趙 龍 張超越 徐京育

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)2014級(jí)碩士研究生，黑龍江 哈爾濱 150040)

芪桂益脈靈對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷基質(zhì)金屬蛋白酶9及c-Jun氨基末端蛋白激酶表達(dá)的影響※

趙 龍 張超越 徐京育△

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)2014級(jí)碩士研究生，黑龍江 哈爾濱 150040)

目的 觀察芪桂益脈靈對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)和c-Jun氨基末端蛋白激酶(JNK)信號(hào)通路的影響。方法 將50只健康雄性SD大鼠隨機(jī)分為空白組(N)、假手術(shù)組(Sham)、單純?nèi)毖俟嘧⒔M(I/R)、芪桂益脈靈高劑量組(QGYMLH)、芪桂益脈靈低劑量組(QGYML)，每組10只，分別給予0.9%氯化鈉注射液、芪桂益脈靈(高、低劑量)，連續(xù)灌服7 d，結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支造成急性心肌梗死模型，腹主動(dòng)脈采血，離心取上層血清，采用酶聯(lián)免疫法檢測MMP-9的表達(dá)；取心肌組織，用中性福爾馬林固定，應(yīng)用免疫組化法檢測磷酸化c-Jun氨基末端蛋白激酶(P-JNK)表達(dá)。結(jié)果 Sham組MMP-9、P-JNK表達(dá)水平與N組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；I/R組、QGYMLL組、QGYMLH組MMP-9、P-JNK表達(dá)水平均高于N組(P<0.05)；QGYML組、QGYMLH組MMP-9、P-JNK表達(dá)水平均低于I/R組(P<0.05)；QGYMLH組MMP-9、P-JNK表達(dá)水平低于QGYMLL組(P<0.05)。結(jié)論 芪桂益脈靈對(duì)缺血再灌注損傷心肌具有保護(hù)作用，其機(jī)制與抑制心肌組織中JNK磷酸化程度及MMP-9表達(dá)有關(guān)，且與中藥劑量相關(guān)。

黃芪；桂枝；心肌再灌注損傷；大鼠；JNK絲裂原活化蛋白激酶類；基質(zhì)金屬蛋白酶類

近年來，心肌梗死(以下簡稱心梗)的發(fā)病率不斷上升，心梗再通后造成的心肌損傷成為關(guān)注的熱點(diǎn)，所以心肌缺血再灌注治療藥物的研究具有重要意義。缺血再灌注的病理機(jī)制主要有炎性反應(yīng)、能量代謝障礙等，其中c-Jun氨基末端蛋白激酶(JNK)是炎性損傷的關(guān)鍵靶點(diǎn)[1-3]。JNK信號(hào)通路不僅在缺血期可被激活，在再灌注階段也可被激活，參與炎性反應(yīng)，進(jìn)一步引起炎性損傷[4]?；|(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)是基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)家族的主要成員之一，能在缺血再灌注損傷后使小血管壁受傷，導(dǎo)致細(xì)胞水腫及炎性浸潤，早期抑制MMP-9表達(dá)，可以減輕梗死面積[5]。現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，激活JNK信號(hào)通路可以上調(diào)MMP-9表達(dá)。本研究通過芪桂益脈靈對(duì)大鼠進(jìn)行預(yù)處理，觀察心肌急性缺血再灌注損傷大鼠模型MMP-9和JNK的表達(dá)，研究芪桂益脈靈對(duì)缺血再灌注損傷保護(hù)機(jī)制[6]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 健康雄性SD大鼠50只,體質(zhì)量200 g～250 g，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[許可證號(hào)：SCXK(黑)2013-004]。

1.1.2 試劑 大鼠MMP-9酶聯(lián)免疫分析試劑盒，購自北京誠林生物科技有限公司； SC-572(兔一抗)試劑盒、SC-6254(鼠一抗)試劑盒、PV-9001(兔二抗)試劑、PV-9002(鼠二抗)試劑，均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；烏拉坦，購自北京博士德生物工程有限公司；3′3-二氨基苯聯(lián)胺(DAB)顯色溶液，購自上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司；磷酸緩沖鹽溶液(PBS)，購自上海易利生物科技有限公司；中藥復(fù)方芪桂益脈靈，藥物組成：黃芪、桂枝、苦參、三七、黃連、龍齒、黨參、麥冬、五味子、炒酸棗仁，為免煎顆粒劑，購自江陰天江藥業(yè)有限公司。

