朱振元，李起祥，潘立超，葛曉冉

（1.天津科技大學(xué)新農(nóng)村發(fā)展研究院，天津300457；2.天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津300457）

兩步法高效制備玉米芯木寡糖的工藝研究

朱振元1，2，李起祥1，潘立超1，葛曉冉1

（1.天津科技大學(xué)新農(nóng)村發(fā)展研究院，天津300457；2.天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津300457）

以玉米芯為原料，通過堿提醇沉法和酶水解法兩步高效提取制備木寡糖。玉米芯成分分析結(jié)果表明，玉米芯中水分含量為（12.06±1.23）%，粗纖維含量為（43.34±0.49）%，粗灰分含量為（1.87±0.03）%，脂肪的含量為（0.67±0.02）%，可溶性蛋白質(zhì)含量為（0.07±0.01）%，可溶性糖含量為（0.34±0.01）%，還原糖含量為（0.13±0.01）%，木質(zhì)素含量為（28.47± 0.87）%。通過單因素和正交試驗(yàn)確定了堿提醇沉法提取玉米芯木聚糖粗品的工藝為：提取溫度85℃，堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)15%，料液比1∶15（g/mL），提取時(shí)間150min，該工藝條件下木聚糖得率為12.44%。通過正交試驗(yàn)確定了酶解制備木寡糖的最佳工藝條件為底物濃度40g/L，酶含量0.02%，反應(yīng)時(shí)間4h。在此條件下酶解制備木寡糖相對(duì)含量為89.61%。

玉米芯；木寡糖；堿提醇沉法；酶水解法

木寡糖（XOS）是由木聚糖分解，以木糖分子為基本單元通過糖苷鍵結(jié)合組成的混合物，經(jīng)過內(nèi)切木聚糖酶酶解，然后經(jīng)分離和精制而制得的[1]。它可以選擇性地促進(jìn)腸道雙歧桿菌的增殖活性。目前應(yīng)用十分廣泛，包括醫(yī)藥保健品類，如治療腸胃功能失調(diào)、糖尿病、高血壓等；乳品飲料類，如奶粉、酸奶、碳酸飲料等；食品類：如調(diào)味品、甜品點(diǎn)心、罐頭。低聚木糖的制備方法，主要有熱水抽提法、酶水解法、堿水解法、酸水解法和微波降解法等。

我國玉米芯產(chǎn)量巨大，長期以來玉米芯處理不當(dāng)，浪費(fèi)巨大。而玉米芯含有的木聚糖，可以用來制備低聚木糖。目前玉米芯低聚木糖的制備已有一些研究，孫軍濤等[2]用酸-復(fù)合酶法制備玉米芯低聚木糖；宋娜等[3]對(duì)微波處理玉米芯制備低聚木糖進(jìn)行研究；孫軍濤等[4]用超聲波輔助復(fù)合酶法制備玉米芯低聚木糖。本文采用稀堿法，高溫處理玉米芯，優(yōu)化玉米芯的預(yù)處理，提取玉米芯木聚糖，再采取酶法處理的方式，得到玉米芯木寡糖。

1 材料與方法

1.1 原料與設(shè)備

玉米芯：由山東龍力生物技術(shù)有限公司提供，保藏溫度為室溫。

無水葡萄糖、苯酚、濃硫酸、氫氧化鈉、氫氧化鉀、濃鹽酸、無水乙醇：以上試劑來自天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠；牛血清蛋白：上海藍(lán)季科技公司；考馬斯亮藍(lán)：Amresco；G-250氯仿：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑廠；試劑均為分析純，市售。

SP2102UV型紫外可見分光光度計(jì)：上海光譜儀器有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；DF-101S集熱式恒溫磁力攪拌器：鞏義市予華儀器有限公司；LD4-40型低速大容量離心機(jī)：北京醫(yī)用離心機(jī)廠；SRJX-4-9馬弗爐：天津市繼紅五金機(jī)電廠；LGJ-0.5臺(tái)式冷凍干燥機(jī)：軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)儀器廠；索氏提取器：天津北方科教儀器廠。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 玉米芯成分分析

