樊克鋒，湯法銀，趙建平，王長林，孫素琴

(1河南牧業(yè)經(jīng)濟學院, 鄭州 450000,2清華大學, 北京 100084)

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紅外光譜技術(shù)對生地黃整體評價

樊克鋒1，湯法銀1，趙建平1，王長林1，孫素琴2

(1河南牧業(yè)經(jīng)濟學院, 鄭州 450000,2清華大學, 北京 100084)

為對中藥材進行整體化學信息表征，針對中藥化學成分的整體多樣性，紅外光譜特征具有化學信息整體全面性的特點，采用紅外光譜技術(shù)結(jié)合HPLC對生地黃進行較為全面的整體分析，把生地黃生態(tài)、形態(tài)、化學及藥學等特征和變化規(guī)律作了整體相關(guān)性討論和量化分析，對生地黃整體質(zhì)量評價具有重要意義。

紅外光譜；生地黃；整體分析；相關(guān)峰值比

地黃是最常用中藥之一，系玄參科植物地黃(RehmanniaglutinosaLibosch.)干燥根莖。本品因加工炮制不同，分為鮮地黃、生地黃和熟地黃。鮮地，偏寒，清熱生津；生地，用以涼血止血；熟地，則偏于滋補陰血。地黃主產(chǎn)于河南，山西、河北等地也有栽培。而產(chǎn)于河南武陟、溫縣等地(舊懷慶府)的地黃藥材，以其歷史悠久、加工考究、質(zhì)量上乘、療效確切等被列為著名的“四大懷藥”道地藥材之一。

紅外光譜技術(shù)分析復雜混合體系的中藥，其光譜特征具有化學信息整體綜合性特點與優(yōu)勢，其指紋性如同單一組分一樣，光譜中的峰位、峰形、峰強度代表著體系中所含相應(yīng)各種基團的譜峰，它反映的是混合體系中各種成分的疊加譜，不同混合體系其相應(yīng)的化學組成不同，會引起分子光譜整體譜圖的變化，因此便構(gòu)成譜圖的整體宏觀“指紋”性。憑借這些整體宏觀“指紋”特征，可以直接地或者借助數(shù)學處理進行中藥的鑒定與質(zhì)量評價。針對紅外光譜分析中藥復雜混合體系，清華大學孫素琴教授根據(jù)混合物紅外光譜整體宏觀特征建立了一系列針對性方法，即“多級紅外光譜宏觀指紋分析法”[1]，其原則為：從整體分析到特征分析，先定性分析再量化分析。具體指導方法：首先，不分離，即分析。即樣品無損、無化學處理，不破壞中藥化學成分的整體性。次之，邊分離，邊分析。依光譜特征進行特定波段(特征峰)及特定化學部位分析。再者，邊結(jié)合，邊分析。第一，結(jié)合《中華人民共和國藥典》[2]及其他文獻資料，把藥學特征數(shù)字化圖譜化(即“靠譜”)； 第二、結(jié)合其他如HPLC等方法進行分析，把中藥生物學特征、化學性質(zhì)及藥學特點等進行相關(guān)分析，做到宏觀整體定性分析和微觀化學指標定量分析相結(jié)合，相互佐證，綜合評價。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 自然陰干生地黃片 鮮地黃切片后置陰涼處室溫直接陰干，粉末呈灰白色。作參考樣品。

1.1.2 微波烘干生地黃片 鮮地黃切片后經(jīng)過“微波特殊”加工制備，粉末呈淡黃色，功效相當于鮮地黃，具有清熱生津、涼血、止血之功效，同時可以做茶煲、菜肴、罐頭等功能食品新開發(fā)用途。

1.1.3 蒸氣烘干生地黃 按照生地黃傳統(tǒng)產(chǎn)地加工方法(土炕焙干法：裝焙、看火候、翻焙、傳焙、打圓等多個環(huán)節(jié))通過改進給熱方式，利用熱蒸氣進行生地黃產(chǎn)地加工。

