敖鵬，邊曉燕，費(fèi)洪新，李寶龍，賈博宇，房城，王曉源

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

通天草提取物對(duì)Aβ1-40所致老年癡呆大鼠基底核超微結(jié)構(gòu)影響

敖鵬，邊曉燕，費(fèi)洪新，李寶龍，賈博宇，房城，王曉源*

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

目的：觀察通天草提取物對(duì)Aβ1-40,所致老年癡呆(AD)模型大鼠基底核超微結(jié)構(gòu)的影響，探討其防治AD的形態(tài)學(xué)機(jī)制。方法：實(shí)驗(yàn)分正常組、模型組、通天草水提組、通天草醇提組和中藥對(duì)照組進(jìn)行。使用Aβ1-40制備AD大鼠模型，于造模后第7天開(kāi)始用藥，連續(xù)用藥21天后，取大腦基底核組織，應(yīng)用透射電鏡觀察其超微結(jié)構(gòu)改變。結(jié)果：模型組，部分神經(jīng)元細(xì)胞核膜皺縮；線粒體腫脹明顯，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張；高爾基復(fù)合體扁平囊泡結(jié)構(gòu)融合；突觸數(shù)量與突觸小泡均減少。通天草醇提組和水提組基底核超微結(jié)構(gòu)的損傷明顯低于模型組，其中醇提組的作用優(yōu)于水提組。結(jié)論: 通天草提取物能夠改善Aβ1-40所致AD大鼠基底核超微結(jié)構(gòu)損傷，對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞具有一定的修復(fù)和保護(hù)作用。

通天草提取物；老年性癡呆；基底核；超微結(jié)構(gòu)

老年癡呆癥，又稱阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)，是一種神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，主要以記憶障礙、失語(yǔ)、視空間技能損傷等為特征，病因迄今尚未十分明確。本文采用透射電鏡技術(shù)，系統(tǒng)觀察了通天草提取物對(duì)Aβ1-40所致AD大鼠基底核超微結(jié)構(gòu)的影響，探討該提取物防治AD的形態(tài)學(xué)機(jī)制及藥用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 主要試劑、藥品和儀器

Aβ1-40(Amyloid β-protein,Fragment 1-40)由Sigma公司提供；通天草水提物和醇提物，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院提供；腦復(fù)康片劑(400 mg/片)，東北制藥廠生產(chǎn)；注射用青霉素鈉，哈藥集團(tuán)生產(chǎn)；透射電子顯微鏡，TECNAI G2型，美國(guó)FEI公司制造；超薄切片機(jī)，德國(guó)萊卡公司制造。

1.2 動(dòng)物與分組

成年清潔級(jí)Wistar大鼠80只，雌雄各半，體質(zhì)量(300±20)g，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物中心提供。將動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)，剔除不合格鼠，隨即分成正常組、模型組、通天草水提組、通天草醇提組、中藥(腦復(fù)康)對(duì)照組，每組10只。

1.3 模型制備

按照本課題組前期研究成果的方法，進(jìn)行模型制備[1]。

1.4 動(dòng)物給藥

各實(shí)驗(yàn)組在造模第7天實(shí)施灌胃給藥，連續(xù)給藥21天，1次/d，給藥劑量分別為：醇提組1.18 g/(kg·d)；水提組2.90 g/(kg·d)；中藥組0.7 g/(kg·d)；正常組與模型組大鼠給予同等體積的飲用水。

1.5 透射電鏡樣品取材與制備

各實(shí)驗(yàn)組在給藥21 d后，用3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)行腹腔麻醉，經(jīng)左心室和主動(dòng)脈灌注4%多聚甲醛和3%戊二醛混合液固定腦組織，參照大鼠腦圖譜[2]在解剖顯微鏡下剝離基底核，每例切取大致相同的部位，大少為1×2×2 mm3，置于3%戊二醛中預(yù)固定，磷酸緩沖液沖洗，1%鋨酸后固定，丙酮梯度脫水，Epon812浸透、包埋、聚合。使用超薄切片機(jī)切取半薄切片(500 nm)，光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行核團(tuán)定位后，再進(jìn)行超薄切片(50 nm)，醋酸鈾和枸櫞酸鉛雙重染色，透射電鏡下觀察拍照。

2 結(jié)果

2.1 正常組超微結(jié)構(gòu)

神經(jīng)元細(xì)胞：多成圓錐形，核大而圓，核膜圓滑，核仁清晰(圖1A)；線粒體散在分布于胞漿內(nèi)，并可見(jiàn)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體、高爾基復(fù)合體(圖1B)。突觸：神經(jīng)纖維間可見(jiàn)豐富的突觸結(jié)構(gòu)，突觸前成分內(nèi)富含大小不一的突觸小泡和線粒體等；突觸厚膜胞漿面有致密物質(zhì)，突觸間隙清晰(圖1C)。

