吳克良

(山東大學(xué)附屬生殖醫(yī)院，濟南 250001)

新的囊胚活檢方法
——囊胚活檢不再糾結(jié)和繁瑣

吳克良

(山東大學(xué)附屬生殖醫(yī)院，濟南 250001)

囊胚活檢目前是進行胚胎植入前遺傳學(xué)診斷/篩查(PGD/PGS)以及單基因疾病診斷的前提。目前常規(guī)使用的提前打孔的囊胚活檢方法，會出現(xiàn)囊胚孵出時間不確定、內(nèi)細胞團處于孵出部位以及囊胚過早孵出等異?，F(xiàn)象，給囊胚活檢帶來了一定的困難，并部分地影響到囊胚最終移植的臨床結(jié)局。新的非提前打孔囊胚活檢法，利用透明帶本身的束縛作用減少激光的創(chuàng)面，可以最大程度地減少活檢時異常情況的出現(xiàn)，使得活檢更加簡單并且可控，可以在一定程度上改善移植胚胎的臨床結(jié)局。

囊胚活檢； 透明帶打孔； 囊胚孵出； 內(nèi)細胞團

(JReprodMed2017，26(4)：324-327)

胚胎植入前遺傳學(xué)診斷(PGD)以及胚胎植入前篩查(PGS)是指在體外受精過程中，對具有遺傳風(fēng)險或胚胎異常風(fēng)險患者的胚胎進行種植前活檢和遺傳學(xué)分析，以選擇無遺傳學(xué)疾病的胚胎植入宮腔，從而獲得正常胎兒的診斷方法，可有效地防止有遺傳疾病患兒的出生。PGD、PGS技術(shù)一方面可以有效地替代傳統(tǒng)的產(chǎn)前診斷技術(shù)，對異常胚胎進行治療性流產(chǎn)，避免中期妊娠遺傳診斷及終止妊娠所致的危險及痛苦；另外一方面，PGD、PGS技術(shù)的產(chǎn)生與完善可以排除遺傳病攜帶者胚胎，阻斷致病基因的縱向傳遞，從而降低人類遺傳負荷[1-2]。而且隨著二胎政策的實施，目前輔助生殖技術(shù)高齡需求者的比例較之前有明顯提高，而高齡患者的再生育也伴隨著新生兒出生缺陷的風(fēng)險增加。對高齡孕婦和高危婦女進行PGS可以有效地避免遺傳病患兒的出生[3-4]。

胚胎活檢以獲得少量的胚胎細胞進行遺傳學(xué)分析是進行PGD、PGS以及單基因疾病診斷的前提。根據(jù)實施活檢的時期可分為卵裂期活檢和囊胚活檢。卵裂期胚胎活檢大部分情況下活檢1～2個卵裂球，對胚胎的發(fā)育潛能損傷比較大[5]，而且卵裂期胚胎存在嵌合體的比例相對較高，故其產(chǎn)生假陽性或假陰性的比例較高，這在一定程度上給最終的診斷帶來較大的風(fēng)險。因此，卵裂期活檢除了少部分采用FISH技術(shù)診斷的病例以外，應(yīng)用越來越少。囊胚活檢通常會活檢3～6個滋養(yǎng)層細胞，由于囊胚本身的特點以及在一定程度上降低了嵌合體概率[6-7]，因此，囊胚活檢獲得了越來越多的應(yīng)用。

相關(guān)報道證明，通過胚胎培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的游離DNA可以比較準(zhǔn)確地對胚胎進行遺傳學(xué)診斷，并且有成功的案例報導(dǎo)[8]。但是該技術(shù)目前仍然存在一定的應(yīng)用缺陷，比如準(zhǔn)確率還遠遠沒有達到大量推廣的要求、嵌合體問題無法有效解決、無法有效診斷單基因病等。因此，至少在目前的技術(shù)條件下，囊胚活檢仍然是一項必不可少的實驗室常規(guī)技術(shù)。

