王秀麗，劉博，張媛，彭國瑞，李建，辛凌翔，蔣玉文

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

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豬丹毒桿菌C43005株的制備及檢定

王秀麗，劉博，張媛，彭國瑞，李建，辛凌翔，蔣玉文*

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

為研究豬丹毒桿菌C43005株的菌種特性，制備了一批豬丹毒桿菌C43005株并對菌種的真空度、剩余水分、形態(tài)、培養(yǎng)特性、生化特性、血清學(xué)特性、毒力、免疫原性等參數(shù)進行檢定，重點對該菌種的毒力進行重復(fù)試驗并對影響毒力的因素進行分析。結(jié)果表明，菌種的真空度、剩余水分、形態(tài)、培養(yǎng)特性、生化特性、血清學(xué)特性、免疫原性均符合《中華人民共和國獸用生物制品規(guī)程》二〇〇〇版相關(guān)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定，毒力試驗結(jié)果明顯受培養(yǎng)基質(zhì)量和動物個體差異的影響。本研究可以為豬丹毒桿菌C43005株的制備和檢定提供參考依據(jù)。

豬丹毒桿菌C43005株；毒力；免疫原性

目前我國的生產(chǎn)和檢驗用菌種作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進行管理，豬丹毒桿菌C43005株是王明俊先生在豬丹毒滅活疫苗(豬丹毒氫氧化鋁菌苗)試驗中經(jīng)比較8株豬丹毒桿菌的免疫原性，篩選出的免疫原性最好的菌株，因此選擇了C43005株為豬丹毒滅活疫苗的生產(chǎn)用菌種[1-2]?！吨腥A人民共和國獸用生物制品規(guī)程》二〇〇〇年版規(guī)定，本菌種的保存期為2～8 ℃保存10年，在菌種過期前需要更換批次，新制備的菌種需要參照質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)對所有參數(shù)進行檢定，且由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所鑒定、保管和供應(yīng)[3]。目前能追溯到的鑒定資料只有2006年的制備和檢定報告，之前的制備和檢定資料因未歸檔而無法查閱。本文詳細報告C43005株豬丹毒桿菌的制備和檢定方法及結(jié)果，以期為將來菌種的溯源和檢定提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種 豬丹毒桿菌C43005株(1983年3月27日凍干)，由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所菌種保藏中心提供。

1.2 培養(yǎng)基及試劑 馬丁瓊脂培養(yǎng)基、馬丁肉湯培養(yǎng)基、肉肝胃膜消化湯培養(yǎng)基、硫鹽(TG)、酪胨瓊脂(GA)、葡萄糖蛋白胨湯(GP)、生理鹽水、5%蔗糖脫脂牛奶購自北京中海生物技術(shù)有限公司；健康動物血清，購自Hyclone公司，批號：GWH0092，裂解血細胞全血、綿羊脫纖血由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供，API coryne棒狀桿菌生化鑒定試紙條，購自biomerieux.sa公司，革蘭氏染色液購自山東奧博星生物技術(shù)有限公司。

1.3 實驗動物 小鼠(KM系)，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，健康易感豬，購自河北、山東、四川。

1.4 菌種復(fù)壯、凍干 開啟1983年3月27日凍干的豬丹毒桿菌C43005株，經(jīng)肉肝胃膜消化湯溶解后，用接種環(huán)取少量菌液劃線接種含10%健康動物血清的馬丁瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)24 h后，挑取單菌落接種于20 mL含2%裂解血細胞全血的肉肝胃膜消化湯，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h后，取10mL靜脈注射20 kg左右的健康易感豬，豬死亡后剖解，無菌取肝臟和心血，用接種環(huán)取少量心血、肝臟分別接種含10%健康動物血清的馬丁瓊脂平板各1 付，分別接種10 mL肉肝胃膜消化湯，37 ℃培養(yǎng)24 h。

若平板和肉肝胃消化湯中的細菌純粹生長，挑取平板上的單菌落接種含10%健康動物血清的馬丁瓊脂斜面小管若干支，37 ℃培養(yǎng)24 h后，接種預(yù)培養(yǎng)24 h無菌生長的含10%健康動物血清的馬丁瓊脂斜面中管，37 ℃培養(yǎng)24 h。用含5%蔗糖的10%脫脂牛奶將菌體洗下，收集于含玻璃珠的滅菌分裝瓶中，充分振蕩混勻后，用長針頭注射器分裝至安瓿瓶中，按照特定的凍干曲線凍干后封口。

