陳獻東　　陳茂華　　巴華君　　林群　　戴君俠

[摘要] 目的 分離鑒定CD133+腫瘤干細胞，初步分析MRP-1、MDR1、GST-π在CD133+膠質(zhì)瘤干細胞多藥耐藥性中的作用。 方法 采用膠質(zhì)瘤U251細胞系，磁珠分離、培養(yǎng)CD133+膠質(zhì)瘤干細胞，RT-PCR技術(shù)分析MRP-1、MDR1、GST-π在CD133+膠質(zhì)瘤干細胞中的表達。 結(jié)果 培養(yǎng)的膠質(zhì)母細胞瘤干細胞表達干細胞標記物Nestin，分化后細胞表達GFAP、β-tubulin；MRP-1、MDR1、GST-π在CD133+膠質(zhì)瘤干細胞中呈高表達，與CD133-膠質(zhì)瘤干細胞比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。 結(jié)論 培養(yǎng)、鑒定膠質(zhì)母細胞瘤腫瘤干細胞，MRP-1、MDR1、GST-π在CD133+膠質(zhì)瘤干細胞中呈高表達，為下一步研究奠定基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞] 膠質(zhì)母細胞瘤；腫瘤干細胞；CD133；耐藥

[中圖分類號] R739.4 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2017）05-0012-03

腦膠質(zhì)瘤是常見的原發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，約占中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤的78%，占成人中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的50%，是惡性程度最高也是最具侵襲性的腫瘤之一[1，2]。目前腦膠質(zhì)瘤治療主要以最大限度切除實體腫瘤，術(shù)后輔以替莫唑胺化療?；熓悄壳爸委熌z質(zhì)瘤及改善預(yù)后的重要手段，但目前的治療效果仍達不到滿意，其中主要原因是腫瘤細胞的耐藥性[3]。CD133是腫瘤干細胞和神經(jīng)干細胞的特異性標志物，相關(guān)研究顯示CD133+細胞具有較強的致瘤能力，CD133+細胞的多藥耐藥性明顯增強[4]。而MRP-1、MDR1在異質(zhì)性膠質(zhì)瘤的腦腫瘤干細胞中的高表達是臨床內(nèi)在性耐藥和個體耐藥的主要原因之一[5]。而GST-π作為腫瘤轉(zhuǎn)化的標志物之一，能夠催化谷胱甘肽與親電性的抗癌藥物結(jié)合，通過活性將抗癌藥物排出細胞，增強腫瘤的耐藥性[6]。本研究初步分析MRP-1、MDR1及GST-π在CD133+腫瘤干細胞中的表達，為進一步研究確切的耐藥機制及逆轉(zhuǎn)耐藥提供前期基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料與試劑

U251細胞系（廣州賽業(yè)生物科技公司，貨號：HCGUI-30001），DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）購自Hyclone公司，胰蛋白酶（Gibco公司）、免疫磁珠（CD133+）細胞分選試劑盒、免疫磁珠分選儀購自Miltenyi Biotec公司，CO2恒溫培養(yǎng)箱、-80℃超低溫冰箱。

1.2 U251細胞復(fù)蘇及培養(yǎng)

將保存人腦 U251 細胞的凍存管從-80℃冰箱中取出，立即置于37℃恒溫水浴中，輕輕搖動凍存管使管內(nèi)凍存液快速融化；將含U251細胞的凍存液移入15 mL無菌離心管中，加入約 5 mL含血清培養(yǎng)基，1000 r/min 離心5 min，棄掉上清液；加入約 3 mL含血清培養(yǎng)基重懸細胞，無菌透氣培養(yǎng)瓶中，置于37℃、體積分數(shù) 5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；觀察細胞的生長情況，每3日更換一次培養(yǎng)液；將U251細胞在含10%的胎牛血清、青霉素 100 U/mL和鏈霉素100 μg/mL的DMEM 完全培養(yǎng)基中進行單層培養(yǎng)，置于37℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)傳代。隔日換液1次，每次添加 4 mL培養(yǎng)基，每隔3 d進行細胞傳代。

