李彩霞，張淑坤，李志剛，司傳領(lǐng)

實(shí)驗(yàn)研究

核桃青皮粗提物誘導(dǎo)KYSE150食管癌細(xì)胞周期阻滯及凋亡

李彩霞1，張淑坤1，李志剛2，司傳領(lǐng)3

目的：研究核桃青皮粗提物誘導(dǎo)KYSE150人食管癌細(xì)胞周期阻滯和凋亡的作用機(jī)制。方法：MTT方法檢測(cè)核桃青皮粗提物對(duì)KYSE150細(xì)胞增殖的抑制效果，流式細(xì)胞儀檢測(cè)核桃青皮粗提物對(duì)KYSE150細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的影響，Western blot檢測(cè)核桃青皮粗提物引起的細(xì)胞周期相關(guān)蛋白和凋亡相關(guān)蛋白的變化。結(jié)果：MTT結(jié)果顯示，核桃青皮粗提物對(duì)KYSE150細(xì)胞的增殖抑制呈時(shí)間和濃度依賴性，當(dāng)核桃青皮粗提物濃度為100 μg/mL時(shí)，在24 h，48 h和72 h對(duì)KYSE150細(xì)胞的增殖抑制率分別為(43.69±1.02)%，(88.73±1.32)%和(93.06±2.34)%；流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明，核桃青皮粗提物誘導(dǎo)KYSE150細(xì)胞周期阻滯和凋亡；Western blot結(jié)果表明，核桃青皮粗提物通過上調(diào)p53，phospho-p53(p-p53)蛋白的表達(dá)，下調(diào)cyclinD1蛋白的表達(dá)，誘導(dǎo)KYSE150細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期。另一方面，核桃青皮粗提物通過上調(diào)Bax蛋白,下調(diào)Bcl-2和Caspase-3蛋白的表達(dá)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。當(dāng)核桃青皮粗提物濃度為40 μg/mL時(shí)，可上調(diào)p53，p-p53，Bax的表達(dá)量分別為對(duì)照組的（1.8±0.07），（23.6±0.12）和（1.5±0.02）倍，下調(diào)cyclinD1，Bcl-2和Caspase-3的表達(dá)量分別為對(duì)照組的（0.3±0.02），（0.03±0.005）和（0.1±0.01）倍。結(jié)論：核桃青皮粗提物可以引發(fā)KYSE150細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，并且可以通過線粒體途徑誘導(dǎo)KYSE150細(xì)胞凋亡。

核桃青皮粗提物；KYSE150細(xì)胞；增殖；周期；凋亡

食管癌在各類腫瘤的發(fā)病率中排名第八，其死亡率在癌癥總死亡率中占第四位[1]。近年來，由于化學(xué)藥物毒副作用較大，限制了在臨床上的廣泛應(yīng)用，所以從植物中尋找更安全的抗癌有效成分越來越受人們重視。核桃青皮又稱青龍衣，為核桃外部厚厚的一層未成熟的果皮。白桃湯劑為民間抗癌藥方，而核桃青皮就是此湯劑的主要成分之一[2]。核桃青皮很久以前就已經(jīng)被用于治療不同的疾病，如胃癌、肺癌[3-5]。研究已經(jīng)證明，核桃青皮的提取物具有很強(qiáng)的抗菌和抗氧化活性[6-7]。我們先前的研究表明，核桃青皮提取物中的粗提取，乙酸乙酯提取物和沒食子酸對(duì)食管癌KYSE150和EC9706細(xì)胞的增殖均有抑制作用，并初步探討了其可能的作用機(jī)制[8]。本研究在之前的基礎(chǔ)上，集中探討核桃青皮粗提物對(duì)食管癌細(xì)胞KYSE150的增殖抑制作用，以及其對(duì)KYSE150細(xì)胞周期和凋亡的影響，并且進(jìn)一步探討其對(duì)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白和凋亡相關(guān)蛋白的變化，從而為進(jìn)一步開發(fā)治療食管癌的中藥提取物提供更多的理論根據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞 食管癌細(xì)胞株KYSE150（天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院肺癌研究所提供）。用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液于37℃、5%CO2的孵箱中培養(yǎng)細(xì)胞，每1～2 d傳代1次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞。