玉米芯是玉米果穗脫去子粒后的穗軸，一般占玉米穗20%～30%左右。水分含量利用直接干燥法進(jìn)行試驗(yàn)[5]；粗纖維含量利用消煮法進(jìn)行試驗(yàn)[6]；粗灰分含量利用馬弗爐灰化法進(jìn)行試驗(yàn)[7]；脂肪含量利用索氏提取法進(jìn)行試驗(yàn)[8]；可溶性蛋白含量利用考馬斯亮藍(lán)法測定玉米芯粉中可溶性蛋白質(zhì)的含量[9]；可溶性糖含量利用苯酚-硫酸法測定可溶性糖含量[10]；還原糖含量利用3，5-二硝基水楊酸法測定還原糖含量[11]；木質(zhì)素含量利用Klason法進(jìn)行試驗(yàn)[12]。

1.2.2 玉米芯木聚糖的提取

1.2.2.1 單因素試驗(yàn)

提取溫度：稱取粉碎好的玉米芯粉10 g，固定料液比1∶15（g/mL）、提取時(shí)間90min、乙醇終濃度70%，觀察提取溫度（70、75、80、85、90℃）對(duì)木聚糖得率的影響。

料液比：稱取粉碎好的玉米芯10 g，固定提取溫度85℃、提取時(shí)間90min、乙醇終濃度70%，觀察料液比[1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25（g/mL）]對(duì)木聚糖得率的影響。

提取時(shí)間：稱取粉碎好的玉米芯10 g，固定提取溫度85℃、料液比1∶15（g/mL）、乙醇終濃度70%，觀察提取時(shí)間（60、90、120、150、180min）對(duì)木聚糖粗品的影響。

堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)：稱取粉碎好的玉米芯10 g，固定提取溫度85℃、料液比1∶15（g/mL）、提取時(shí)間90min，觀察堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)（5%、10%、15%、20%、25%）對(duì)木聚糖得率的影響。

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)提取溫度、料液比、提取時(shí)間和堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行四因素三水平L9（34）正交試驗(yàn)，以玉米芯木聚糖得率為指標(biāo)，確定最佳提取條件。正交試驗(yàn)因素水平如表1所示。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table1 Levelsand factors tableoforthogonalexperiment

1.2.2.2 酶解木聚糖制備木寡糖

1）木聚糖酶活的測定[13]

利用DNS法測定木聚糖酶的活力。

2）低聚木糖的HPLC分析

采用HPLC分析[14]酶解制備的低聚木糖組成。

3）樣品處理[15]

將低聚木糖用流動(dòng)相配成5 mg/mL的溶液，經(jīng)0.22μm有機(jī)微孔濾膜過濾，超聲脫氣，取20μL濾液進(jìn)行分析。

4）標(biāo)準(zhǔn)液配制

用流動(dòng)相分別配制5mg/mL的木糖、木二糖、木三糖對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)溶液，過0.22μm濾膜，超聲脫氣備用。

5）色譜條件

安捷倫-1200型高效液相色譜儀；色譜柱：APS-2 HYPERSIL；柱溫：30℃；流動(dòng)相：乙腈-水（75∶25，體積比），混勻，使用前超聲脫氣；流速：0.8mL/min；進(jìn)樣量：20μL；檢測器：示差檢測器。

1.2.3 木聚糖酶酶解試驗(yàn)

1.2.3.1 酶解試驗(yàn)

對(duì)木聚糖酶濃度（單位：h；A處理）和反應(yīng)時(shí)間（單位：h；B處理）進(jìn)行酶解試驗(yàn)。試驗(yàn)因素水平表見表2。

表2 酶解試驗(yàn)表Table2 Levelsand factors tableofexperiment

1.2.3.2 驗(yàn)證試驗(yàn)

采用酶解試驗(yàn)確定的最佳條件對(duì)玉米芯木聚糖進(jìn)行酶解制備木寡糖。

2 結(jié)果與討論

2.1 玉米芯的成分分析

利用直接干燥法進(jìn)行試驗(yàn)，經(jīng)測定計(jì)算得，玉米芯粉中水分含量為（12.06±1.23）%。

利用消煮法進(jìn)行試驗(yàn)，經(jīng)測定計(jì)算得，玉米芯中的粗纖維含量為（43.34±0.49）%；由此可見，在玉米芯中粗纖維含量很高，為玉米芯的主要成分。

