程浩，周夢潔，胡飛，葉蔥蔥，彭本英，張佳蘭

(長江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，湖北荊州，434025)

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肉桂醛體外抑制奶牛乳房炎主要致病菌的研究

程浩，周夢潔，胡飛，葉蔥蔥，彭本英，張佳蘭*

(長江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，湖北荊州，434025)

研究天然化合物肉桂醛對奶牛乳房炎主要致病菌——大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和鏈球菌的抑菌效果。采用試管二倍稀釋法測得肉桂醛對奶牛乳房炎主要致病菌金黃色葡萄球菌和標(biāo)準(zhǔn)金黃色葡萄球菌的體外最小抑菌濃度(MIC)分別為3.2 mmol/L和1.6 mmol/L；鏈球菌1.6 mmol/L；大腸桿菌和標(biāo)準(zhǔn)大腸桿菌6.4 mmol/L和3.2 mmol/L，且能完全抑制這三種菌的生長。肉桂醛的最小殺菌濃度(MBC)金黃色葡萄球菌和標(biāo)準(zhǔn)金黃色葡萄球菌分別為25.6 mmol/L和12.8 mmol/L；鏈球菌12.8 mmol/L；大腸桿菌和標(biāo)準(zhǔn)大腸桿菌25.6 mmol/L和12.8 mmol/L；在7 h內(nèi)能有效殺滅這三種菌，肉桂醛對奶牛乳房炎主要致病菌有抑菌和殺菌能力，是一種潛在的奶牛乳房炎的臨床治療藥物。

肉桂醛；乳房炎；抑菌；殺滅

目前奶牛生產(chǎn)中主要采用抗生素藥物防治奶牛乳房炎，容易導(dǎo)致牛奶中抗生素殘留及細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，發(fā)展高效、無毒、無殘留、安全的獸藥成為防治奶牛乳房炎的研究熱點(diǎn)。肉桂醛是肉桂科植物提取物的主要生物有效物質(zhì)，為單一有機(jī)化合物。肉桂醛液體無色或淡黃色，有強(qiáng)烈的香氣，難與水混勻，易與醇、醚混勻，易揮發(fā)，易氧化，對酸、堿不穩(wěn)定。肉桂醛能較好抑制各種菌生長，并能殺滅各種細(xì)菌，同時(shí)也是抗真菌的活性物質(zhì)[1-2]。有研究發(fā)現(xiàn)肉桂醛能特異性破壞細(xì)菌細(xì)胞壁葡聚糖和幾丁質(zhì)的合成，從而損傷細(xì)胞壁，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)而損傷細(xì)胞內(nèi)的微結(jié)構(gòu)而消滅細(xì)菌[3]。肉桂醛對大腸桿菌產(chǎn)生氧化脅迫，使過量的活性氧積累在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)，升高SOD 活力，進(jìn)一步氧化損傷細(xì)胞膜脂質(zhì)，從而損傷和破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，最終導(dǎo)致大腸桿菌死亡[4]。因?yàn)槿夤鹑┠苡行б种萍?xì)菌繁殖、防止微生物生長，且毒副作用低[5-6]，其在醫(yī)藥、化工、食品和飼料等行業(yè)被廣泛應(yīng)用。肉桂醛作為飼料添加劑具有促進(jìn)畜禽生長發(fā)育、促進(jìn)飼料在動(dòng)物體內(nèi)的利用效率(增加營養(yǎng)素在畜禽體內(nèi)的沉積量)、預(yù)防動(dòng)物感染性疾病、抑制飼料中霉菌繁殖等作用。在養(yǎng)牛業(yè)中，肉桂醛作為瘤胃改良劑添加于飼料中能提高養(yǎng)牛效益[7-8]。本研究結(jié)合肉桂醛的抑菌、低毒及應(yīng)用于牛飼料添加劑的特點(diǎn)，研究天然化合物肉桂醛對奶牛乳房炎主要病原菌的體外抑菌作用，以期為肉桂醛防治奶牛乳房炎提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌株及試劑 試驗(yàn)所用的金黃色葡萄球菌(S.aureus)、大腸桿菌(E.coli)和無乳鏈球菌(S.agalactiae)均為本實(shí)驗(yàn)從鮮乳樣中分離純化并鑒定得到。同時(shí)購買標(biāo)準(zhǔn)菌種大腸桿菌(ATCC 43890)和金黃色葡萄球菌(ATCC 29213)做對照。營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基和營養(yǎng)瓊脂由環(huán)凱微生物科技(生產(chǎn)批號分別為201510243、201508102)提供。無水乙醇為分析純，98%的肉桂醛溶液由江西雪松天然藥用油有限公司(生產(chǎn)批號150612)提供。