1.2 藥物 核桃青皮用95%的乙醇萃取4次，風(fēng)干得到微細(xì)粉末即為核桃青皮粗提物。

1.3 主要試劑 胎牛血清（Hyclone）、RPMI-1640培養(yǎng)基（Hyclone）、胰蛋白酶、四甲基偶氮唑鹽(MTT)、二甲基亞楓（DMSO）、DNase free RNase（Thermo Fisher）、Annexin V-FITC/PI Apoptosis Detection Kits(北京四正柏生物公司，凋亡試劑盒批號(hào)：FXP018，周期試劑盒批號(hào)：FXP021)、RIPA細(xì)胞裂解液和BCA蛋白定量試劑盒（索萊寶）、一抗兔抗人Caspase 3、小鼠抗人p53和兔抗人p-p53(Santa Cruz),一抗兔抗人Bax,兔抗人Bcl-2，小鼠抗人cyclinD1和兔抗人GAPDH（Cell Signaling）抗體，HRP標(biāo)記的羊抗兔Ig G二抗，HRP標(biāo)記的羊抗小鼠Ig G二抗。

1.4 MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖情況 將80 mg核桃青皮粗提物溶于1 mL的DMSO中，配成80 mg/mL儲(chǔ)存濃度，用時(shí)稀釋。取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的KYSE150，以每孔5000個(gè)細(xì)胞/100 μL密度接種于96孔板中，培養(yǎng)24 h，棄去培養(yǎng)液，分別加入含不同濃度的核桃青皮粗提物的培養(yǎng)液100 μL，濃度分別為5、10、20、30、 40、50、60、80、100 μg/mL，另設(shè)對(duì)照孔(加培養(yǎng)液100 μL和與溶解藥物等量的DMSO)，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞分別培養(yǎng)24、48和72 h后，每孔加入5 mg/mL MTT液10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸去上清，每孔加入DMSO 150 μL，輕輕振蕩后用酶標(biāo)儀檢測(cè)，570 nm處測(cè)各孔吸光值(OD值)，計(jì)算抑制率，細(xì)胞增殖抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值)×100%。重復(fù)3次。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期的變化 將KYSE150細(xì)胞接種于六孔板，密度為3×105/孔，使用不同濃度的核桃青皮粗提物（0、10、20、40 μg/mL）處理，培養(yǎng)24 h后,收集各組全部細(xì)胞到15 mL離心管中，預(yù)冷的PBS洗2次，然后加入1 mL預(yù)冷的70%乙醇4℃固定細(xì)胞過夜，再用PBS洗滌2次后收集細(xì)胞于流式管，加入預(yù)先配置好的含有RNase A和PI的染色液0.4 mL，緩慢并充分重懸細(xì)胞沉淀，37℃避光溫浴30 min后，用流式細(xì)胞儀在激發(fā)波長(zhǎng)488 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)紅色熒光，同時(shí)檢測(cè)光散射情況。重復(fù)3次。

1.6 Annexin V-FITC/PI雙染色法檢測(cè)細(xì)胞的凋亡率 KYSE150細(xì)胞分組及加藥情況同1.5，24 h后離心收集細(xì)胞。以PBS洗滌2次后加入250 μL結(jié)合緩沖液重新懸浮細(xì)胞于流式管中，再加入5 μL Annexin V/FITC混勻后加入10 μL 120 μg/mL的PI溶液，設(shè)置空白對(duì)照組和單色對(duì)照組。混勻后室溫避光孵育15 min，在反應(yīng)管中加300 μL PBS，混勻后使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。重復(fù)3次。

