別立莉，梁會(huì)濤，安慧娟

(河南省紅十字血液中心，河南鄭州450012)

抗體放散試驗(yàn)在直接抗人球蛋白試驗(yàn)陽(yáng)性患者中的應(yīng)用

別立莉，梁會(huì)濤，安慧娟

(河南省紅十字血液中心，河南鄭州450012)

目的探討抗體放散試驗(yàn)在直接抗人球蛋白試驗(yàn)（DAT）陽(yáng)性患者輸血前實(shí)驗(yàn)室檢查中的意義，為臨床輸血安全提供保障。方法通過(guò)回顧性分析74例患者的DAT陽(yáng)性強(qiáng)弱度、放散液和血清中抗體特異性比較、經(jīng)稀釋后的放散液中的抗體特異性，探討放散試驗(yàn)在輸血前檢查中的應(yīng)用。結(jié)果74例DAT陽(yáng)性反應(yīng)強(qiáng)弱度為：W+（13.5%），1+（31.1%），2+（32. 4%），3+（16.2%），4+（6.8%）；放散后抗體鑒定32例為陰性，16例放散液檢測(cè)到特異性同種抗體，和患者血清中的一致，并且所有患者均有輸血史；26例放散液為全凝集，進(jìn)行了稀釋，其中4例檢測(cè)到了同種抗體。結(jié)論抗體放散試驗(yàn)在輸血前檢查中并為常規(guī)試驗(yàn)，但對(duì)于DAT陽(yáng)性的患者來(lái)說(shuō)進(jìn)行放散試驗(yàn)是很有必要的。

DAT；輸血前檢查；放散試驗(yàn)；同種抗體；抗體效價(jià)

直接抗人球蛋白試驗(yàn)（DAT）是用于檢測(cè)紅細(xì)胞是否被不完全抗體或補(bǔ)體所致敏。通過(guò)對(duì)紅細(xì)胞進(jìn)行放散試驗(yàn)，能檢測(cè)出包被在紅細(xì)胞上IgG抗體的特異性。有文獻(xiàn)[1]指出獻(xiàn)血者中1：14000至1：1000的人和1%~15%的住院患者DAT試驗(yàn)會(huì)為陽(yáng)性，但是并不一定發(fā)生免疫介導(dǎo)的紅細(xì)胞破壞?？贵w放散試驗(yàn)根據(jù)抗原抗體反應(yīng)可逆的原理，將紅細(xì)胞表面的抗體釋放出來(lái)，再通過(guò)對(duì)放散液進(jìn)行抗體鑒定來(lái)明確是什么樣的抗體導(dǎo)致患者DAT陽(yáng)性?，F(xiàn)對(duì)DAT陽(yáng)性患者采集樣本進(jìn)行放散和抗體檢測(cè)，以探討輸血前檢查中DAT和放散試驗(yàn)的必要性。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象2012年1月至2015年12月鄭州地區(qū)各級(jí)醫(yī)院送檢并經(jīng)檢測(cè)DAT為陽(yáng)性的患者樣本74例。

1.2 試劑儀器KA-2200小型臺(tái)式血型血清學(xué)離心機(jī)（日本久保田公司）；抗-IgG+C3d、抗-IgG、抗-C3d、抗-M、抗-P（均為上海血液生物醫(yī)藥有限公司產(chǎn)品）；抗-E、抗-e、抗-C、抗-c(美國(guó)Immucor公司產(chǎn)品)；抗體鑒定16系譜細(xì)胞（荷蘭Sanquin公司產(chǎn)品）；6%白蛋白、IgG致敏紅細(xì)胞、酸放散試劑盒（長(zhǎng)春博德生物技術(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn)品）。

1.3 直接抗人球蛋白試驗(yàn)（試管法）[2]將EDTA抗凝的血液樣本用生理鹽水洗滌3次后配置成3%的紅細(xì)胞懸液，取2支干凈試管，分別標(biāo)記為測(cè)定管和對(duì)照管，向2支試管中分別加入1滴3%的紅細(xì)胞懸液，再向測(cè)定管中加入抗人球蛋白試劑（AHG）1滴，向?qū)φ展苤屑尤?%白蛋白1滴，混勻，1000×g離心15s，觀察凝集情況，評(píng)分并記錄結(jié)果。立即離心測(cè)定管出現(xiàn)凝集，而6%白蛋白對(duì)照管未出現(xiàn)凝集，直接抗球蛋白試驗(yàn)（DAT）陽(yáng)性，并根據(jù)凝集強(qiáng)弱度評(píng)分。如果6%白蛋白對(duì)照管在離心后出現(xiàn)凝集，則實(shí)驗(yàn)結(jié)果無(wú)效。如果試驗(yàn)過(guò)程中未觀察到凝集，加入IgG致敏紅細(xì)胞后發(fā)生凝集，則DAT為陰性。如果IgG致敏紅細(xì)胞不凝集，陰性結(jié)果無(wú)效，需重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 抗體酸放散試驗(yàn)[2]取DAT陽(yáng)性待檢血樣，離心棄去血清或血漿，用生理鹽水洗滌4次，留取約1ml的最后洗滌液，將1ml的待檢壓積紅細(xì)胞與1ml酸放散液混合均勻，室溫孵育1~2min，3000r/ min離心1min，立即將放散液移至另一支干凈試管，加入中和液調(diào)至pH值為近中性。