1.3 CD133+膠質(zhì)瘤干細胞分選

收集培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)的球樣U251細胞，胰酶消化、離心后制備單細胞懸液，200 μm濾網(wǎng)過濾并計數(shù)。參照免疫磁珠（CD133+）細胞分選試劑盒、免疫磁珠分選儀操作說明進行。

1.4 CD133+膠質(zhì)瘤干細胞培養(yǎng)及鑒定

將對數(shù)生長期的U251細胞用0.25%胰蛋白酶消化、離心后吹打成單細胞懸液，分別用無菌PBS液和DMEM/F12重懸細胞漂洗1遍，接種到含有EGF （20 ng/mL）、bFGF（20 ng/mL）、LIF（10 ng/mL）、B27（1×）的 DMEM/F12無血清培養(yǎng)基，置于37℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞鑒定：取膠質(zhì)瘤干細胞植入包被有多聚賴氨酸的玻片上，晾干，用PBS沖洗除去殘留培養(yǎng)基；經(jīng)4%多聚甲醛固定，5%山羊血清封閉；分別加入Nestin、β-tubulin 和 GFAP一抗，4℃過夜，加入FITC標記二抗，熒光顯微鏡鏡檢。

1.5 RT-PCR檢測MRP-1、MDR1、GST-π mRNA的表達分析

采用Primer Premier v5軟件設(shè)計MRP-1、MDR1、GST-π引物序列。MRP1 正義鏈：5'-GCAGGGCTACTTCTACACCG-3'，反義鏈：5'-TCATCGCCATCACAGCATTG-3'；MDR1：正義鏈：5'-CCCATCATTGCAATAGCAGG-3'，反義鏈：5'-GTTCAAACTTCTGCTCCTGA-3'；GST-π：正義鏈：5'-CCAATACCATCCTGCGTCAC-3'，反義鏈：5'-TCACTGTTTCCCGTTGCCCAT-3'。后收集細胞，參照相應(yīng)試劑盒說明書提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄提取cDNA，配制PCR 反應(yīng)體系（20 μL）進行PCR反應(yīng)。以相同來源的β-actin為內(nèi)部參照，相對基因表達量=2-△△CT（△Ct=Ct 靶基因-Ct β-actin，△△Ct=△Ct試驗組-△Ct 對照組），每個檢測重復(fù)3次，計算 MRP-1、MDR1、GST-π mRNA表達量。

1.6統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以（x±s）表示，多組樣本均數(shù)比較先進行正態(tài)分布及方差齊性檢驗，呈正態(tài)分布及方差齊性組間比較采用獨立樣本t檢驗，呈正態(tài)分布但方差不齊組間比較采用近似t檢驗，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1膠質(zhì)瘤干細胞的鑒定

膠質(zhì)瘤U251干細胞經(jīng)過Nestin、β-tubulin和GFAP熒光染色進行鑒定，結(jié)果U251干細胞球顯示綠色熒光，呈強陽性表達。經(jīng)過行GFAP和β-tubulin檢測結(jié)果膠質(zhì)瘤干細胞球未顯示綠色熒光，呈陰性表達，經(jīng)過培養(yǎng)基中誘導(dǎo)分化7 d后，膠質(zhì)瘤U251干細胞GFAP、β-tubulin染色則細胞均顯示綠色熒光，呈強陽性表達，見封三圖6。

2.2 RT-PCR 檢測MRP-1、MDR1、GST-π mRNA的表達分析

RT-PCR研究結(jié)果顯示MRP-1、MDR1、GST-π在CD133+腫瘤干細胞中呈高度表達，而在CD133-細胞中表達顯著低于CD133+細胞，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）.