目前國際上通用的囊胚活檢方法是在胚胎發(fā)育至D3時在胚胎透明帶上用激光或機械法打一個穿透的小孔，以便胚胎發(fā)育成囊胚的時候部分滋養(yǎng)層細胞能夠從穿透的小孔中滲透出來，便于滋養(yǎng)層細胞的獲取。該方法是目前使用最多的方法，可以比較容易地獲得滋養(yǎng)層細胞，并且胚胎發(fā)育至相對早期囊胚階段的時候便有滋養(yǎng)層細胞滲透出透明帶。但同時也具有潛在不足。首先，由于透明帶打孔時機選擇在D3卵裂期，其位置是隨機的，當(dāng)胚胎發(fā)育至囊胚期時開孔位置靠近滋養(yǎng)層端還是內(nèi)細胞團端很難保證，有約1/4的概率是正處或靠近內(nèi)細胞端(圖1)，這給滋養(yǎng)層獲取帶來較大困難并且很難避免激光的熱效應(yīng)對內(nèi)細胞團的影響；其次，由于提前給透明帶打孔，囊胚發(fā)育過程中就不會出現(xiàn)囊胚腔完全擴張并使透明帶變薄的現(xiàn)象，并且會出現(xiàn)滋養(yǎng)層細胞數(shù)目較少、細胞大、提前孵出的情況等等。這些非正常狀態(tài)下的囊胚發(fā)育進程對胚胎植入前后的影響是目前還沒有明確的結(jié)論，對該類胚胎來源的后代影響目前也缺少系統(tǒng)的追蹤；再次，由于缺少透明帶壓力本身的約束，滋養(yǎng)層細胞數(shù)目少、細胞體積大本身也使得在活檢過程中激光切割的創(chuàng)面變大，受影響細胞的比例增加，這勢必會影響整個囊胚的最終發(fā)育潛能[9]；最后，透明帶打孔后使得胚胎出現(xiàn)部分孵出的現(xiàn)象增加，這樣給使得該囊胚在冷凍過程中容易產(chǎn)生胚胎丟失，而且胚胎融解后很難進行再次輔助孵化，可能使得內(nèi)細胞團部分將來很難孵出導(dǎo)致胚胎著床失敗。

另外一種使用相對較少的囊胚活檢方法是于囊胚階段對囊胚進行皺縮并選擇合適位置進行打孔，待滋養(yǎng)層部分孵出以后吸取孵出的滋養(yǎng)層細胞部分進行活檢。該方法雖然可以避免內(nèi)細胞團部分的非預(yù)期孵出，但是需要等到囊胚再次復(fù)張并孵出才能活檢，部分情況下當(dāng)天是無法完成活檢的。因此這種活檢方法的使用受到極大的限制。

針對目前活檢技術(shù)所存在的各種缺陷以及不方便，我們中心結(jié)合前期大量的實踐，探索開發(fā)了一種新的非提前打孔式的囊胚活檢方法(圖2)，主要操作流程包括以下幾個部分：(1)胚胎自然發(fā)育到4期囊胚階段；(2)用適當(dāng)?shù)哪芰繉δ遗哌M行簡單皺縮；(3)用較小的激光能量對活檢位置的透明帶進行開縫；(4)隔著透明帶上所開的縫隙，利用負壓將所要活檢的滋養(yǎng)層細胞吸入活檢針中；(5)用激光沿著透明帶與活檢針的交接處切割滋養(yǎng)層細胞；(6)完全分離所需要的滋養(yǎng)層細胞。

圖1 內(nèi)細胞正處于活檢位置或孵出位置

圖2 非提前打孔活檢的主要步驟

該方法的實施使得我們在活檢之前不需要對囊胚做任何操作，每天只要觀察一次就能確定囊胚是否需要活檢，大大降低了我們對囊胚發(fā)育的干預(yù)頻率，而且可以更好地確?；顧z后囊胚后期的冷凍和復(fù)蘇效果。通過簡單的隨機對照研究發(fā)現(xiàn)，采用非提前打孔的方法進行囊胚活檢，可以有效避免活檢時內(nèi)細胞團處于活檢的位置(0% vs. 16.53%，P=0.0000)，顯著降低每患者的平均活檢次數(shù)(1.74 vs. 2.43，P=0.0276)，顯著降低活檢時囊胚處于完全孵出狀態(tài)的比例(6.11% vs. 20.45%，P=0.0000)，活檢后胚胎處于透明帶內(nèi)部的比例顯著高于常規(guī)活檢組(89.50% vs. 47.11%，P=0.0000)(表1)。通過移植周期的臨床結(jié)局簡單對比顯示，非提前打孔組所獲得的臨床妊娠率和著床率均顯著高于常規(guī)活檢組(均為79.59% vs. 59.61%，P=0.0296)(表2)。