利用馬弗爐灰化法進(jìn)行試驗(yàn)，經(jīng)測定計(jì)算得，玉米芯粉中粗灰分含量為（1.87±0.03）%。

利用索氏提取法進(jìn)行試驗(yàn)，經(jīng)測定計(jì)算得，玉米芯粉中脂肪的含量為（0.67±0.02）%。

利用考馬斯亮藍(lán)法測定玉米芯粉中可溶性蛋白質(zhì)的含量經(jīng)測定計(jì)算得，玉米芯粉中的可溶性蛋白質(zhì)含量為（0.07±0.01）%。

利用苯酚-硫酸法測定可溶性糖含量，經(jīng)計(jì)算得到玉米芯粉中的可溶性糖含量為（0.34±0.01）%。

利用3，5-二硝基水楊酸法測定還原糖含量，經(jīng)計(jì)算得到玉米芯中還原糖含量為（0.13±0.01）%。

利用Klason法進(jìn)行試驗(yàn)，經(jīng)測定計(jì)算得，玉米芯粉中木質(zhì)素含量為（28.47±0.87）%。

2.2 玉米芯木聚糖的提取

經(jīng)單因素試驗(yàn)測得玉米芯木聚糖提取最佳條件：堿提取溫度為90℃，料液比1∶10（g/mL），提取時(shí)間2 h，選擇堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%。最終經(jīng)正交試驗(yàn)測得木聚糖粗提取的最佳條件為提取溫度85℃，堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)15%，料液比1∶15（g/mL），提取時(shí)間150min。溫度對(duì)木聚糖得率的影響見圖1，料液比對(duì)木聚糖得率的影響見圖2，提取時(shí)間對(duì)木聚糖得率的影響見圖3，堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)木聚糖得率的影響見表4。

采用正交試驗(yàn)確定的最佳條件對(duì)玉米芯木聚糖進(jìn)行提取，木聚糖得率達(dá)12.44%。正交表如表3、表4所示。

圖1 溫度對(duì)木聚糖得率的影響Fig.1 Effectof tem peratureon the yield of xylo-oligosaccharides

圖2 料液比對(duì)木聚糖得率的影響Fig.2 Effectof dry/water weight ratio on the yield of crude polysaccharides

圖3 提取時(shí)間對(duì)木聚糖得率的影響Fig.3 Effectof timeon theyield of crude polysaccharides

圖4 堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)木聚糖得率的影響Fig.4 Effectof NaOH concentration on yield of xylooligosaccharides

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果Table3 The resultsof orthogonalexperiment

表4 方差分析表Table4 Varianceanalysisof orthogonal test

2.3 酶解木聚糖制備木寡糖

2.3.1 木聚糖酶活的測定

利用DNS法測定木聚糖酶的活力，木糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖5所示，回歸方程為y=3.467 5x-0.034 5，R2= 0.999 0，具有良好的線性關(guān)系。經(jīng)計(jì)算得到木聚糖酶酶活力為（1 631.503±5.177 9）U。

圖5 木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5 Standard curveof xylose

2.3.2 低聚木糖的HPLC分析

木聚糖酶對(duì)木聚糖進(jìn)行酶解后，采用高效液相色譜法（氨基柱）測定制備的低聚木糖的組成，由HPLC圖譜可知，酶解制備的低聚木糖主要含有4種組分，其中峰1的出峰時(shí)間與木糖一致，所以峰1代表木糖。木糖標(biāo)準(zhǔn)品的高效液相色譜見圖6，低聚木糖的HPLC分析圖譜見圖7。

2.3.3 木聚糖酶酶解試驗(yàn)

2.3.3.1 酶解試驗(yàn)

對(duì)木聚糖酶濃度（單位：%；A處理）和反應(yīng)時(shí)間（單位：h；B處理）進(jìn)行酶解試驗(yàn)，結(jié)果如表5和表6所示。

圖6 木糖標(biāo)準(zhǔn)品的高效液相色譜Fig.6 High perform ance liquid chromatography（HPLC）profileof xylose

圖7 低聚木糖的HPLC分析圖譜Fig.7 High performance liquid chromatography（HPLC）profileof xylo-oligosaccharides