上述3樣品源均來自河南武陟飲片廠鮮地黃通貨。前兩者由河南中醫(yī)藥大學藥學院實驗室制備，后者由河南武陟飲片廠加工制備。

1.1.4 野生地黃 采集于河南沁陽神農(nóng)山百草坡，低溫烘干。

1.1.5 丹參及玄參飲片 購于北京同仁堂(鄭州藥店)。

以上5樣品均經(jīng)河南中醫(yī)藥大學生藥教研室鑒定；均低溫干燥、粉碎，過80目篩，備用。

1.1.6 地黃醚提物樣品制備 分別定量稱取生地黃和野生地黃粗粉樣品，10倍量石油醚(30～60)浸提過夜，過濾，回收溶劑，浸提物放置至石油醚完全揮發(fā)，分別得醚提物，稱量。備用。

1.1.7 水蘇糖 中國藥品生物制品檢定所。

1.2 方法

1.2.1 儀器設(shè)備 Spectrum GX型付里葉變換紅外光譜儀，DTGS檢測器(Perkin-Elmer)。

1.2.2 測試條件 測定范圍4000～400 cm-1，中紅外DTGS檢測器，OPD速度2 cm·s-1，增益為1，掃描信號累加16次，分辨率4 cm-1，實時扣除H2O和CO2。

1.2.3 紅外方法 KBr壓片法制樣，取過100目篩供試樣品粉末3 mg與200 mg溴化鉀(碎晶)混合研磨充分均勻，壓片測定。

1.2.4 色譜方法 參照《中華人民共和國藥典》(一部)地黃項下梓醇含量高效液相法測定[2]。色譜條件：ODSC18色譜柱，流動相乙腈-水(0.6∶99.4)；流速1 mL·min-1；檢測波長210 nm；柱溫25 ℃。

2 結(jié) 果

2.1 生地黃經(jīng)典紅外光譜分析

2.1.1 生地黃主體成分特征峰分析 首先從宏觀整體出發(fā)，“不分離，即分析”，分析生地黃主體成分紅外特征峰。生地黃是主成分為高水蘇糖類中藥[3]，主成分峰(1051 cm-1)為單強峰，形似“菩薩身”。也就是說生地黃是主成分為水蘇糖為主的低聚糖類中藥，其經(jīng)典紅外光譜主成分峰具“菩薩身”典型特征(圖1)。

圖1 生地黃整體紅外光譜及主成分“菩薩身”特征峰

2.1.2 中藥紅外光譜分類分析 中藥中往往含有多種分子結(jié)構(gòu)相近的化學成分，因其包含相同或相近的官能團而具有相似的紅外吸收特征。某一成分含量越高，其對應(yīng)吸收峰的紅外光譜特征也強。所以，可根據(jù)中藥的紅外光譜特征對其主成分或特征成分進行分類分析或特征分析。

圖2 菩薩身特征的中藥紅外分類法

如圖2所示，根據(jù)主成分峰似“菩薩身”紅外整體特征，常見中藥如生地黃、玄參、黃精、玉竹、丹參、天冬、麥冬、巴戟天等，這些中藥的主體成分都是以多糖類化合物為主。盡管這些中藥具有相似的主體“菩薩身”特征峰，但圖譜還有其他特征差異，如圖2所示，丹參、生地和玄參經(jīng)典紅外光譜很相似，但其1635和1412 cm-1等峰位和相對峰強還有明顯差異。為了提高差異性，也可通過二階導數(shù)譜和二維相關(guān)譜進行鑒定和分析[4-10]。

2.2 生地黃紅外光譜特征峰或特定化學部位分析 在“不分離，即分析”的基礎(chǔ)上，根據(jù)光譜特征及分析需要進行特定波段或特定化學部位的“邊分離，邊分析”。

如圖3所示，通過圖譜選點(1632 cm-1)歸一化處理，能夠明顯分辨野生和栽培生地黃主成分“菩薩身”單強峰(1051 cm-1)相對強度有差異。再者是特征峰(1710 cm-1)有明顯差異，即野生地黃有明顯的1710 cm-1特征峰，而栽培生地黃略顯特征，由此判斷野生地黃較栽培含有較高油脂類成分。試驗測定其醚提物含量：野生地1.2%、栽培生地0.4%，符合紅外光譜1710 cm-1特征峰表征。