1.5 抗體鑒定試驗(yàn)取17支干凈試管，分別標(biāo)記為1~16號(hào)和自身對(duì)照，每管中先各加入2滴受檢者血清或放散液，再分別加入1滴對(duì)應(yīng)的3%的1~ 16號(hào)譜細(xì)胞和自身對(duì)照紅細(xì)胞懸液，混勻后1000×g離心15s，觀察凝集情況，評(píng)分并記錄結(jié)果，根據(jù)譜細(xì)胞格局表判斷抗體特異性。37℃孵育30min。1000×g離心15s，觀察溶血和凝集情況，評(píng)分并記錄結(jié)果，生理鹽水洗滌紅細(xì)胞3次，最后一次洗滌盡量移除上清，向紅細(xì)胞扣里加入抗人球蛋白試劑（AHG）1滴，充分混勻。1000×g離心15s。觀察溶血和凝集情況，評(píng)分并記錄結(jié)果。加入IgG致敏的試劑紅細(xì)胞確認(rèn)陰性結(jié)果的有效性。根據(jù)譜細(xì)胞格局表判斷抗體特異性。

2 結(jié)果

2.1 DAT陽(yáng)性強(qiáng)弱度特性和放散液檢測(cè)結(jié)果74例DAT陽(yáng)性反應(yīng)凝集強(qiáng)弱度評(píng)分結(jié)果：W+（2分）為13.5%；1+（5分）31.1%；2+（8分）32.4%；3+（10分）16.2%；4+（12分）6.8%。見(jiàn)表2。

表1 74例DAT陽(yáng)性凝集強(qiáng)弱度和放散液抗體鑒定結(jié)果

表2 放散液中的抗體和血清中的抗體特異性比較

表3 稀釋后的放散液和血清中的抗體特異性比較

2.2 患者放散液和血清的抗體特異性比較74例患者進(jìn)行抗體放散試驗(yàn)，放散液進(jìn)行抗體鑒定，32例為陰性，26例全凝集，16例在放散液中檢測(cè)到抗體特異性，并且在患者的血清中也存在這些抗體見(jiàn)表3。所有16例患者均有輸血史，DAT陽(yáng)性強(qiáng)弱度為W+到2+見(jiàn)表2。

2.3 患者經(jīng)稀釋后的放散液和血清的抗體特異性比較26例放散液全凝集患者的DAT陽(yáng)性強(qiáng)弱度為1+到4+見(jiàn)表2，所有放散液與試劑譜細(xì)胞均為全凝集。對(duì)這26例放散液用0.9%生理鹽水進(jìn)行1：1稀釋，然后進(jìn)行抗體鑒定。結(jié)果4例稀釋后的放散液檢測(cè)到抗體的特異性，并且有2例在血清中未檢測(cè)到抗體特異性。見(jiàn)表4。

3 討論

放散試驗(yàn)的目的是從致敏紅細(xì)胞上釋放抗體分子。放散方法的原理：⑴通過(guò)改變抗原抗體反應(yīng)的熱力學(xué)結(jié)構(gòu)，⑵通過(guò)中和或扭轉(zhuǎn)的力量破壞抗原抗體復(fù)合物，⑶通過(guò)破壞抗原抗體結(jié)合位置的結(jié)構(gòu)。通常的目標(biāo)是重新獲得有活性的抗體[1]。常用的放散方法有熱放散、乙醚放散、甘氨酸放散和二磷酸氯喹放散等。熱放散通常僅用于因ABO不相合引起的HDFN的調(diào)查，因?yàn)檫@些方法對(duì)ABO系統(tǒng)以外的抗體放散效果不好；乙醚放散常用于Rh系統(tǒng)引起的HDFN的檢測(cè)，但乙醚可導(dǎo)致紅細(xì)胞的破壞；甘氨酸在移除IgG自身抗體和同種抗體的能力上顯著優(yōu)于其他方法，但對(duì)Kell系統(tǒng)的抗原幾乎完全破壞；二磷酸氯喹放散對(duì)移除致敏紅細(xì)胞上抗體是有效的，雖然沒(méi)有甘氨酸和熱放散移除的能力強(qiáng)，但是它可以使DAT陽(yáng)性減弱[3-6]。因此需要根據(jù)不同的試驗(yàn)?zāi)康倪x擇放散試驗(yàn)的方法，本研究選用移除IgG抗體能力優(yōu)于其他方法的甘氨酸放散方法。