1.1.3 儀器 ECG-1150型心電圖機(jī)(上海光電醫(yī)用電子儀器有限公司)；DH-150型動(dòng)物人工呼吸機(jī)(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)儀器有限公司)；DT5000A型電子分析天平[梅特勒-托利多國際貿(mào)易(上海)有限公司]；318型洗板機(jī)(上海三科儀器有限公司)；DK-8B型電熱恒溫水槽(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；ELX808吸收光酶標(biāo)儀(上海啟步生物科技有限公司)；NiKon E200光學(xué)顯微鏡；低溫冰箱(日本三洋公司)；低溫離心機(jī)(日本三洋公司)；冰凍切片機(jī)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 分組 健康SD大鼠50只，隨機(jī)分為5組，分別為：空白組(N)、假手術(shù)組(Sham)、單純?nèi)毖俟嘧⒔M(I/R)、芪桂益脈靈低劑量組(QGYMLL)、芪桂益脈靈高劑量組(QGYMLH)。每組10只，最終隨機(jī)每組入組8只,相同條件下進(jìn)行飼養(yǎng)。

1.2.2 給藥 5組大鼠分別按照下列給藥方法用藥7 d。每日清晨N組、Sham組、I/R組均予空腹灌服0.9%氯化鈉注射液2 mL、QGYMLL組空腹灌服低劑量芪桂益脈靈(0.6 g/kg)2 mL、QGYMLH組空腹灌服高劑量芪桂益脈靈(1.2 g/kg) 2 mL。

1.2.3 造模 按上述末次給藥60 min后進(jìn)行造模。大鼠用20%烏拉坦(1 g/kg)腹腔麻醉。麻醉后進(jìn)行心電監(jiān)測，氣管切開，連呼吸機(jī)(呼吸頻率為90次/min，潮氣量為12 mL，呼吸比為1∶1)。于胸骨左緣3、4肋間，切開皮膚，長度約2 cm，逐層分離皮下組織和肌肉，打開胸腔及心包膜,擠出心臟；在肺動(dòng)脈圓錐與左心耳交界處結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支，將結(jié)扎后的心臟放回胸腔內(nèi)。連續(xù)記錄冠狀動(dòng)脈結(jié)扎前后及再通后Ⅱ?qū)?lián)心電圖。N組：只開胸，不穿線，不結(jié)扎；Sham組：開胸，只穿線但不結(jié)扎；I/R組行左主冠狀動(dòng)脈結(jié)扎60 min，再灌注180 min；QGYMLH組、QGYMLL組方法同I/R組。模型成功標(biāo)準(zhǔn):心電示S-T段呈近似單線曲線拱背向上抬高;并見再灌注后心律失常。

1.3 觀察指標(biāo)及方法 (1)MMP-9：造模成功后，于腹主動(dòng)脈采血5 mL，離心后取上層血清備用，按照MMP-9試劑盒檢測方法檢測大鼠MMP-9含量。(2)磷酸化c-Jun氨基末端蛋白激酶(P-JNK)：摘取大鼠心臟，剔除周圍結(jié)締組織，采用0.9%氯化鈉注射液沖洗血液，用4%中性福爾馬林固定備用，應(yīng)用蘇木精-伊紅(HE)染色法觀察心肌病理學(xué)變化；免疫組化法檢測心肌組織中JNK信號(hào)通路表達(dá)，方法：①脫蠟、水化組織切片；②根據(jù)應(yīng)用的一抗的特殊要求，對(duì)組織切片進(jìn)行預(yù)處理；③3%H2O2去離水孵育10 min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶；④PBS沖洗，2 min 3次；⑤滴加一抗試劑，室溫孵育1～2 h，PBS沖洗，2 min 3次；⑥滴加Primary Antibody Enhancer(增強(qiáng)子),37 ℃孵育10～20 min，PBS沖洗，2 min 3次；⑦滴加二抗試劑,37 ℃孵育10～20 min，PBS沖洗，2 min 3次；⑧應(yīng)用DAB溶液顯色；⑨自來水充分沖洗、復(fù)染、脫水、透明、封片，顯微鏡觀察。在400倍顯微鏡下拍攝切片圖像，每張圖片選3個(gè)不重疊視野計(jì)算平均陽性百分比。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠心肌組織病理形態(tài)學(xué)改變(HE染色) N組、Sham組肌纖維排列相對(duì)規(guī)則，細(xì)胞核呈橢圓形，間質(zhì)未見明顯異常；I/R組心肌組織細(xì)胞嚴(yán)重破壞，心肌細(xì)胞間質(zhì)明顯水腫、增寬，心肌纖維斷裂溶解；QGYML組與I/R組相比有明顯緩解，其中QGYMLH組改善更為明顯。見圖1。