1.5 菌種的檢定

1.5.1 真空度測定 按照《中國獸藥典》[4]進行檢驗。

1.5.2 純粹檢驗 用馬丁瓊脂培養(yǎng)基，按照《中國獸藥典》[4]進行檢驗。

1.5.3 剩余水分測定 按照《中國獸藥典》[4]進行檢驗。

1.5.4 培養(yǎng)特性 在含有10%健康動物血清或含4%健康動物血清和0.1%裂解血細胞全血的馬丁瓊脂平板上，37 ℃培養(yǎng)36～48 h，觀察菌落形態(tài)。

1.5.5 血清學(xué)特性 沉淀反應(yīng)抗原的制備：取在含10%綿羊脫纖血的血斜面上培養(yǎng)的C43005株接種于含0.5%乳糖的馬丁肉湯培養(yǎng)基(加入10%的健康動物血清)，37 ℃培養(yǎng)24 h，純粹檢驗合格后加入0.5%的甲醛滅活24 h，3000 r/min離心30 min，收集菌體，用無菌PBS洗滌2 次，在沉淀物中加入適量蒸餾水(30倍濃縮)，經(jīng)121 ℃高壓1 h，冷卻后離心取上清即為沉淀反應(yīng)抗原，加入0.01%的硫柳汞，置于2～8 ℃?zhèn)溆谩－傊p相擴散法檢定血清型：在0.01 mol/L PBS中加入1%～1.2%的瓊脂，融化后加入0.01%的硫柳汞，傾注平板，凝固后打孔，孔徑與孔距均為4 mm，在酒精燈火焰上加熱封底，在中心孔加入沉淀反應(yīng)抗原，外周各孔加入定型血清，置于濕盤中37 ℃作用24 h，當(dāng)中心孔與周圍孔之間出現(xiàn)清晰的乳白色沉淀線，即為相應(yīng)的血清型。

1.5.6 生化特性檢查 參照試紙條的使用說明書進行檢定。

1.5.7 毒力 以肉肝胃膜消化湯培養(yǎng)24 h的菌液1～5 mL(每1 mL不少于活菌30億CFU)，靜脈注射斷奶后1～3 個月體重20 kg以上的健康易感豬2 頭，應(yīng)于4 日內(nèi)死亡；5～10 個活菌皮下注射18～22 g的小白鼠5 只，均應(yīng)于7 日內(nèi)死亡[3]。

1.5.8 免疫原性 開啟新凍干菌種，用馬丁肉湯溶解后劃線接種含10%健康動物血清的馬丁瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)24 h，挑取中等大小的菌落接種于100 mL含2%裂解血細胞全血的肉肝胃膜消化湯中，37 ℃ 培養(yǎng)28 h，取菌液參照《中國獸藥典》[4]進行純粹檢驗。檢驗純粹后按菌液總量的0.3%加入甲醛溶液，37 ℃滅活18～24 h，滅活期間振蕩數(shù)次。滅活后參照《中國獸藥典》二〇一〇版三部進行無菌檢驗；按照菌液與氫氧化鋁膠5∶1的比例充分混勻，靜置2～4 d后，棄去上清，濃縮至原體積的40%[3]。

用體重16～18 g的小白鼠10 只，分成2組，第1組皮下注射疫苗0.1 mL，第2 組皮下注射用40%氫氧化鋁膠4倍稀釋的疫苗0.2 mL，21 d后連同條件相同的對照小鼠6 只，其中3 只對照小鼠與免疫小鼠各皮下注射1000 MLD C43006和C43008的混合菌液，另3只小鼠皮下注射1 MLD C43006和C43008的混合菌液，觀察10 d，注射1000 MLD的對照小鼠應(yīng)全部死亡，注射1 MLD的對照小鼠應(yīng)至少死亡2 只，免疫小鼠至少保護7 只為合格[3]。

2 結(jié) 果

2.1 真空度測定 對凍干的150 支菌種參照《中國獸藥典》[4]進行檢驗，2/150無輝光，148/150呈現(xiàn)白色或粉色或紫色輝光，真空度良好。2 支無真空的菌種高壓處理。

2.2 純粹檢驗 隨機抽取5 支真空度測定良好的菌種，按照《中國獸藥典》[4]進行檢驗，5/5純粹，符合規(guī)定。

2.3 剩余水分測定 按照《中國獸藥典》[4]進行檢驗，結(jié)果為0.8%、0.4%、0.9%、0.7%，均小于4%，符合規(guī)定。

2.4 培養(yǎng)特性 在含4%健康動物血清和0.1%裂解血細胞全血的馬丁瓊脂平板上，37 ℃培養(yǎng)48 h，肉眼觀察菌落表面圓整光滑，呈微藍灰色露珠狀，符合規(guī)定。