本研究對(duì)DAT陽(yáng)性的凝集強(qiáng)弱程度與放散液檢測(cè)結(jié)果做了分析（表2），發(fā)現(xiàn)16例放散液中有特異性抗體的患者，DAT凝集等級(jí)在W+至2+之間，Nathalang O等[7]的研究中對(duì)DAT陽(yáng)性、放散液發(fā)現(xiàn)有抗體的21例患者進(jìn)行DAT凝集強(qiáng)度統(tǒng)計(jì)也均在W+至2+之間，戴小波等[8]的研究結(jié)果中57例DAT陽(yáng)性的非自身免疫性溶血性貧血患者的DAT凝集強(qiáng)弱度也在W+至2+之間，與本研究結(jié)果基本一致。

對(duì)74例DAT陽(yáng)性患者進(jìn)行抗體放散試驗(yàn)，并對(duì)放散液進(jìn)行抗體特異性鑒定，32例為陰性，26例全凝集，16例在放散液中檢測(cè)到抗體特異性，并且在患者的血清中也存在這些抗體，詳見(jiàn)表3。26例患者經(jīng)放散后，放散液與試劑譜細(xì)胞反應(yīng)為全凝集，本研究又利用抗體稀釋后能夠?qū)⒒旌峡贵w分開，以有效的去除一種抗體以便檢測(cè)另一種抗體這一原理，為了去除自身抗體或其他抗體的影響，用0.9%生理鹽水進(jìn)行稀釋后，用試劑譜細(xì)胞再次檢測(cè)，結(jié)果4例分別存在有抗-Ce、抗-E、抗-Ec和抗-Jka，這是因?yàn)榛颊哌@些抗體完全吸附到了紅細(xì)胞表面，而自生抗體的存在又影響了這些抗體的檢出，對(duì)放散液進(jìn)行稀釋后，這些抗體才得以被檢測(cè)到。更有意義的是其中有2例放散液中發(fā)現(xiàn)的抗-Ec、抗-Jka（表4）在患者血清中并未檢測(cè)到，這很可能是這兩個(gè)抗體的數(shù)量較少，全部吸附到了患者的紅細(xì)胞上，以至于血清中無(wú)法檢測(cè)到，僅能通過(guò)放散試驗(yàn)檢測(cè)到。Yazer MH[9]也有同樣發(fā)現(xiàn)12.7%的樣本在放散后發(fā)現(xiàn)了血清中沒(méi)有檢測(cè)到的抗體。

紅細(xì)胞放散液中的特異性同種抗體多為免疫性抗體，其產(chǎn)生原因有：⑴受血者的血液中有同種抗體，與獻(xiàn)血者紅細(xì)胞上的抗原發(fā)生反應(yīng)；⑵獻(xiàn)血者的血漿、血漿衍生物以及紅細(xì)胞制品有同種抗體，與受血者的抗原發(fā)生反應(yīng)；四、母親血液中同種抗體通過(guò)胎盤，包被在胎兒紅細(xì)胞膜上；⑶器官移植和骨髓移植所產(chǎn)生的抗體等。目前輸血規(guī)程中規(guī)定輸血前檢測(cè)僅包括ABO、Rh血型和交叉配血試驗(yàn)，DAT和抗體放散試驗(yàn)以及抗體篩選和抗體鑒定未列入內(nèi)；而供血者常規(guī)檢查包括ABO、Rh血型，未包括抗體篩選和抗體鑒定。當(dāng)患者在輸注血液制品時(shí)一旦交叉配血試驗(yàn)漏檢或遇到弱的抗體，患者就有可能輸入紅細(xì)胞上抗原相對(duì)應(yīng)的抗體或血漿中抗體相對(duì)應(yīng)的抗原，導(dǎo)致DAT陽(yáng)性而發(fā)生溶血反應(yīng)。所以對(duì)患者和供血者進(jìn)行抗體篩選和抗體鑒定是很有必要的[10]，而放散試驗(yàn)作為輸血前常規(guī)檢查可能是沒(méi)有必要的，但對(duì)于有溶血性輸血反應(yīng)、自身溶血性貧血以及近期有過(guò)輸血史和輸血前檢查中發(fā)現(xiàn)有抗體的DAT患者來(lái)說(shuō)，進(jìn)行放散試驗(yàn)還是非常有必要的。特別是當(dāng)放散試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了血清中所沒(méi)有檢測(cè)到的抗體，在給患者輸注紅細(xì)胞制品時(shí)，就應(yīng)避開這些相應(yīng)的抗原，否則輸血只會(huì)使患者的溶血反應(yīng)加重。

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R457.1+3，R446.62

A

1674-1129(2017)02-0288-03

10.3969/j.issn.1674-1129.2017.02.053

2016-11-02；

2017-01-03)