圖1 各組大鼠心肌病理學(xué)變化(HE×400)

2.2 各組大鼠P-JNK表達(dá)的免疫組化結(jié)果 N組、Sham組未見顯著異常，肌纖維排列相對(duì)規(guī)則，細(xì)胞核橢圓形，間質(zhì)未見明顯異常；I/R組心肌組織細(xì)胞嚴(yán)重破壞，心肌細(xì)胞間質(zhì)明顯水腫、增寬，心肌纖維斷裂溶解；QGYML組與I/R組相比，細(xì)胞間質(zhì)水腫現(xiàn)象明顯減輕，心肌纖維排列較為規(guī)則，其中QGYMLH組改善更為明顯。見圖2。

圖2 各組大鼠P-JNK表達(dá)的免疫組化結(jié)果(×400)

2.3 各組大鼠MMP-9、P-JNK表達(dá)比較 見表1。

組 別nMMP-9(ng/L)P-JNK(%)N組833.07162±1.4319690.78±0.03Sham組835.32275±1.163989*1.00±0.02*I/R組844.16338±1.353010△2.13±0.13△QGYMLL組841.24712±0.687672△#1.23±0.11△#QGYMLH組838.54413±1.286125△#○1.12±0.08△#○

與N組比較，*P>0.05，△P<0.05；與I/R組比較，#P<0.05；與QGYMLL組比較，○P<0.05

由表1可見，Sham組MMP-9、P-JNK表達(dá)水平與N組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；I/R組、QGYMLL組、QGYMLH組MMP-9、P-JNK表達(dá)水平均高于N組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；QGYML組、QGYMLH組MMP-9、P-JNK表達(dá)水平均低于I/R組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；QGYMLH組MMP-9、P-JNK表達(dá)水平低于QGYMLL組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 討 論

心肌的缺血再灌注損傷,尤其在急性心肌梗死通過經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入術(shù)(PCI)治療后, 可能出現(xiàn)一系列病情惡化現(xiàn)象，患者可能表現(xiàn)為嚴(yán)重心功能不全、嚴(yán)重心律失常、心功能衰竭、心源性休克、猝死等[7]?？蛇M(jìn)一步發(fā)生心室重構(gòu), 嚴(yán)重者會(huì)引起心力衰竭、心臟破裂等嚴(yán)重并發(fā)癥，嚴(yán)重影響急性冠狀動(dòng)脈綜合征的預(yù)后[8]。目前研究表明，心肌的缺血再灌注損傷與炎性介質(zhì)密切相關(guān)。JNK家族是絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)超家族成員之一，JNK信號(hào)通路可被多種因素激活，JNK的活化被認(rèn)為其參與了細(xì)胞凋亡，其一旦被激活稱為P-JNK，則會(huì)由細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，引起一系列作用底物的激活，與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)[9]。JNK是一種具有多方面調(diào)節(jié)功能的蛋白激酶，在發(fā)生心肌缺血再灌注損傷時(shí)，JNK信號(hào)通路被激活，參與再灌注損傷時(shí)的炎性反應(yīng)[10]。JNK蛋白激酶有3個(gè)基因編碼，其表達(dá)廣泛，在生理和病理過程中發(fā)揮重要作用[11]。MMPs是一組金屬蛋白酶家族，常以酶原的形式存在，主要參與細(xì)胞外基質(zhì)的微環(huán)境的穩(wěn)定，目前MMPs已經(jīng)被證實(shí)參與多種病理及生理過程[12]。近來研究發(fā)現(xiàn)MMPs快速參與缺血再灌注損傷等氧化應(yīng)激反應(yīng), 同時(shí)有研究發(fā)現(xiàn)其抑制劑能有效抑制心肌缺血再灌注后損傷的發(fā)生[13]。MMP-9又被稱為明膠酶B，是MMPs家族中的主要成員，目前研究發(fā)現(xiàn)血清中MMP-9濃度的增加與冠狀動(dòng)脈事件發(fā)生的危險(xiǎn)程度呈正相關(guān)。心肌缺血再灌注后組織表達(dá)MMP-9是心肌小血管管壁損傷,從而導(dǎo)致細(xì)胞水腫及炎性細(xì)胞浸潤的機(jī)制。在早期選擇性抑制MMP-9可顯著減輕心肌梗死面積[14]。