2.2 模型組超微結(jié)構(gòu)病變

神經(jīng)元細(xì)胞：核形不規(guī)則，核膜凹陷或融合(圖2A)；線粒體腫脹明顯，導(dǎo)致脊斷裂和內(nèi)外膜破損；粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張且脫顆粒，核糖體減少；高爾基復(fù)合體扁平囊泡結(jié)構(gòu)融合(圖2B)。突觸：神經(jīng)元突觸數(shù)目和突觸小泡明顯減少，突觸后膜致密物質(zhì)融合或電子密度降低，部分突觸間隙消失(圖2C)。

2.3 通天草水提組超微結(jié)構(gòu)改善

神經(jīng)元細(xì)胞：細(xì)胞核形不盡規(guī)則，核膜有輕度下凹(圖3A)；線粒體仍見(jiàn)腫脹、部分脊斷裂；粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張；高爾基復(fù)合體損傷輕于模型組(圖3B)。突觸：突觸數(shù)目未見(jiàn)明顯減少，部分突觸小泡減少；部分突觸后膜致密物質(zhì)密度下降，偶見(jiàn)突觸間隙消失(圖3C)。

2.4 通天草醇提組超微結(jié)構(gòu)改善

神經(jīng)元細(xì)胞：細(xì)胞核形尚規(guī)則(圖4A)；少數(shù)線粒體輕度腫脹、個(gè)別線粒體脊損傷；粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體、高爾基復(fù)合體較發(fā)達(dá)且形態(tài)近于正常組(圖4B)。突觸：突觸數(shù)目及突觸小泡均未見(jiàn)減少；有的突觸后膜致密物質(zhì)密度下降，個(gè)別突觸間隙結(jié)構(gòu)欠清晰(圖4C)。醇提組超微結(jié)構(gòu)改善優(yōu)于水提組。

2.5 中藥對(duì)照組超微結(jié)構(gòu)改善與醇提組近似(圖5)。

A.正常組神經(jīng)元細(xì)胞(2 550×) B.正常組細(xì)胞器(16 500×) C.正常組突觸(20 500×)圖1 正常組超微結(jié)構(gòu)電鏡圖

A.模型組神經(jīng)元細(xì)胞(2 550×) B.模型組細(xì)胞器(16 500×) C.模型組突觸(16 500×)圖2 模型組超微結(jié)構(gòu)電鏡圖

A.水提組神經(jīng)元細(xì)胞(2 550×) B.水提組細(xì)胞器(16 500×) C.水提組突觸(16 500×)圖3 水提組超微結(jié)構(gòu)電鏡圖

A.醇提組神經(jīng)元細(xì)胞(2 550×) B.醇提組細(xì)胞器(16 500×) C.醇提組突觸(16 500×)圖4 醇提組超微結(jié)構(gòu)電鏡圖

A.中藥組神經(jīng)元細(xì)胞(2 550×) B.中藥組細(xì)胞器(16 500×) C.中藥組突觸(16 500×)圖5 中藥組超微結(jié)構(gòu)電鏡圖

3 討論

3.1 Aβ沉積與AD的發(fā)病機(jī)制[3-6]

AD的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，β淀粉樣蛋白被公認(rèn)為是誘發(fā)AD發(fā)病的關(guān)鍵因素之一。AD的病理學(xué)特征是腦組織細(xì)胞外老年斑形成，其主要成分為β淀粉樣蛋白。近年研究報(bào)道：Aβ通過(guò)不同機(jī)制不僅作用于神經(jīng)元細(xì)胞外，也作用于細(xì)胞內(nèi)，共同誘發(fā)AD的發(fā)病。它存在于線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基復(fù)合體等多種細(xì)胞器中。可導(dǎo)致線粒體損傷，膜電位下降，致使細(xì)胞內(nèi)鈣失衡；造成內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)生應(yīng)激性反應(yīng)，使其調(diào)節(jié)酶Grp78和磷酸化eIF2α水平升高；引發(fā)突觸結(jié)構(gòu)改變，細(xì)胞信息傳導(dǎo)障礙。本實(shí)驗(yàn)采用Aβ1-40制備AD模型，觀察到神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)線粒體等多種細(xì)胞器發(fā)生超微結(jié)構(gòu)病變，為細(xì)胞內(nèi)Aβ的毒性作用提供了形態(tài)學(xué)依據(jù)。