1.7 Western blot檢測(cè)細(xì)胞周期凋亡和細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況 分組及加藥情況同1.5，孵育24 h，提取各組細(xì)胞總蛋白，BCA蛋白定量后，取35 μg蛋白與上樣緩沖液混勻，使用SDS-PAGE法對(duì)變性后的蛋白進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜后室溫封閉2 h，一抗分別為p53（1∶100）、p-p53（1∶100）、cyclin D1（1∶1000）、Caspeas-3（1∶100）、Bax（1∶500）和Bcl-2（1∶500），4℃孵育過夜。使用TBST洗膜5次，二抗羊抗小鼠或羊抗兔（1∶5000）37℃孵育2 h。再用TBST洗膜5次后使用ECL進(jìn)行顯色，隨后使用BIO-RAD膠成像儀曝光，檢測(cè)條帶灰度值（蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的條帶灰度/內(nèi)參條帶灰度×100%）。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0軟件分析統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，計(jì)量資料符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，采用單因素方差分析法進(jìn)行組間比較，兩兩比較采用q檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 核桃青皮粗提物對(duì)KYSE150細(xì)胞增殖的抑制作用 隨著核桃青皮粗提物作用時(shí)間的延長(zhǎng)，KYSE150細(xì)胞的增殖受到抑制，且抑制作用呈時(shí)間劑量依賴性（見圖1A）。對(duì)照組KYSE150細(xì)胞生長(zhǎng)活躍，經(jīng)核桃青皮粗提物5～100 μg/mL處理48 h后，KYSE150細(xì)胞生長(zhǎng)逐漸緩慢，增殖抑制率從（0.69± 2.27）%升高至（85.73±1.32）%。核桃青皮粗提物能有效的抑制KYSE150細(xì)胞的增殖，與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見圖1B）。

圖1 核桃青皮粗提物對(duì)食管癌細(xì)胞KYSE150增殖的抑制作用

2.2 核桃青皮粗提物誘導(dǎo)KYSE150細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期 核桃青皮粗提物對(duì)食管癌細(xì)胞株KYSE150作用24 h后，與對(duì)照組比較，不同濃度的核桃青皮粗提物均使細(xì)胞阻滯在G0/G1期的比例升高，同時(shí)S、G2/M期比例減少。并且核桃青皮粗提物的濃度越高，阻滯在G0/G1期的細(xì)胞比例就越高，（見表1）。

表1 核桃青皮粗提物對(duì)食管癌細(xì)胞株KYSE150細(xì)胞周期的影響（±s，%，n=3）

表1 核桃青皮粗提物對(duì)食管癌細(xì)胞株KYSE150細(xì)胞周期的影響（±s，%，n=3）

注：與對(duì)照組比較，aP＜0.01；與10 μg/mL濃度組比較，bP＜0.01；與20 μg/mL濃度組比較，cP＜0.01

組別對(duì)照組核桃青皮粗提物組質(zhì)量濃度（μg/mL）0 10 20 40 G0/G1期S期G2/M期32.58±0.003 37.42±0.496a 40.48±0.832a、b 42.51±1.010a、b、c 47.10±0.014 46.87±1.184 45.29±1.137 41.49±1.138a、b、c 20.33±0.013 16.24±0.780a 14.22±1.320a 15.99±1.080a、b、c

圖2 不同濃度核桃青皮粗提物對(duì)KYSE150細(xì)胞凋亡的影響

2.3 核桃青皮粗提物誘導(dǎo)KYSE150細(xì)胞凋亡 不同濃度（10、20、40 μg/mL）的核桃青皮粗提物作用于KYSE150細(xì)胞24 h后，細(xì)胞早期凋亡率分別為（14.44±2.98）%、（21.07±2.64）%、（29.59±3.75）%，與對(duì)照組（8.56±0.44）%相比明顯升高（P＜0.05）。見圖2。 2.4 核桃青皮粗提物對(duì)KYSE150中細(xì)胞周期相關(guān)蛋白p53、p-p53、cyclinD1以及與凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2以及Caspase-3表達(dá)的影響 使用Western blot法檢測(cè)p53、p-p53以及G0/G1期周期蛋白cyclin D1的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)不同濃度的核桃青皮粗提物作用于KYSE150細(xì)胞24h后，p53、p-p53蛋白的表達(dá)量隨著藥物濃度的增加而逐漸增加（P＜0.05，圖3A，3C），而cyclinD1蛋白的表達(dá)量隨著藥物濃度的增加而逐漸減弱（P＜0.05，圖3A，3C）。同時(shí)，使用Western blot法檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax，Bcl-2以及Caspase-3的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)Bax蛋白的表達(dá)情況隨著核桃青皮粗提物濃度的增加而逐漸增加（P＜0.05，圖3B，3D），而Bcl-2和Caspase-3蛋白的表達(dá)情況隨著核桃青皮粗提物濃度的增加而逐漸減弱（P＜0.05，圖3B，3D）。