同時，分別對野生和栽培生地黃二者醚提物進行紅外分析，結(jié)果如圖4所示，二者均有很強的-CH2-伸縮振動吸收峰如2925、2854 cm-1，有較強的-CH2-彎曲振動吸收峰如1464、1377 cm-1，且都有一個中等強度吸收峰722 cm-1，說明二者醚提部位中-(CH2)n-亞甲基鏈較長(n≧4)；由寬強峰3410或3433 cm-1、中強峰1713或1740 cm-1C=O吸收以及1275和1168 cm-1-COOH彎曲振動吸收雙峰可以推斷二者醚提部位成分中均有-COOH基團，從而推知二者醚提部位主要是長鏈脂肪酸。

圖3 野生和栽培生地黃選點(1632 cm-1)歸一化紅外特征光譜

圖4 野生和栽培生地黃醚提部位紅外光譜

2.3 紅外光譜對生地黃產(chǎn)地加工整體分析

2.3.1 生地黃多因素綜合相關(guān)性評價分析 生地黃質(zhì)量不僅受到生態(tài)環(huán)境影響，其不同加工方法和加工程度對生地黃質(zhì)量也有影響。

對于(自然陰干、微波烘干和蒸氣烘干)三個不同加工的生地黃樣品，分別對其進行整體紅外光譜分析和梓醇的HPLC分析，結(jié)合粉末顏色特征變化及藥典描述，結(jié)果如圖5-圖7及表2所示，三者加工方法和加工程度不一樣，其粉末顏色、主成分峰相對強度及梓醇含量都不一樣，但具有良好的相關(guān)性。

圖5 自然陰干、微波烘干和蒸氣烘干生地黃粉末顏色

圖6 自然陰干、微波烘干和蒸氣烘干生地黃選點(1632 cm-1)歸一化紅外光譜

圖7 生地黃紅外光譜主成分峰-1和參比峰-2歸一化處理圖譜

加工方法加工程度粉末顏色菩薩身段梓醇含量《中國藥典》中生地黃性狀特征描述自然陰干自然態(tài)灰白瘦高3.98%微波加熱輕加工淡黃微胖3.06%蒸氣烘干深加工棕黃肥胖2.49%表面棕灰色,斷面棕黑或烏黑色,有光澤,具黏性。氣微,味微甜。粉末深棕色,有橙黃色或橙紅色油滴狀物。梓醇≥0.20%。

如表2所示，三樣品相比較加工程度加深，粉末顏色也由“灰白-淡黃-棕黃”加深，菩薩身段也由“瘦高-微胖-肥胖”，三因素呈正相關(guān)。而梓醇含量是由高到低，與前因素呈負相關(guān)。所以，利用這種正負相關(guān)性多因素綜合評價生地黃質(zhì)量比用指標成分(梓醇)評價更加客觀。嚴格來說，《藥典》 單純規(guī)定梓醇含量不低于0.2%是不客觀的評價指標。

2.3.2 生地黃產(chǎn)地加工程度量化分析 為了避免樣品用量、光程長度等因素導致的單一特征“菩薩峰”光譜強度差異的影響，需要選擇相關(guān)吸收峰做為參比峰，其二者確定的相關(guān)峰值比(峰面積比A1/A2或比峰高H1/H2)是可信的量化指標。如圖7所示，對三樣品紅外光譜分別基線校正及歸一化處理，即：基線校正后以O(shè)點為最低基點進行歸一化處理，其水平基線分別與樣品紅外光譜交與P、R兩點，另選主成分峰光譜特征點引豎直垂線交與水平基線于Q點，分別選定QR波段和OP波段做為主成分峰-1和參比峰-2，若設(shè)其峰面積分別為A1和A2，則A1/A2表示為“相關(guān)峰值比”。用“相關(guān)峰值比(A1/A2)”來量化表征生地黃加工過程中主成分“菩薩峰”的變化趨勢和變化程度，則得到如表3量化值。