1.2 菌液與藥液的配制 從液氮中取出40%甘油保護(hù)的各個(gè)菌株貯備菌液100 μL混勻于各自相應(yīng)的培養(yǎng)基，于37 ℃，200 r/min的恒溫?fù)u床擴(kuò)繁至快速生長階段。然后在各自對應(yīng)的固體、液體培養(yǎng)基中連續(xù)劃線接種、擴(kuò)繁兩次來保證菌株旺盛的生命力(使用固體培養(yǎng)基37 ℃，0.5～1 d)。

無菌條件下分別挑取各個(gè)菌株的單菌落并在菌株對應(yīng)的液體培養(yǎng)基中于37 ℃，200 r/min的恒溫?fù)u床擴(kuò)繁至快速生長階段(722E分光光度計(jì)測定OD600 nm=0.3，上海光譜儀器有限公司)[9]，后用倍比稀釋法在顯微鏡下計(jì)數(shù)，用各個(gè)菌株對應(yīng)的液體培養(yǎng)基稀釋菌液為1×108CFU/mL，冷藏用作試驗(yàn)。98%肉桂醛用75%酒精1∶9稀釋，使肉桂醛濃度為741.5 mmol/L，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 肉桂醛對奶牛乳房炎主要致病菌的抑制作用

1.3.1.1 肉桂醛對奶牛乳房炎主要致病菌的最小抑菌濃度(MIC) 采用各個(gè)菌株對應(yīng)的液體培養(yǎng)基稀釋法測定肉桂醛抑制奶牛乳房炎主要致病菌的最小濃度。將每13個(gè)滅菌試管排一列，每一列試管按表1加各個(gè)菌株對應(yīng)的液體培養(yǎng)基、肉桂醛及稀釋菌液[9-10]，使細(xì)菌為5×105CFU/mL，恒溫(37 ℃)培養(yǎng)0.5～1 d。光下肉眼觀察試管中液體，以試管中液體透明、不分層和培養(yǎng)前一樣的最小肉桂醛濃度作為其MIC，且重復(fù)三次MIC相同。

1.3.1.2 肉桂醛對奶牛乳房炎主要致病菌生長曲線的影響 無菌條件下從各個(gè)菌株固體培養(yǎng)基分別挑單菌落置于裝有 3 mL 各自適宜液體培養(yǎng)基的試管內(nèi),并置于生化培養(yǎng)箱(LRH-250A，廣東省醫(yī)療器械廠)中(37 ℃，12 h)靜置培養(yǎng)。然后無菌條件下將 3 mL 的過夜培養(yǎng)的液體培養(yǎng)基菌液轉(zhuǎn)接至 97 mL相應(yīng)的液體培養(yǎng)基中,并置于全溫震蕩器中37 ℃、200 r/min 培養(yǎng)至快速生長階段(OD600 nm=0.3，722E分光光度計(jì)，上海光譜儀器有限公司)。將上述將制備的菌液分別分裝于6個(gè) 50 mL 的三角錐形瓶中，每個(gè)錐形瓶 15 mL，其中 5 個(gè)三角錐形瓶中肉桂醛終濃度分別為1/16 MIC、1/8 MIC、1/4 MIC、1/2 MIC和1 MIC；一個(gè)乙醇濃度為0.05%。將這6個(gè) 50 mL 三角錐形瓶置于全溫震蕩器中 37 ℃、200 r/min 培養(yǎng)，分別于 0、1、2、3、4、6、8、10 、12 h 測量一次OD600 nm(722E分光光度計(jì)，上海光譜儀器有限公司)值，然后繪制 OD值-時(shí)間曲線。

表1 肉桂醛對奶牛乳房炎主要致病菌的最小抑菌濃度

1.3.2 肉桂醛對奶牛乳房炎主要致病菌的殺滅作用

1.3.2.1 肉桂醛對奶牛乳房炎主要致病菌的最小殺滅濃度 類似于前面的處理，每7個(gè)滅菌試管排一列，試管的處理見表2，恒溫(37 ℃)培養(yǎng)0.5～1 d后，光下肉眼觀察試管中液體。把肉眼觀察全部透明、不分層試管的液體通過接種環(huán)取液劃線各個(gè)菌株對應(yīng)的固體培養(yǎng)平板上，恒溫(37 ℃)培養(yǎng)2 d。查看細(xì)菌生長情況，以菌落數(shù)不大于5個(gè)時(shí)的肉桂醛濃度為最小殺菌濃度(MBC)。