3 討論

膠質(zhì)母細胞瘤是中樞系統(tǒng)常見原發(fā)性腫瘤，患者雖及時接受完整的放療和化療聯(lián)合治療，預(yù)后仍較差，生存期僅為12～18個月。盡管手術(shù)器械和手術(shù)方法已經(jīng)得到極大改進，術(shù)后放療和化療等綜合治療措施也有明顯改善，膠質(zhì)母細胞瘤患者的中位生存時間仍無明顯延長[7，8]。因此對膠質(zhì)母細胞瘤的研究將具有持續(xù)的挑戰(zhàn)性。鑒于膠質(zhì)母細胞瘤是高度血管化的腫瘤，腫瘤的血管在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移中起著重要的作用，因此，對膠質(zhì)母細胞瘤的血管及其內(nèi)皮細胞進行研究顯得非常有意義。

以往研究認為，惡性腫瘤的生長依賴于腫瘤的血管生成。據(jù)此，有學(xué)者提出研發(fā)抗腫瘤血管生成藥物達到治療腫瘤的目的。但是，臨床實踐證明，這些藥物的抗腫瘤效果非常有限并且容易獲得耐藥性[9-11]。因此，為研發(fā)更有效的抗腫瘤血管藥物，我們需要對腫瘤的內(nèi)皮細胞進行更深入的研究。研究證實在多種實體瘤中均含有極少數(shù)干細胞樣的細胞，它們具有無限增殖、自我更新、多向分化的潛能及高致瘤性，這種干細胞樣細胞被稱為腫瘤干細胞。通過體外培養(yǎng)膠質(zhì)瘤干細胞研究發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)瘤干細胞具有自我增殖、多元分化的潛能。國外研究人員將膠質(zhì)瘤干細胞與神經(jīng)干細胞比較，膠質(zhì)瘤干細胞的自我更新能力以及增殖能力均明顯強于神經(jīng)干細胞[12，13]。CD133+細胞在干細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)具有不斷增殖、自我更新和分化的能力。我們在U251細胞系中分選CD133+細胞，實驗顯示其在無血清干細胞培養(yǎng)基中可以自我更新、無限增殖。經(jīng)鑒定，分選獲取的 CD133+細胞為膠質(zhì)瘤干細胞。

MRP基因位于16p13.1染色體上，相關(guān)研究顯示MRP能夠通過改變胞漿和細胞器的pH值，降低藥物到達作用部位的濃度，并且能夠逆濃度梯度減少胞內(nèi)藥物濃度進而導(dǎo)致細胞耐藥的發(fā)生，它同時也是一種ATP依賴泵，可以通過促進谷胱甘肽結(jié)合藥物排出細胞外而減少細胞內(nèi)藥物的濃度，最終導(dǎo)致腫瘤耐藥的發(fā)生[11]。而MRP-1、MRP-3基因在膠質(zhì)瘤干細胞中的表達明顯增多，與腫瘤耐藥之間的關(guān)系相對肯定，已經(jīng)成為研究和解決腫瘤耐藥現(xiàn)象的重要靶位[14-16]。MDR1作為ABC超家族中的轉(zhuǎn)運體多藥耐藥蛋白1能夠逃脫藥物的殺傷作用，從而導(dǎo)致化療后腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[17]。GST是一組與機體解毒作用有關(guān)的酶類，其中以GST-π與惡性腫瘤關(guān)系最為密切。GST-π以催化方式降解藥物，以降低抗腫瘤藥物的細胞毒作用而產(chǎn)生耐藥性[18-20]。本研究結(jié)果證實MRP-1、MDR1、GST-π在CD133+細胞中呈現(xiàn)高表達，提示CD133+細胞的耐藥機制可能與MRP-1、MDR1、GST-π表達增強有一定的關(guān)系，有可能成為膠質(zhì)瘤干細胞治療的新靶點，為進一步研究腫瘤的耐藥機制以及腫瘤靶向治療藥物提供支持。

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（收稿日期：2016-12-14）