表3 生地黃不同加工方法和加工程度相關(guān)因素量化分析表

由表3可知，(自然陰干、微波烘干和蒸氣烘干)三個不同批次加工的生地黃樣品，不同的加工方法其加工程度不同。加工程度越深，相關(guān)峰值比(A1/A2)越小，主成分 “菩薩身”特征峰身段越胖，而梓醇含量越低；從平均A1/A2值和標準偏差結(jié)果來看，不同加工方法差異顯著，而不同加工批次差異微小，表明其結(jié)果具有較高的可信度。即利用“相關(guān)峰值比”評價生地黃產(chǎn)地加工程度具有“整體客觀性和標準量化性”特點，相比用一個或幾個指標成分更可靠可行。

3 討 論

3.1 紅外光譜對生地黃整體質(zhì)量評價的意義 對于中藥來說，大多都會受到諸如生態(tài)環(huán)境、種植采收、產(chǎn)地加工等多種因素影響，因而其中藥化學成分也極其復雜，不僅是“整體多樣性”，同時也具“個體差異性”；再者還要受炮制加工、復方組合、制劑工藝、研究水平等因素影響，進而還存在或產(chǎn)生不少“灰色未知性”。所以單靠一個或幾個指標成分(尤其非專屬性指標成分)是無法全面客觀真實表征中藥整體內(nèi)在質(zhì)量的。

對于地黃來說，其產(chǎn)地加工的方法技術(shù)和工藝水平是影響其內(nèi)在質(zhì)量的一個重要因素，而單用指標成分梓醇或毛蕊花糖苷是無法客觀整體評價生地黃的質(zhì)量品質(zhì)。試驗利用紅外光譜技術(shù)結(jié)合HPLC分析方法，“從整體到特定，先定性再定量”，對生地黃生態(tài)特征、化學成分及藥學特點等進行整體相關(guān)分析，得到比較客觀真實的整體量化標準，進而可有效評價生地黃產(chǎn)地加工程度，對控制生地黃內(nèi)在質(zhì)量品質(zhì)具有重要指導意義和可行性探討。

3.2 生地黃(中藥)紅外光譜質(zhì)量標準建立的可行性探討 雖然紅外光譜能提供生地黃(中藥)復雜混合物的整體特征信息，但利用紅外光譜技術(shù)對生地黃(中藥)進行內(nèi)在質(zhì)量評價目前還更多的處于方法學探討之中[11-13]。那么要建立生地黃(中藥)紅外光譜質(zhì)量標準還是一個艱巨的任務(wù)并有一定的距離。完成這一任務(wù)需要一定的突破和大量的工作：即包括“中藥質(zhì)量標準的客觀認識、生地黃(中藥)標準樣品的合理選定、紅外光譜方法學的科學制訂及生地黃(中藥)紅外光譜數(shù)據(jù)庫的合作建立”。

4 結(jié) 論

中藥和紅外是一對天然組合。和中醫(yī)思想一樣中藥化學成分的特點同樣具有“整體觀”：即天然的、多樣的、相關(guān)的、相對的、相生的……，此整體多樣性特點滿足了中醫(yī)臨床整體辯證施治的需要。而紅外光譜特征的信息整體性能夠客觀表征中藥化學成分的整體多樣性。所以，通過本試驗表明，利用紅外光譜技術(shù)并結(jié)合計算機軟件、數(shù)學理論和化學語言能夠較好的客觀表征中藥化學成分的整體多樣性及個體差異性，在中藥整體質(zhì)量評價方面具有很好的指導意義和可行性探討。

中(獸)藥現(xiàn)代化的發(fā)展進程中，必須處理好繼承與創(chuàng)新的關(guān)系，應(yīng)把中(獸)藥按照“傳統(tǒng)中藥和現(xiàn)代中藥”分類管理，在標準、法規(guī)、政策等上應(yīng)區(qū)別對待。尤其傳統(tǒng)中藥應(yīng)重在傳承應(yīng)用，完善并修訂檢驗標準，構(gòu)建適合中藥特點的標準化體系，重點突出“整體質(zhì)量評價和過程質(zhì)量控制”，紅外光譜技術(shù)以其方便、快捷、無損等優(yōu)勢和特點將具有巨大的應(yīng)用前景。

[1] 孫素琴,周群,陳建波.中藥紅外光譜分析與鑒定[M].北京：化學工業(yè)出版社，2010，30.