表1 操作效果在常規(guī)活檢組與非提前打孔組的比較[n(%)]

注：與常規(guī)活檢組比較，*P<0.05

常規(guī)活檢方法在活檢過程中存在比較多的不確定環(huán)節(jié)，比如內(nèi)細胞團處于活檢位置、囊胚過早孵出、孵出不充分等等，這些因素也是導(dǎo)致常規(guī)活檢費時費力的主要原因。而采用新的非提前打孔囊胚活檢時，基本不會遇到比較特殊的情況，只需要確定活檢時囊胚處于4期階段即可，大大減少了實驗室的操作時間和不確定因素。另外，提前打孔對胚胎的發(fā)育本身可能也是一種干擾。在自然狀態(tài)下，囊胚需要達到足夠的細胞數(shù)量和足夠小的細胞體積才能夠完全擴張并孵出。在提前打孔的囊胚活檢技術(shù)實施過程中，破損的透明帶失去了對囊胚的整體束縛作用，使得囊胚在較早階段時便開始孵出，這也是常規(guī)囊胚活檢時細胞體積較大、細胞數(shù)量整體較少的主要原因，在一定程度上增加了囊胚活檢對胚胎的損傷效應(yīng)[8]。改進的非提前打孔活檢法可以使得囊胚在活檢之前充分發(fā)育，在囊胚擴張與透明帶束縛力的反復(fù)競爭中，囊胚的數(shù)量增加并且體積減小，這也完全符合胚胎的自然發(fā)育規(guī)律。正是由于提前打孔會導(dǎo)致囊胚的提前孵出，故冷凍時大部分的囊胚可能處于3期階段，這給臨床準(zhǔn)備內(nèi)膜條件帶來一定的不確定性，而且細胞體積較大以及部分孵出狀態(tài)會在一定程度上影響最終的冷凍效果，這可能是臨床結(jié)局相對較低的主要原因。

表2 臨床結(jié)局在常規(guī)活檢組與非提前打孔組的比較[n(%)]

注：與常規(guī)活檢組比較，*P<0.05

總之，使用新的囊胚活檢方法可以使得囊胚活檢變得更加簡單，使活檢操作人員對活檢時機把握得更加明確，并且在一定程度上改善了移植胚胎的臨床結(jié)局。

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[編輯：羅宏志]

A novel method making blastocyst biopsy simple and controllable

WUKe-liang

ReproductiveHospitalAffiliatedtoShandongUniversity，Jinan250001

Blastocyst biopsy is a prerequisite for PGD & PGS and single gene disorder diagnosis. At present，zona pellucida opening and partially trophectoderm (TE) cell hatching are needed before blastocyst biopsy. It causes that blastocyst hatching time is uncertain，and the inner cell mass is in abnormal position，or blastocyst is hatched prematurely. All these bring the difficulties to blastocyst biopsy，and may also affect the final clinical outcome of biopsied blastocyst transplantation. The new blastocyst biopsy method does not need zona pellucida opening before biopsy，only utilizes the zona pellucida binding force itself to reduce the laser wound，which makes biopsy more simple and controllable，and also improves the clinical outcomes of biopsied blastocyst transfer to some extent.

Blastocyst biopsy； Zona pellucida opening； Blastocyst hatching； Inner cell mass

10.3969/j.issn.1004-3845.2017.04.006

2017-01-18；

2017-02-19

默克雪蘭諾中國生殖醫(yī)學(xué)研究基金(2015)

吳克良，男，江蘇鹽城人，博士，副研究員，發(fā)育生物學(xué)專業(yè).