3 討論

核桃植株全身都是寶，除其果仁可食用外，核桃青皮、核桃殼、核桃葉等均可入藥，而且采集方便，具有消熱、解毒、抗癌、鎮(zhèn)痛等作用。核桃青果皮又稱青龍衣為核桃楸和核桃的未成熟外果皮。自《山東中草藥手冊(cè)》稱之為“青龍衣”后，現(xiàn)多延用此名稱。辛、苦、澀、平，有清熱解毒、祛風(fēng)療癬、止痛止痢的功效，具有廣泛的藥用價(jià)值，特別是其抗癌活性，越來越受到重視。文姝等[9]以Western Blot方法檢測(cè)青龍衣提取液作用后的白血病K526細(xì)胞的p53、p21蛋白表達(dá)，結(jié)果p53、p21蛋白表達(dá)量均有增加，從而抑制周期蛋白依賴性激酶活性，使細(xì)胞停滯于G1期。徐巍等[10]研究表明青龍衣可顯著抑制人肝癌SMMC-7721細(xì)胞生長(zhǎng)、繁殖，且與作用時(shí)間、劑量呈明顯相關(guān)性。但核桃青皮粗提物對(duì)食管癌的抗腫瘤作用未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，核桃青皮粗提物可有效的抑制食管癌細(xì)胞株KYSE150的細(xì)胞增殖，并且呈濃度和時(shí)間依賴性。本實(shí)驗(yàn)旨在研究核桃青皮粗提物抑制KYSE150細(xì)胞增殖并且誘導(dǎo)其細(xì)胞凋亡的機(jī)制，為探究核桃青皮開發(fā)為抗食管癌藥物提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和依據(jù)。

圖3 核桃青皮粗提物對(duì)KYSE150細(xì)胞p53，p-p53，cyclinD1，Bax，Bcl-2以及Caspase-3蛋白表達(dá)的影響

我們研究發(fā)現(xiàn)，核桃青皮粗提物處理KYSE150細(xì)胞24 h，可以以濃度依賴性的方式使細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期并伴隨著S期的減少。表明細(xì)胞持續(xù)性的有絲分裂無法通過G1期到達(dá)S期，這種細(xì)胞周期阻滯是通過增加p53和p-p53蛋白的表達(dá)，并降低細(xì)胞周期蛋白cyclinD1的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。p53則通過調(diào)節(jié)其下游效應(yīng)基因CIP/WAF1、GADD45和MDM2的轉(zhuǎn)錄而使得細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，CIP/ WAF1表達(dá)的產(chǎn)物為p21蛋白，p21的表達(dá)是引起G0/G1期阻滯的直接原因[11-12]。p21與細(xì)胞周期蛋白家族、周期蛋白依賴性激酶（cyclin-dependent kinase,CDK）家族、增殖細(xì)胞細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen,PCNA）構(gòu)成復(fù)合物。抑制復(fù)合物中的激酶活性，引起其底物成視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白（retinoblastoma protein,RB）的去磷酸化，阻止轉(zhuǎn)錄因子E2F釋放，使參與與細(xì)胞增殖有關(guān)蛋白如cyclinD1、cyclinE、PCNA等不能表達(dá)，阻滯細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，導(dǎo)致G0/G1期阻滯[13]。