[2] 國家藥典委員會.《中華人民共和國藥典》(一部)[S].

[3] 孫素琴,周群,陳建波.中藥紅外光譜分析與鑒定[M].北京：化學工業(yè)出版社，2010，78.

[4] 孫素琴，周群，秦竹.中藥二維相關(guān)紅外光譜鑒定圖集[M].北京：化學工業(yè)出版社，2003.

[5] 孫素琴,梁曦云,楊顯榮.六色靈芝的FTIR快速無損鑒別.光譜學與光譜分析[J],2002,22(2):226-228.

[6] 孫素琴,王米渠,梁曦云,等.枸杞子四種原性狀的FTIR光譜法鑒別.光譜學與光譜分析[J]，2001,21(6):787-789.

[7] 王琪,胡鑫堯. 三維光譜學——二維紅外光譜和時間分辨光譜[J].光譜學與光譜分析,2000,20(2):175-179.[8] 孫素琴，袁子民，白雁．紅外指紋圖譜與計算機輔助解析技術(shù)鑒別山藥的道地性[J]．計算機與應(yīng)用化學，2002,19(1)：77．

[9] 白雁，孫素琴，樊克鋒,等．紅外二階導數(shù)譜對地黃及不同提取部位、炮制品的鑒定．中草藥，2006, 37 (11): 1661-1663．

[10]樊克鋒,湯法銀,孫素琴,等.FTIR多級圖譜對山茱萸及其摻偽品的鑒別.光譜學與光譜分析,2008,28 (10):93-94.

[11]樊克鋒,湯法銀,孫素琴,等.酒制熟地黃炮制過程中梓醇變化趨勢和變化機理.中國獸藥雜志,2007,41(10):22-24.

[12]樊克鋒,趙建平, 湯法銀,等.現(xiàn)代FT-IT對固體制劑過程質(zhì)量控制的探討[J].河南畜牧獸醫(yī),2006,27 (10):37-38.

[13]白雁, 樊克鋒,李軍,等.不同方法加工生地黃的2D-IR和HPLC檢測結(jié)果相關(guān)性比較[J].中國中藥雜志,2005,30 (7):504-507.

(編輯：陳希)

Integrated Evaluation ofRadixRehmanniaeby FTIR Spectroscopy

FAN Ke-feng1, TANG Fa-yin1, ZHAO Jian-ping1， WANG Chang-lin1,SUN Su-qin2

(1.HenanUniversityofAnimalHusbandryandEconomy,Zhengzhou450000，China； 2.TsinghuaUniversity，Beijing100084,China)

The chemical compositions of traditional Chinese medicine are diverse and complex, and they need to be analyzed and characterized objectively. While the infrared spectral is able to characterize and analyze the overall chemical information comprehensively by peak characterization and correlation peaks ratio calculation. In this study, infrared spectroscopy combined with HPLC are applied to analyze the overall chemical information forRadixRehmanniacomprehensively. TheRadixRehmannia’s biological, morphological, chemical and pharmaceutical properties are quantified, analyzed and discussed for its variation and correlation to each other. This study has a great significance for exhaustive quality evaluation ofRadixRehmannia.

FTIR;RadixRehmannia; integrated evaluation; correlation peak ratio

河南省青年骨干教師項目基金(2013GGJS-191)

樊克鋒，碩士，從事利用現(xiàn)代分析手段對中藥品質(zhì)控制方面研究。E-mail: fanke333@aliyun.com

2016-12-27

A

1002-1280 (2017) 03-0055-06

S853.7