莊養(yǎng)林，熊麗紅，張鵬飛，王芳，陳丹，施橋發(fā)

(1、南昌大學醫(yī)學院，江西南昌330006；2、江西省血液中心，江西南昌330077；3、江西省職業(yè)病防治研究院，江西南昌330006)

標本因素及保存條件對HCV RNA檢測的影響

莊養(yǎng)林1，2，熊麗紅2，張鵬飛2，王芳2，陳丹3，施橋發(fā)1

(1、南昌大學醫(yī)學院，江西南昌330006；2、江西省血液中心，江西南昌330077；3、江西省職業(yè)病防治研究院，江西南昌330006)

目的探討溶血、脂肪血、保存溫度和保存時間對HCV RNA檢測的影響，確認用于核酸檢測的標本正確采集、處理及保存的關鍵控制點。方法應用實時熒光PCR法，采用混樣檢測+單檢的檢測模式，對在不同濃度的血紅蛋白或甘油三脂下以及在不同溫度條件下保存不同時間后的HCV RNA標本進行檢測，對檢測的Ct值進行分析。結果小于7．93mmol/L的不同濃度甘油三脂對HCV RNA檢測沒有影響（P＞0．05），血紅蛋白濃度為97g/L、34g/L、17g/L以及8g/L時，其對HCV RNA檢測均有影響（P＜0．05），當血紅蛋白濃度小于5g/L時，其對HCV RNA檢測均無影響（P＞0．05）；保存溫度在－30℃下4周內，其檢測Ct值差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0．05）。在低于37℃條件下，4h內保存的HCV RNA標本檢測Ct值差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0．05）。在4℃的條件下保存72h內，HCV RNA標本檢測Ct值差異無統(tǒng)計學意義（P＞0．05），25℃的條件下能保存48h（P＞0．05）。結論甘油三脂濃度小于7．93mmol/L對HCV RNA的檢測沒有影響，血紅蛋白濃度大于8g/L時會影響HCV RNA的檢測，用于HCV RNA檢測的標本在4℃保存時最好在72h內完成檢測。

核酸檢測技術；Ct值；溶血；脂肪血；保存條件

核酸檢測（nucleic acidtest，NAT）技術因其靈敏度高，其縮短病毒檢測的“窗口期”遠大于血清學方法，我國采供血機構已將血液部分或全部進行核酸檢測。然而在核酸檢測工作中，標本的質量，如標本的溶血、脂肪血等因素及運輸、保存條件如何會直接關系到檢測結果的準確性。國外較早的研究表明，血紅蛋白可通過其卟啉環(huán)與Taq酶的不可逆結合而抑制Taq酶活性，從而影響PCR測定[1]。此外，檢測標本中的核酸降解同樣也是影響核酸檢測的重要因素。細胞破碎時，RNA酶釋放出來則會降解RNA，影響檢測的靈敏度。國外有報道，受標本保存方式的影響，可使病毒核酸檢測結果的陽性率偏低，因此，如果標本的采集、處理、保存不當，就會造成病毒核酸的降解，進而影響NAT檢測本身的靈敏度，造成檢測結果不準確，給血液安全帶來潛在的風險。所以確認用于NAT檢測的標本正確采集、處理及保存的關鍵控制點，進而確保本地區(qū)高效、高質量地完成NAT檢測工作，降低HBV、HCV、HIV經血傳播風險顯得尤為重要。本文對含HCV RNA的標本模擬采集、運輸、處理以及檢測、保存的全過程，探討溶血、脂肪血、保存溫度和保存時間對HCV RNA檢測的影響。

1 對象與方法

1．1標本的收集與處理收集2016年1月1日－2016年9月30日江西省血液中心獻血者經血清學檢測HBsAg、抗－HCV、抗－HIV均為陰性以及NAT檢測均為陰性的透亮血漿標本。收集上述時間段內的HCV RNA檢測陽性的血漿，制備12～30倍檢出限（LOD）濃度的HCV RNA標本，分別放置于4℃、25℃、37℃、－30℃環(huán)境下進行保存（各5份），4h、1d、2d、3d、1周、4周后對所有標本進行NAT檢測（其中37℃組考慮到細菌污染等問題保存4周不納入研究）。