目前細(xì)胞凋亡主要通過兩條信號(hào)通路：通過調(diào)控Caspase-9起作用的線粒體凋亡通路和通過調(diào)控Caspase-8起作用的死亡受體通路。線粒體凋亡途徑是通過線粒體釋放細(xì)胞色素C(cyt-c)激活Caspase-9，繼而激活Caspase-3形成cleaved-Caspase-3 (c-Caspase-3)，從而發(fā)揮激活Ploy(ADP-ribose)polymerase(PARP)作用[14-15]。一旦PARP被激活，其將發(fā)揮“死亡基質(zhì)”的作用，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，核桃青皮粗提物降低了Caspase-3酶原的表達(dá)。此外，Bcl-2家族在線粒體凋亡途徑的調(diào)控中也起到重要作用。Bcl-2家族包括抑制和促進(jìn)細(xì)胞凋亡兩類功能相反的蛋白質(zhì)，如Bcl-2抑制凋亡，Bax促進(jìn)凋亡，并且，Bax上調(diào)，Bcl-2下調(diào)也會(huì)激活Caspase-9和Caspase-3[16]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，核桃青皮粗提物作用于KYSE150細(xì)胞后，能夠上調(diào)Bax的表達(dá)，同時(shí)下調(diào)Bcl-2的表達(dá)。因此，核桃青皮粗提物通過線粒體凋亡途徑誘導(dǎo)KYSE150細(xì)胞凋亡。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，核桃青皮粗提物可以引發(fā)KYSE150細(xì)胞G0/G1周期阻滯，并且可以通過線粒體途徑誘導(dǎo)KYSE150細(xì)胞凋亡。由此表明，核桃青皮粗提物具有較好的抗食管癌作用，具有廣闊的藥物研發(fā)和臨床應(yīng)用前景。另一反面，現(xiàn)在核桃青皮是核桃生產(chǎn)中產(chǎn)生的大量副產(chǎn)物，其價(jià)值一直沒有得到充分的開發(fā)和利用，而此次我們對(duì)其抗食管癌活性的研究，不但能使核桃青皮變廢為寶，還能減少環(huán)境污染。然而，核桃青皮粗提物阻滯細(xì)胞周期和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，以及各個(gè)通路之間的聯(lián)系有待進(jìn)一步研究，并且亟需通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證核桃青皮粗提物抗食管癌的作用。

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（收稿：2016-06-08 修回：2017-01-26）

（責(zé)任編輯 王 豐 屈振亮）

Extractives of J.sigillata Green Husks Induce Cell Cycle Arrest and Apoptosis in KYSE150 Cells

LICai-xia,ZHANG Shu-kun,LI Zhi-gang,et al.
Institute of Chinese and Western Medicines for Acute Abdominal Diseases,Tianjin Nankai Hospital,Tianjin(300100),China

Objective To explore the mechanisms of extractives of J.sigillata green husks in inducing cell-cycle arrest and apoptosis in esophageal cancer cells(KYSE150). Methods MTT assay was used to detect the rate of cell proliferation inhibition by the extractives of J.sigillata green husks.Flow cytometry assay was used to analyze the cell cycle arrest and apoptosis.Western blot assay was used to analyze expression levels of proteins in cell cycle and apoptosis signaling pathways. Results MTT assay indicated that the proliferation inhibition of extractives of J.sigillata green husks on KYSE150 cells was in time and dose dependent manners. When the concentration of extractives of J.sigillata green husks was 100 μ g/mL,the inhibition rates of KYSE150 cell proliferation were 43.69±1.02%,88.73±1.32%and 93.06±2.34%at 24 h,48 h and 72 h,respectively.Flow cytometry results show that the extractives of J.sigillata green husks caused cycle arrest in G0/ G1 phase via up-regulating p53,phospho-p53 and down-regulating cyclinD1.On the other hand,the extractives of J.sigillata green husks induced apoptosis via increasing the protein expression of Bax and decreasing the protein expression of Bcl-2 and Caspase-3.The expression of p53,p-p53 and Bax were increased 1.8±0.07,23.6 ±0.12 and 1.5±0.02 times compared with the control group respectively,while the expression of cyclinD1, Bcl-2 and Caspase were down-regulated 0.3±0.02,0.03±0.005 and 0.1±0.01 times compared with the control group respectively,when the concentration of extractives of J.sigillata green husks was 40 μ g/mL. Conclusion The extractives of J.sigillata green husks triggered G0/G1 phase arrest in KYSE150 cells.In addition,the extractives of J.sigillata green husks induced apoptosis through the mitochondrial apoptotic pathway.

Extractives of J.sigillata green husks；KYSE150 cell；proliferation；cellcycle；apoptosis.

R735.1

A

1007-6948(2017)02-0151-05

10.3969/j.issn.1007-6948.2017.02.013

天津市衛(wèi)生局基金項(xiàng)目（2015KY27）

1.天津市中西醫(yī)結(jié)合急腹癥研究所細(xì)胞及分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室（天津 300100）

2.天津市南開醫(yī)院胸外科（天津 300100）

3.天津科技大學(xué)材料科學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院（天津 300222）

李志剛，E-mail：zhigli38@hotmail.com