2.5 血清學(xué)特性 C43005株與2型豬丹毒血清出現(xiàn)明顯沉淀線條，與1型血清無沉淀反應(yīng)，說明C43005株為豬丹毒2型，符合規(guī)定。

2.6 生化特性 測試結(jié)果見表1，符合細菌分類學(xué)中豬丹毒桿菌的生物學(xué)特性。

表1 豬丹毒桿菌C43005生化檢查結(jié)果

2.7 毒力 小鼠的毒力試驗結(jié)果顯示，20151222批肉肝胃膜消化湯培養(yǎng)的豬丹毒桿菌C43005株的最小致死劑量(MLD)大于10 CFU，20160126批肉肝胃膜消化湯培養(yǎng)的C43005株的MLD為4.3 CFU，初步證明肉肝胃膜消化湯對C43005的毒力有明顯影響。用20160126批肉肝胃膜消化湯培養(yǎng)菌液對小鼠的毒力試驗，結(jié)果符合標(biāo)準(zhǔn)中“5～10 個活菌皮下注射18～22 g的小白鼠5 只，均應(yīng)于7 日內(nèi)死亡”的規(guī)定，結(jié)果見表2；豬的毒力試驗結(jié)果顯示，用20160126批肉肝胃膜消化湯培養(yǎng)的菌液分別對山東、四川、河北地區(qū)的體重、日齡相近的豬進行毒力試驗，結(jié)果顯示對山東地區(qū)豬的MLD大于2.2×1010.0，對四川地區(qū)豬的MLD大于2.6×1010.0，對河北地區(qū)豬的MLD為1.6×1010.0，說明不同地區(qū)豬對C43005的耐受程度不同。20151222批和20160126批肉肝胃膜消化湯培養(yǎng)的菌液對河北地區(qū)豬的毒力試驗結(jié)果差異也說明不同批次肉肝胃膜消化湯對C43005的毒力有明顯影響。用20160126批次肉肝胃膜消化湯培養(yǎng)的菌液對河北豬進行試驗，結(jié)果2/2死亡，符合規(guī)定，結(jié)果見表3。

表2 豬丹毒C43005株對小鼠毒力試驗結(jié)果

“/”表示小鼠全部死亡后無小鼠死亡記錄

表3 豬丹毒C43005株對豬毒力試驗結(jié)果

所有試驗豬均為60～70 日齡，體重20～22 kg的健康易感豬

2.8 免疫原性試驗 疫苗滅活前對菌液進行活菌計數(shù)，菌液濃度為3.7×109.0CFU/mL，免疫小鼠21 d后攻毒，免疫1組小鼠5/5保護，免疫2組小鼠4/5保護，對照1組和對照2組小鼠均3/3死亡，結(jié)果符合規(guī)定。C43006株和C43008株混合菌液毒力測定結(jié)果顯示1MLD為4.3 CFU，見表4，攻毒保護結(jié)果見表5。

表4 C43006和C43008混合菌液毒力測定結(jié)果

“/”表示小鼠全部死亡后無小鼠死亡記錄

表5 攻毒保護試驗結(jié)果

“/”表示小鼠全部死亡后無小鼠死亡記錄；免疫1組表示小鼠免疫的疫苗原液，免疫2組表示小鼠免疫1 份疫苗與3 份40%的鋁膠生理鹽水的混合液；對照1組表示攻1000 MLD的對照組，對照2組表示攻1 MLD的對照組

3 討論與小結(jié)

鄭慶端在豬丹毒氫氧化鋁膠甲醛滅活苗的研究報告中還比較了肉胃消化湯、胃蛋消化湯、牛肝胃酶消化湯、肉肝胃酶消化湯、胰酶消化湯1和胰酶消化湯2等培養(yǎng)基以及馬丁肉湯加血清等培養(yǎng)基對豬丹毒促生長能力及制備疫苗的效力差異，結(jié)果顯示豬丹毒桿菌在肉肝培養(yǎng)基中生長良好，制出的疫苗效力表現(xiàn)良好，豬丹毒桿菌在胰酶消化湯2和牛肝胃酶消化湯中生長甚差，豬丹毒在肉胃消化湯、胃蛋消化湯培養(yǎng)基中生長良好，但制備的疫苗免疫保護效力較差，說明疫苗的效力受培養(yǎng)基和菌數(shù)的共同影響[5]。本研究試驗結(jié)果顯示，豬丹毒桿菌C43005對小鼠和豬的毒力均受培養(yǎng)基的影響，新鮮肉肝胃膜消化湯的制備因受牛肉、牛肝、豬胃等原材料的新鮮程度及消化溫度、時間、pH值、高壓溫度及時間等影響較大[3,5]，因此在進行菌種檢定時要先對培養(yǎng)基的促生長能力及培養(yǎng)菌的毒力進行預(yù)試驗，篩選出合適的培養(yǎng)基進行菌種檢定。