表2 肉桂醛對奶牛乳房炎主要致病菌的最小殺滅濃度

1.3.2.2 肉桂醛對奶牛乳房炎主要致病菌殺菌曲線的影響 菌種準(zhǔn)備、擴(kuò)大培養(yǎng)、分裝及培養(yǎng)同上面。其中5個(gè)三角錐形瓶中肉桂醛終濃度分別為1/8 MBC、1/4 MBC、1/2 MBC、MBC和2 MBC；一個(gè)乙醇濃度為0.05%。在0、1、3、5、7、9、12、18 h 取樣并稀釋，用平板法計(jì)其活菌數(shù)，繪出細(xì)菌數(shù)-時(shí)間曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 肉桂醛對奶牛乳房炎主要致病菌的抑制作用 肉桂醛對奶牛乳房炎主要致病菌活性均有抑制，其中金黃色葡萄球菌和標(biāo)準(zhǔn)金黃色葡萄球菌的MIC為3.2 mmol/L和1.6 mmol/L；鏈球菌的MIC為1.6 mmol/L；大腸桿菌和標(biāo)準(zhǔn)大腸桿菌的MIC分別為6.4 mmol/L和3.2 mmol/L。稀釋劑對照組加入最大劑量的稀釋劑，試驗(yàn)結(jié)果表明，稀釋劑不影響奶牛乳房炎主要致病菌的生長。

肉桂醛對奶牛乳房炎主要致病菌生長曲線的影響見圖1、圖2和圖3。如圖所示，1/16 MIC、1/8 MIC濃度的肉桂醛對奶牛乳房炎主要致病菌的生長幾乎沒有影響；1/4 MIC、1/2 MIC濃度的肉桂醛使奶牛乳房炎主要致病菌的生長曲線滯后，而MIC濃度的肉桂醛能有效抑制大腸桿菌和鏈球菌的生長，對金黃色葡萄球菌有一定的抑制作用。

圖1 肉桂醛濃度對大腸桿菌生長曲線的影響

圖2 肉桂醛濃度對金黃色葡萄球菌生長曲線的影響

圖3 肉桂醛濃度對無乳鏈球菌生長曲線的影響

2.2 肉桂醛對奶牛乳房炎主要致病菌的殺滅作用 肉桂醛對奶牛乳房炎主要致病菌均有殺滅作用，其中金黃色葡萄球菌和標(biāo)準(zhǔn)金黃色葡萄球菌的MBC分別為25.6 mmol/L和12.8 mmol/L；鏈球菌的MBC為12.8 mmol/L；大腸桿菌和標(biāo)準(zhǔn)大腸桿菌的MBC為25.6 mmol/L和12.8 mmol/L。

對照組添加0.05%的乙醇，7 h時(shí)，大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和鏈球菌的細(xì)菌數(shù)約是原來的10倍，因此，稀釋劑乙醇對細(xì)菌沒有殺滅作用。肉桂醛對奶牛乳房炎主要致病菌的殺滅效果和趨勢相似(圖4、圖5和圖6)。1/8 MBC濃度的肉桂醛僅能抑制奶牛乳房炎主要致病菌的生長；1/4 MBC濃度的肉桂醛殺菌作用較弱； 1/2 MBC濃度的肉桂醛18 h內(nèi)不能完全殺滅細(xì)菌；當(dāng)肉桂醛的濃度為1 MBC和2 MBC時(shí)，7 h內(nèi)能殺滅這3種奶牛乳房炎主要致病菌，且2 MBC的殺菌效果強(qiáng)于1 MBC，對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的殺滅效果優(yōu)于無乳鏈球菌。

圖4 肉桂醛對大腸桿菌的殺菌曲線

圖5 肉桂醛對金黃色葡萄球菌的殺菌曲線

圖6 肉桂醛對無乳鏈球菌的殺菌曲線

3 討論與小結(jié)