收集上述時間段內血清學及NAT檢測均為陰性的嚴重乳糜血漿、紅細胞懸液。將收集的紅細胞懸液放置－80℃制成全溶血樣本，經3000g，15min離心，取上層液體，加入血清學及NAT檢測均為陰性的透亮血漿標本分別制成倍比稀釋的溶血樣本（1：1至1：32稀釋共6組溶血樣本）。將收集的嚴重乳糜血漿樣本，經3000g，15min離心，取上層液體，加入血清學及NAT檢測均為陰性的透亮血漿標本分別制成倍比稀釋的脂肪血標本（1：1至1：8稀釋共4組脂肪血樣本）。

1．2主要儀器美國羅氏公司Cobas s 201核酸檢測系統(tǒng)，瑞士Hamlton全自動STAR加樣儀，邁瑞全自動細胞分析儀BC－3000Plus，貝克曼庫爾特全自動生化分析儀AU680，長沙湘麓DL－6M大容量低溫離心機。

1．3主要試劑核酸檢測試劑盒：COBAS

1．4．2混樣標本血紅蛋白及甘油三脂濃度的測定由倍比稀釋的脂肪血或溶血標本制成混樣標本的甘油三脂及血紅蛋白濃度的測定分別采用甘油磷酸氧化酶法和氰化高鐵血紅蛋白（HiCN）測定法在貝克曼庫爾特全自動生化分析儀AU680、邁瑞全自動細胞分析儀BC－3000Plus上進行檢測。

1．5統(tǒng)計學方法運用SSPS軟件對數據進行分析，組間比較采用方差分析，P＜0．05差異有統(tǒng)計學意義。兩組數據間比較采用t檢驗，P＜0．05差異有統(tǒng)計學意義。TaqScreen MPX V2．0 test核酸檢測試劑盒（瑞士Roche公司，批號：210761、215155），甘油三脂試劑盒（上海科華，批號：20160812），血細胞分析用溶血劑（邁瑞南京生物技術有限公司，批號：2016080808）。

表1 血紅蛋白對HCV RNA檢測影響結果

1．4實驗方法

1．4．1含HCV RNA的不同保存條件、溶血及脂肪血的標本的核酸檢測將不同溫度下保存的12～30倍LOD HCV RNA的標本保存一定時間后進行核酸檢測，檢測模式為混樣檢測+單檢。先將5份經核酸檢測為合格的透亮血漿標本與上述每組制備的標本(167μl/份)匯集為1份混樣標本（1ml），在Cobas s 201全自動核酸提取、擴增檢測平臺進行混樣、提取、擴增和檢測：⑴如混樣標本結果無Ct值，則該核酸檢測結果為陰性，表示該份標本HCV RNA未檢出，下一步該標本單獨進行核酸檢測（取1ml），如單獨檢測結果無Ct值表示該標本HCV RNA未檢出，如單獨檢測結果檢出Ct值表示該標本HCV RNA陽性；⑵如混樣標本結果檢出Ct值，則表示該標本HCV RNA陽性。

將制備的1份倍比稀釋的溶血或脂肪血標本和1份12～30倍LOD HCV RNA與4份經核酸檢測合格的透亮血漿標本匯集為1份混樣標本（1ml），在Cobas s 201全自動核酸提取、擴增檢測平臺進行混樣、提取、擴增和檢測：⑴如混樣標本結果無Ct值，則該核酸檢測結果為陰性，表示該份標本HCV RNA未檢出；⑵如混樣標本結果檢出Ct值，則表示該標本HCV RNA陽性。

表2 甘油三脂對HCV RNA檢測影響結果

2 結果

2．1血紅蛋白組NAT檢測結果血紅蛋白對HCV RNA檢測影響見表1。

2．2甘油三脂組NAT檢測結果甘油三脂對HCV RNA檢測影響見表2。

2．3不同保存條件組NAT檢測結果保存時間和保存溫度對HCV RNA檢測影響見表3。

3 討論

本文旨在確認用于NAT檢測的標本正確采集、處理及保存的關鍵控制點，進而確保本地區(qū)高效、高質量地完成NAT檢測工作，降低HBV、HCV、HIV經血傳播風險。本結果顯示，保存溫度在－30℃下4周內，其檢測Ct值差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0．05）。在低于37℃環(huán)境下，4h內保存的HCV RNA標本檢測Ct值差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0．05）。國內外有研究報道顯示，HCV RNA標本在－20℃保存保存1～7d檢測結果無差異[2]，甚至能保存1年[3]。我們的研究和上述的研究一致，因此在實際工作中，如不能及時完成HCV RNA的檢測工作，將標本血漿短時凍存在－30℃是可行的。

