8 were identified asLeuconostoc mesenteroides,Lactobacillus plantarumandLactobacillus brevis.The results of acid-producing experiments showed that three strains all had stronger acid-producing ability.After fermentation of 12 h,the pH value of fermentation liquid was less than 4.0. The acid-producing ability of strain L-7 was the strongest and the pH value of its fermentation liquid was less than 3.5 after fermentation for 15 h. Strain L-7 could be used for development and preparation of leavening agents of chilli sauce or other fermented foods.

Xinjiang speciality foods;lactic acid bacteria;selection;identification

TS201.3

0254-5071（2017）04-0050-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.04.011

2016-12-27

新疆維吾爾自治區(qū)科技支疆項(xiàng)目（NO.2016E02021）

楊玉新（1968-），男，高級工程師，碩士，研究方向?yàn)槭称芳庸ぁ?/p>

*通訊作者：宋振（1990-），女，工程師，碩士，研究方向?yàn)槭称饭こ獭?/p>