3.2 突觸損傷與減少是造成AD的主要原因之一

大量臨床研究和基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)顯示，老年癡呆癥與神經(jīng)元突觸的損傷和減少密切相關(guān)。Holtzman DM等研究人員，采用Aβ1-42疫苗治療AD并進(jìn)行流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)。對(duì)參與治療的病人，將生前認(rèn)知功能測(cè)試結(jié)果和死后尸檢病理統(tǒng)計(jì)結(jié)果對(duì)比分析，表明：Aβ沉積、 神精纖維纏結(jié)與 AD的認(rèn)知功能無(wú)顯著差異[7]，并發(fā)現(xiàn)AD發(fā)病前就出現(xiàn)神經(jīng)突觸消失，隨著時(shí)間的推移，可出現(xiàn)輕度、中度、重度認(rèn)知障礙直至癡呆。文獻(xiàn)認(rèn)為：神經(jīng)元突觸消失是AD發(fā)生發(fā)展的主要因素[8-11]。

本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M，神經(jīng)元細(xì)胞不僅出現(xiàn)線粒體等細(xì)胞器的超微結(jié)構(gòu)損傷，而且還出現(xiàn)了突觸融合和明顯減少等病變。線粒體的主要功能是提供能量，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基復(fù)合體是完成蛋白質(zhì)合成分泌、加工及運(yùn)輸?shù)闹匾獔?chǎng)所；上述細(xì)胞器的病變，可能是引發(fā)突觸損傷和減少的主要原因；而突觸減少會(huì)影響神經(jīng)遞質(zhì)的儲(chǔ)存、釋放以及功能蛋白的相互作用，致使信息傳導(dǎo)受阻，神經(jīng)功能紊亂，引發(fā)AD。

3.3 通天草提取物對(duì)Aβ1-40所致AD大鼠基底核超微結(jié)構(gòu)的改善

基底核由位于大腦皮層底下一系列神經(jīng)核團(tuán)組成，其主要功能為自主運(yùn)動(dòng)的控制、意識(shí)活動(dòng)的調(diào)節(jié)和運(yùn)動(dòng)反應(yīng)，同時(shí)還參與記憶、情感等高級(jí)認(rèn)知功能?；缀说牟∽兛蓪?dǎo)致多種運(yùn)動(dòng)和認(rèn)知障礙。

關(guān)于中醫(yī)藥對(duì)實(shí)驗(yàn)性AD動(dòng)物模型的治療作用報(bào)道，多見(jiàn)于對(duì)大腦皮質(zhì)和海馬組織的觀察，而對(duì)基底核的觀察報(bào)道較少。

本課題組前期研究成果報(bào)道，通天草提取物能夠調(diào)節(jié)Aβ1-40所致AD大鼠血液和海馬組織中的細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6的含量，對(duì)β樣淀粉蛋白沉積引發(fā)的免疫炎癥反應(yīng)具有一定的調(diào)控作用[12-13]。本實(shí)驗(yàn)在前期工作的基礎(chǔ)上，又觀察了該提取物對(duì)AD大鼠基底核的影響。觀察結(jié)果顯示，模型組，神經(jīng)元細(xì)胞線粒體病變最為嚴(yán)重；通天草治療組，線粒體損傷明顯減輕，與其它細(xì)胞器相比改善最為顯著。作者認(rèn)為，通天草的作用機(jī)制可能是通過(guò)阻斷Aβ在線粒體中的沉積，而阻斷Aβ的毒性作用，使細(xì)胞合成能量的主要場(chǎng)所得到保護(hù)，完成線粒體三羧酸循環(huán)和呼吸鏈傳遞的主要生化過(guò)程，從而使粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復(fù)合體等細(xì)胞器獲得正常能量，改善其超微結(jié)構(gòu)的損傷。神經(jīng)元細(xì)胞器結(jié)構(gòu)和功能的恢復(fù)，則阻止了突觸的損傷和減少。通天草提取物能夠改善Aβ1-40所致AD大鼠基底核超微結(jié)構(gòu)損傷，對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞具有一定的修復(fù)和保護(hù)作用，其中通天草醇提組優(yōu)于水提組。

3.4 本實(shí)驗(yàn)的后期工作

本實(shí)驗(yàn)的后期工作將在透射電鏡下，對(duì)神經(jīng)元突觸的減少與恢復(fù)程度進(jìn)行體視學(xué)處理，得出統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)。

關(guān)于通天草提取物對(duì)Aβ沉積性大腦癡呆癥的作用機(jī)制，還需要采用蛋白組學(xué)等實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)一步研究和探討。

[1] 周忠光,韓玉生,姜波,等.補(bǔ)陽(yáng)還五湯及拆方對(duì)Aβ1-40所致AD大鼠血清與海馬組織Aβ和細(xì)胞因子含量的影響[J].山西醫(yī)藥雜志,2008,37(2):129-131.

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2016-05-19

2016-12-20

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(81373777)

敖鵬(1985-)，男，碩士，助理研究員，主要研究方向：抗衰老和類風(fēng)濕防治。

*通訊作者：王曉源(1977-)，女，博士，副教授，黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)在站博士后，主要研究方向：中醫(yī)藥抗衰老。

R285.5

A

1002-2392(2017)02-0019-03