豬丹毒桿菌C43005對豬的毒力試驗結(jié)果顯示，不同地區(qū)的豬對C43005的耐受程度不同。在細菌類獸用生物制品效力檢驗中攻毒菌種毒力測定的結(jié)果也受實驗動物品系、來源等的影響，這也是細菌類生物制品的效力檢驗即使是SPF小鼠、SPF雞等有質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的動物攻毒前仍需預(yù)測毒力的原因，目前豬僅是一種實驗用動物，沒有相關(guān)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，地區(qū)差異、品系差異、養(yǎng)殖環(huán)境差異均影響試驗結(jié)果。

《中華人民共和國獸用生物制品規(guī)程》中對C43005毒力的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定為“制造和檢驗用菌種，以肉肝胃消化湯培養(yǎng)24 h的菌液1～5 mL(每1 mL含活菌不少于30億CFU)靜脈注射斷奶后1～3個月體重20 kg以上的健康易感豬2 頭，應(yīng)于4 日內(nèi)死亡”[3]，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的攻毒菌液的濃度沒有上限，此為質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中存在的一個漏洞，在C43006和C43008的毒力檢定中和C43005存在同樣的問題，2006年C43005菌種的檢定中對健康易感仔豬的最小致死劑量為1.5×1010CFU/頭(每頭豬注射5 mL 3.0×109.0CFU/mL的菌液)，因此建議修訂C43005毒力試驗的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，控制攻毒菌液濃度的上限，且經(jīng)過進一步的試驗驗證，將攻毒劑量進行適當(dāng)調(diào)整。

此次豬丹毒對豬的毒力試驗結(jié)果顯示，以20160126批次的肉肝胃消化湯培養(yǎng)的C43005以3.3×109.0CFU/mL的菌液濃度對河北地區(qū)的豬攻毒，豬2/2在4日內(nèi)死亡，符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，但受培養(yǎng)基質(zhì)量的影響，或受不同地域豬的個體差異影響，試驗結(jié)果差異顯著，且多組實驗結(jié)果均不符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定，菌種的毒力不能客觀評價。因此建議對用于生產(chǎn)或檢驗用菌種檢定的培養(yǎng)基、試劑、實驗動物的品種品系等制定相關(guān)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

[1] 中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所. 中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心.中國獸醫(yī)菌種目錄[S].

[2] 王明俊, 李揚隴. 豬丹毒氫氧化鋁菌苗試驗報告[J]. 中國畜牧獸醫(yī)雜志, 1956, (2):67-73.

[3] 農(nóng)業(yè)部獸用生物制品規(guī)程委員會. 中華人民共和國獸用生物制品規(guī)程二〇〇〇年版[S].

[4] 中國獸藥典委員會.中華人民共和國獸藥典二〇一〇年版三部[S].

[5] 鄭慶端, 馬聞天, 王明俊. 豬丹毒氫氧化鋁甲醛菌苗研究[J]. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報, 1957, (2):3-21.

(編輯：李文平)

The Preparation and Verification of Swine Erysipelas Bacillus C43005 Strain

WANG Xiu-li, LIU Bo, ZHANG Yuan, PENG Guo-rui, LI Jian, XIN Ling-xiang, JIANG Yu-wen*

(ChinaInstituteofVeterinaryDrugControl,Beijing100081，China)

In order to study the bacterial characteristics of swine erysipelas bacillus C43005 strain, a batch of swine erysipelas bacillus C43005 strain was prepared, and then the vacuum degree, residual moisture, morphology, culture characteristics, biochemical properties, serological characteristics, virulence, and immunogenicity were tested. The virulence experiment of C43005 was repeated and the influence factors were analyzed. The results showed that the vacuum degree, residual moisture, morphology, culture characteristics, biochemical properties, serological characteristics, immunogenicity conformed to the law of People′s Republic of China Veterinary Biological Products Regulation(2000 version), and the virulence test results were obviously affected by medium′s quality and experimental animals’ individual differences. This research could provide some reference data for the preparation of swine erysipelas bacillus C43005 strain.

swine erysipelas bacillus; C43005 strain; virulence; immunogenicity

王秀麗，助理研究員，從事獸用生物制品的檢驗及研究工作。

蔣玉文。E-mail：jiangyuwen@ivdc.org.cn

2016-11-09

A

1002-1280 (2017) 03-0021-06

S852.61