肉桂醛具有揮發(fā)性，易氧化，將肉桂醛與其他物質(zhì)結(jié)合，保存容易并能增強(qiáng)其抑菌效果，本研究用75%的乙醇作稀釋劑，效果優(yōu)于無水乙醇和二甲基亞砜(DMSO)。王新偉等研究結(jié)果表明：在植物提取物肉桂油、牛至油、檸檬醛和香芹酚中，肉桂醛的抑菌效果最好，尤其是對金黃色葡萄菌的抑菌效果顯著優(yōu)于大腸桿菌[11]。本研究的結(jié)果與其一致，并且肉桂醛對鏈球菌的抑菌作用最強(qiáng)。關(guān)于肉桂醛抑菌的作用機(jī)制，一種說法認(rèn)為肉桂醛能破壞細(xì)菌或真菌的結(jié)構(gòu)和功能的完整性，從而殺滅細(xì)菌[11-15]。另一種說法認(rèn)為，肉桂醛通過進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)干擾胞內(nèi)代謝以及影響基因的正常表達(dá)，發(fā)揮其抑菌作用[16-19]。

張赟彬等研究表明肉桂醛對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的MIC和MBC，分別為0.25 μl/mL和0.55 μl/mL[20]，而肉桂油對這兩種菌的MIC為1.0 mg/mL，對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的MBC分別為4.0 mg /mL和2.0 mg/mL[21]，本研究中肉桂醛對大腸桿菌的MIC和MBC分別為6.4 mmol/L和25.6 mmol/L，對金黃色葡萄球菌的MIC和MBC分別為3.2 mmol/L和25.6 mmol/L。出現(xiàn)這種差異，一方面與肉桂醛的純度有關(guān)，也可能與所分離的細(xì)菌的耐藥性有關(guān)。依據(jù)細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性的標(biāo)準(zhǔn)(MBC≥32 MIC)[9]，說明奶牛乳房炎主要致病菌對肉桂醛尚未產(chǎn)生耐藥性。

本試驗(yàn)結(jié)果表明肉桂醛對奶牛乳房炎主要致病菌有較強(qiáng)的抑菌和殺菌作用，且無耐藥性，說明肉桂醛是一種潛在的奶牛乳房炎的臨床治療藥物。肉桂醛是否具有較好的臨床治療效果還有待進(jìn)一步的研究。

[1] Kim H O, Park S W, Park H D. Inactivation ofEscherichiacoliO157:H7 by cinnamicaldehyde purified from cinnamomum cassia shoot [J]. Food Microbiology, 2004, 21(1): 105-110.[2] 李京晶，籍保平，周峰. 丁香和肉桂揮發(fā)油的提取、主要成分測定及其抗菌活性研究[J]. 食品科學(xué)，2006，27(8): 64-68.

[3] Xing F, Hua H, Selvaraj J N,etal. Growth inhibition and morphological alterations of Fusarium verticillioides by cinnamon oil and cinnamaldehyde [J]. Food Control, 2014, 46: 343-350.

[4] Shen S, Zhang T, Yuan Y,etal. Effects of cinnamaldehyde onEscherichiacoliandStaphylococcusaureusmembrane[J]. Food Control, 2015, 47: 196-202.

[5] Sherikh S, Rimple B, Neelofar K,etal. Cinnamicaldehydes affect hydrolytic enzyme secretion and morphogenesis in oral Candida isolates [J]. Microb Pathogenesis, 2010, 52(5): 251-258.

[6] Michiels J, Missotten J, Fremaut D,etal.Invitrodose-response of carvacrol, thymol, eugenol and trans-cinnamaldehyde and interaction of combinations for the antimicrobial activity against the pig gut flora[J]. Livestock Science，2007，109(1/3): 157-160.

[7] Ishlak A, Günalb M, AbuGhazaleha A A. The effects of cinnamaldehyde, monensin and quebracho condensed tannin on rumen fermentation, biohydrogenation and bacteria in continuous culture system[J]. Anim Feed Sci Technol, 2015, 207: 31-40.

[8] Khorrami B, Vakili A R, Danesh Mesgaran M,etal. Thyme and cinnamon essential oils: Potential alternatives for monensin as a rumen modifier in beef production systems [J]. Anim Feed Sci Technol, 2015, 200: 8-16.

[9] 吳金梅. 甘草總黃酮抗金黃色葡萄球菌作用及其治療奶牛乳房炎的應(yīng)用研究[D]. 沈陽: 吉林大學(xué)，2012.

[10]李詩瑩. 甘草總黃酮混懸乳房注射劑對奶牛乳房炎治療效果研究[D]. 大慶: 黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)，2015.

[11]王新偉，劉歡，魏靜，等. 牛至油、香芹酚、檸檬醛和肉桂醛抑菌作用研究[J]. 食品工業(yè)，2010，5: 13-15.