心肌缺血再灌注損傷屬中醫(yī)胸痹范疇，胸痹一名最早見于《內(nèi)經(jīng)》，屬本虛標(biāo)實(shí)，病機(jī)關(guān)鍵為心脈攣急和閉塞，氣虛血瘀為該病的基本病機(jī)之一[15]。針對(duì)該病機(jī)，徐京育教授根據(jù)多年臨床經(jīng)驗(yàn)自擬中藥復(fù)方芪桂益脈靈。方中黃芪補(bǔ)氣升陽，益氣補(bǔ)心,能通行血脈，為治療氣滯血瘀型胸痹心痛的要藥；桂枝溫通經(jīng)脈，助陽化氣；二者相互配伍，共為君藥以補(bǔ)心氣，通心脈。黨參益氣養(yǎng)血，助黃芪補(bǔ)氣養(yǎng)心行氣活血；三七活血止痛，化瘀養(yǎng)血，行血通脈；二者在補(bǔ)氣的基礎(chǔ)上，活血化瘀通脈，故為臣藥。五味子、炒酸棗仁、龍齒養(yǎng)心陰，斂心氣，麥冬滋陰為佐藥。又恐全方滋補(bǔ)太過，故以苦參、黃連佐制，清心火、安神為使。此外桂枝、五味子、龍齒、三七、黃連等均入心經(jīng)，作為引經(jīng)藥，引藥入心。本方著重扶正氣，助血運(yùn)，提高機(jī)體抗缺血缺氧的能力。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，缺血再灌注損傷后大鼠心肌組織中MMP-9和P-JNK表達(dá)明顯高于N組和Sham組，說明心肌的急性缺血再灌注能夠使炎癥因子釋放，JNK通路激活，也表明建模成功；芪桂益脈靈組MMP-9和P-JNK表達(dá)濃度明顯低于I/R組(P<0.05)，表明芪桂益脈靈能夠降低JNK的磷酸化水平，降低炎癥因子MMP-9的釋放，減輕心肌缺血再灌注心肌細(xì)胞凋亡，對(duì)缺血心肌有保護(hù)作用；而QGYMLH組的MMP-9和P-JNK表達(dá)水平較QGYMLL組更低，說明高劑量組更能降低受損心肌，對(duì)其保護(hù)作用更佳。本研究不僅可以證實(shí)MMP-9和P-JNK的表達(dá)與心肌受損程度相關(guān)，還證明了芪桂益脈靈在心肌缺血再灌注損傷后對(duì)心肌具有一定的保護(hù)作用。

綜上所述，芪桂益脈靈能夠很好地減輕缺血再灌注心肌組織MMP-9炎癥因子的釋放及JNK信號(hào)通路激活造成的影響，改善缺血心肌病理性改變，也進(jìn)一步證實(shí)了芪桂益脈靈在急性心肌缺血中具有保護(hù)作用，對(duì)新藥的研究與開發(fā)提供了理論依據(jù)。

[1] 陳波，鄭軍，李書霖，等.抗凝護(hù)心Ⅱ號(hào)對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷血清cTn-T含量的影響[J].中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2011,39(4)：47-48.

[2] 李雪飛,江洪,胡笑容,等.橙皮苷減輕大鼠心肌缺血/再灌注損傷所致的炎癥反應(yīng)[J].武漢大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版,2016,37(3):390-394.

[3] 徐麗,張?jiān)?曹軍平.芒果苷對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制研究[J].藥物評(píng)價(jià)研究,2016,39(2):198-201.

[4] 胡滿燕,吳珍妮,龍子江,等.欣怡膠囊對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷后炎癥及氧化應(yīng)激的影響[J].中成藥,2016,38(2):406-409.

[5] 李佳,何俊.大株紅景天注射液對(duì)心肌缺血-再灌注損傷的保護(hù)作用及機(jī)制的臨床研究[J].中藥藥理與臨床,2016,32(1):175-178.

[6] 付振虹,董蔚,蓋魯粵,等.促紅細(xì)胞生成素聯(lián)合粒細(xì)胞集落刺激因子治療大鼠急性心肌梗死[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2011,31(1):17-22.

[7] 岳峰，張陳勻，續(xù)自靈.急診PCI術(shù)后心肌缺血再灌注損傷的臨床表現(xiàn)及分析[J].中國現(xiàn)代醫(yī)生，2008，46(15)：94-96.