表5 試驗(yàn)結(jié)果Table5 The resultsof experiment

表6 木寡糖相對(duì)含量的方差分析表Table6 Varianceanalysisof orthogonal test

由極差Delta值大小可知，各因素作用主次為A＞B，表明提酶濃度對(duì)木寡糖相對(duì)含量的影響最大，其次是時(shí)間，根據(jù)每個(gè)單因素中的K值比較，以A2B2為酶解玉米芯木聚糖的最佳條件，但從經(jīng)濟(jì)適用角度考慮，選擇酶濃度0.02%更為合適，可降低工藝成本。故酶解木聚糖制備木寡糖的最佳條件為底物濃度40 g/L，酶含量0.02%，反應(yīng)時(shí)間4 h。

2.3.3.2 驗(yàn)證試驗(yàn)

采用正交試驗(yàn)確定的最佳條件對(duì)玉米芯木聚糖進(jìn)行酶解制備木寡糖，木寡糖的得率達(dá)89.61%。

3 結(jié)論

本文對(duì)玉米芯木寡糖進(jìn)行了全面的研究，對(duì)玉米芯木聚糖進(jìn)行提取分離、酶解，得到如下結(jié)論。

1）通過測定可知玉米芯成分為：水分占（12.06± 1.23）%，粗纖維占（43.34±0.49）%，粗灰分占（1.87± 0.03）%，脂肪占（0.67±0.02）%，可溶性蛋白質(zhì)占（0.07±0.01）%，可溶性糖占（0.34±0.01）%，還原糖占（0.13±0.01）%，木質(zhì)素含量為（28.47±0.87%）。由此可見，在玉米芯中粗纖維含量很高，為玉米芯的主要成分，由其水解可獲取木聚糖，故具有很大的應(yīng)用價(jià)值。

2）堿提醇沉法提取玉米芯木聚糖的最佳工藝條件為提取溫度85℃，堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)15%，料液比1∶15（g/ mL），提取時(shí)間150min，在此條件下木聚糖粗品得率為12.44%。

3）通過酶解木聚糖制備木寡糖的工藝優(yōu)化試驗(yàn)可以表明，最佳酶解工藝為：底物濃度40 g/L，酶含量0.02%，反應(yīng)時(shí)間4 h。在此條件下酶解制備木寡糖相對(duì)含量為89.61%。

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Studies on Extraction and Preparation of Xylooligosaccharides from Corncobs

ZHU Zhen-yuan1，2，LIQi-xiang1，PAN Li-chao1，GEXiao-ran1
（1.Institute forNeWRevelopment，Tianjin UniversityofScienceand Technology，Tianjin 300457，China；2.College of Food Engineeringand Biotechnology，Tianjin University ofScience and Technology，Tianjin 300457，China）

The extraction and preparation of xylooligosacchrides through alkaliextraction and alcohol precipitationmethod and enzymatic hydrolysis from Corncobwere studied.Firstly，the composition ofcorncobswasanalyzed.The result indicated thatmoisture，crude fiber content，crude ash content，fat content，protein content，soluble sugar content，reducing sugar content，xylogen contentof corncobswereamounted to（12.06±1.23）%，（43.34±0.49）%，（1.87±0.03）%，（0.67±0.02）%，（0.07±0.01）%，（0.34±0.01）%，（0.13±0.01）%，（28.47± 0.87）%，respectively.The extraction processing ofxylan from the corncobwasestablished through single factor experimentand orthogonal testas the followings：corncob powderwasmixed with 15%sodium hydroxide at the ratioof1∶15（g/mL）and themixturewasheated to85℃for150min.Under thiscondition，the yield of corncob xylan was12.44%.The processing parametersof xylan hydrolysisby xylanasewere optimized as the substrate concentration of40 g/L，xylanase dosage of 0.02%，hydrolysis for 4 h.Under this condition，the yield of xylooligosaccharideswas89.61%.

corncob；xylooligosaccharide；alkali extraction and alcohol precipitation method；enzymatic hydrolysismethod

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.07.006

2016-07-18

國家星火計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目（2015GA610001）；天津市農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化與推廣項(xiàng)目（201502180）

朱振元（1969—），男（漢），教授，博士，研究方向：生物資源與功能食品、糖化學(xué)與糖生物學(xué)。