[12]謝小梅，張文平，付穎瑗，等. 肉桂醛與檸檬醛抗曲霉菌作用機(jī)制的研究[J]. 中草藥，2004，35(4):430-432.

[13]張文平，傅穎媛，謝小梅. 肉桂醛抗曲霉菌作用機(jī)制研究[J]. 江西醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2003，43(6): 10-13.

[14]謝小梅，龍凱，方建茹，等. 肉桂醛、檸檬醛抑制黃曲霉生長機(jī)制研究[J]. 中國公共衛(wèi)生，2007，23(3): 301-302.

[15]汪琨，徐崢，汪倩雯，等. 肉桂醛特異性抑制酵母細(xì)胞壁合成的作用機(jī)理[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè)，2012，38(3): 68-71.

[16]王帆，楊靜東，王春梅，等. 肉桂醛對大腸桿菌和綠膿桿菌的作用機(jī)制[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2011，27(4): 888-892.[17]方建茹，謝小梅，牛鋒. 肉桂醛對煙曲霉細(xì)胞壁合成關(guān)鍵基因FKS表達(dá)的影響[J]. 現(xiàn)代藥物與臨床，2011，65(5): 389-392.

[18]Becerril R, Gómez-Lus R, Goni P，etal. Combination of analytical and microbiological techniques to study the antimicrobial activity of a new active food packaging containing cinnamon or oregano againstE.coliandS.aureus[J]. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2007, 388(5): 1003-1011.

[19]Kwon J A, Yu C B, Park H D. Bacteriocidal effects and inhibition of cell separation of cinnamicaldehyde on Bacillus cereus [J]. Letters in Applied Microbiology, 2003, 37(1): 61-65.

[20]Gill A O, Holley R A. Mechanisms of bactericidal action of cinnamaldehyde against Listeria monocytogenes and of eugenol against L. monocytogenes and Lactobacillus sakei [J]. Applied and Environmental Microbiology, 2004, 70(10): 5750-5755.

[21]張赟彬，劉笑宇，姜萍萍，等. 肉桂醛對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌作用及抑菌機(jī)理研究[J]. 現(xiàn)代食品科技，2015,31(5): 31-35.

[22]Yunbin Zhang, Xiaoyu Liu, Yifei Wang,etal. Antibacterial activity and mechanism of cinnamon essential oil againstEscherichiacoliandStaphylococcusaureus[J]. Food Control, 2016, 59: 282-289.

(編輯：侯向輝)

Study on Cinnamaldehyde to Inhibit the Main Pathogenic Bacteria of Mastitis in Dairy Cowinvitro

CHENG Hao, ZHOU Meng-jie, HU Fei, YE Cong-cong, PENG Ben-ying, ZHANG Jia-lan*

(CollegeofAnimalScience，YangtzeUniversity，Jingzhou,Hubei434025，China)

The bacteriostatic effect of natural compounds cinnamaldehyde on the main pathogenic bacteriaEscherichiacoli,StaphylococcusaureusandStreptococcusof dairy cow mastitis was studied. Tube double dilution method was used to measure the minimum inhibitory concentration (MIC) of cinnamaldehyde on main pathogenic bacteria of dairy cow mastitisinvitro. The MIC of cinnamaldehyde againstStaphylococcusaureuswas 3.2 mmol/L and standardsStaphylococcusaureuswas 1.6 mmol/L. The MIC of cinnamaldehyde againstStreptococcuswas 1.6mmol/L,E.coliwas 6.4 mmol/L and standardsE.coliwas 3.2 mmol/L. Cinnamaldehyde can completely inhibit the growth of the three kinds of bacteria. The minimum bactericidal concentration (MBC) of cinnamaldehyde againstStaphylococcusaureusandE.coliwas 25.6 mmol/L. The MBC of cinnamaldehyde against standardsStaphylococcusaureus,Streptococcusand standardsE.coliwas 12.8 mmol/L. These three kinds of bacteria were killed in 7 h by cinnamaldehyde. Therefore, cinnamaldehyde has antibacterial and bactericidal capability against main pathogenic bacteria of dairy cow mastitis. And it is a kind of potential clinical treatment drug of dairy cow mastitis.

cinnamaldehyde; mastitis; antibacterial; sterilization

長江大學(xué)第七批大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(2014017)

程浩，助理畜牧師，從事生物制品研究。

張佳蘭。E-mail：zjlgpy88@163.com

2016-10-23

A

1002-1280 (2017) 03-0039-05

S859.79