[8] 陳永豐，王峰，徐京育，等.芪桂益脈靈預(yù)處理對(duì)缺血再灌注大鼠心肌細(xì)胞凋亡基因Fas及Bcl-2表達(dá)的影響[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2009,7(1)：48-49.

[9] 孫琳琳，徐京育，趙志成，等.芪桂益脈靈對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷模型一氧化氮的影響及其心肌保護(hù)機(jī)制探討[J].中國社區(qū)醫(yī)師：醫(yī)學(xué)專業(yè)，2008,10(7)：104-105.

[10] 王峰，陳永豐，吳玉萍，等.芪桂益脈靈對(duì)缺血再灌注型大鼠心肌細(xì)胞蛋白激酶C的影響[J].中國中醫(yī)藥科技，2008,15(6)：405.

[11] 劉利兵,張海鋒.決明子提取物減輕2型糖尿病大鼠心肌缺血/再灌注損傷[J].基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床,2015,35(1):1-6.

[12] 李鑫輝,黃政德,喻嶸,等.益氣活血法對(duì)血瘀證心肌缺血再灌注損傷兔血液流變性及內(nèi)皮素的影響[J].中國中醫(yī)急癥,2010,19(2):269-271.

[13] 胡敏霞，周密妹，胡先敏，等.丹參酮ⅡA對(duì)腦缺血再灌注大鼠腦損傷的保護(hù)作用及對(duì)能量代謝的影響[J].中國臨床藥學(xué)雜志，2006,15(3):176-179.

[14] 張代富，阮長武，劉中民，等.丹參對(duì)大鼠急性心肌缺血再灌注時(shí)心肌細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響[J].上海醫(yī)學(xué),2003,26(9):669-670.

[15] 李祖純，夏禎蕓.丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液對(duì)急性心肌梗死再灌注治療后左心功能的影響[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2006,3(24):88-89.

(本文編輯：李珊珊)

Effects of Qigui-yimailing on the expression of matrix metalloproteinase-9 and c-Jun amino terminal protein kinasein in rats with myocardial ischemia reperfusion injury

ZHAOLong*,ZHANGChaoyue,XUJingyu.

*2014-GradeMasterofHeilongjiangUniversityofTraditionalChineseMedicine,Heilongjiang,Haerbin150040

Objective To observe the effects of Qigui-yimailing on the signal pathway of matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) and c-Jun amino terminal protein kinase (JNK) in rats with myocardial ischemia reperfusion injury. Methods 50 healthy male SD rats were randomly divided into normal group (N), sham-operated group (Sham), pure ischemia reperfusion group (I/R), high dose of Qigui-yimailing group (QGYMLH) and low dose of Qigui-yimailing group (QGYMLL), 10 rats each group, rats in last three group were received 0.9% sodium chloride injection, high and low dose of Qigui-yimailing respectively, continuously treatment for 7 d. The acute myocardial infarction model was established by ligating the left anterior descending coronary arteries. The blood was collected from the abdominal aorta, the upper serum was taken by centrifugal, and the expression of MMP-9 was measured by ELISA. The expression of phosphorylation c-Jun amino terminal protein kinase (P-JNK) from formalin-fixed myocardial tissue was measured by means of immunohistochemical staining. Results There were no statistical differences on the expressions of MMP-9 and P-JNK between Sham and N group (P>0.05).The expressions of MMP-9 and P-JNK in I/R, QGYMLL and QGYMLH group were higher than N group (P<0.05). The expressions of MMP-9 and P-JNK in QGYMLL and QGYMLH group were lower than I/R group (P<0.05). The expressions of MMP-9 and P-JNK in QGYMLH group were lower than QGYMLL group (P<0.05). Conclusion Qigui-yimailing has protective effect of myocardial ischemia-reperfusion injury, and its mechanism may be related with the degree of JNK phosphorylation, the MMP-9 expression and the dosage of drug.

Huangqi; Guizhi; Myocardial ischemia-reperfusion injury; Rats; JNK mitogen - activated protein kinases; Matrix metalloproteinases

10.3969/j.issn.1002-2619.2017.02.026

※ 項(xiàng)目來源：2013年度黑龍江省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(編號(hào)：H201326)

趙龍(1990—)，男，碩士研究生在讀，學(xué)士。研究方向：心血管方向。

R285.5；R-33

A

1002-2619(2017)02-0264-05

2016-07-15)

△ 通訊作者：黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院心血管病四科，黑龍江 哈爾濱 150040