在保存溫度為4℃的條件下，我們的研究顯示保存72h內，HCV RNA標本檢測Ct值差異均無統(tǒng)計學意義，但在保存1～4周后，其檢測Ct值明顯增大，這與HCV RNA開始出現(xiàn)降解導致HCV RNA濃度下降有關，我們的結果與Gesson G等[4]發(fā)現(xiàn)HCV RNA血漿標本放置1周后下降0．467Log以及陸應玉[5]等發(fā)現(xiàn)4℃貯存2周后HCV RNA平均陽性率檢出下降至35%一致。姚鳳蘭等[6]的研究也發(fā)現(xiàn)9份弱陽性HCV RNA標本在4℃7d內保存，HCV RNA的含量沒有顯著的變化，但在保存2d后其濃度有下降的趨勢。所以，在日常HCV RNA檢測工作中，在采血后72h內，應盡早完成檢測工作[7]，以免HCV RNA在4℃冰箱長時間保存過程中出現(xiàn)降解的風險。另外我們還發(fā)現(xiàn)，在常溫25℃環(huán)境下，HCV RNA標本在保存48h后即出現(xiàn)降解的情況，在保存4周后甚至出現(xiàn)完全檢測不出HCV RNA，這與國外的Trabaud MA等[8]發(fā)現(xiàn)室溫放置3d，HCV RNA下降0．5Log以及國內劉長利[9]等研究發(fā)現(xiàn)的25℃保存48h病毒含量下降至原滴度的72．5%的研究一致。這也提醒我們工作人員，在采集檢測標本后應及時將標本放置4℃冰箱保存，減少HCV RNA降解的風險。

在溶血實驗的研究中，我們發(fā)現(xiàn)血紅蛋白濃度在5g/L以下時，HCV RNA檢測的情況沒有受到影響，但在血紅蛋白濃度在高于8g/L時，會出現(xiàn)HCV RNA檢測受影響的情況，李金明[10]的研究也發(fā)現(xiàn)了血紅蛋白影響核酸檢測的情況。這是因為盡管目前核酸檢測試劑中加入有蛋白酶，但是對高濃度血紅蛋白去除有限，血紅蛋白仍然可通過卟啉環(huán)與Taq酶不可逆結合而抑制Taq酶活性，最終影響核酸檢測。通過本次研究，我們確認了用于HCV RNA檢測的標本接收標準，即標本出現(xiàn)溶血現(xiàn)象時，其血漿血紅蛋白高于8g/L應拒收此份標本，要求送檢人員重新留取檢測樣本，拒收時可通過將8g/L的血紅蛋白標準樣本拍照作為比對標準。

脂血標本渾濁主要是血液中的低密度脂肪（乳糜微粒等）增多引起的，而人體血漿中乳糜微粒84%～88%是TG，有研究[11]認為血脂中的乳糜微粒能同光散射而導致的熒光淬滅作用使熒光信號強度降低，降低了擴增效率，然而，在本結果中，高濃度的TG并沒有影響HCV RNA的檢測，因此我們認為高血脂的標本原則可以接收，因為本實驗室HCV RNA檢測的模式為6混樣模式，即使是高濃度的血脂標本，在最終進入提取擴增階段，TG濃度已經被稀釋了6倍，影響HCV RNA檢測的可能性很小，但要注意的是，在進行混樣時，此份高濃度的標本最好與5份透亮的血漿標本進行混樣。

綜上所述，我們確認了用于本實驗室核酸檢測的標本正確采集、處理以及保存的關鍵控制點：高血脂標本可以接收，但在檢測時，此份標本應與無脂血標本進行混樣。溶血標本在高于8g/L時應通知送檢人員重新留取樣本。在采血后72h內應盡早完成檢測工作，若在采血后不能及時送檢標本，應將標本分離出血漿－30℃保存，再進行送檢。標本解凍后也應在72h內完成檢查工作。由于本次的標本濃度比較低，而且樣本數較少，因此可能會有個別實驗數據有一定的偏差。

表3 保存時間和保存溫度對HCV RNA檢測影響

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Q522，R512．91

A

1674－1129(2017)02－0228－03

10．3969/j.issn.1674－1129．2017．02．028

2016-12-21；

2017-03-21)

江西省衛(wèi)生計生委科技計劃項目，編號：20165521