周道平，陸偉桃

(廣州市黃埔區(qū)紅十字會(huì)醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東廣州510760)

耐碳青霉烯類藥物肺炎克雷伯菌耐藥基因研究

周道平，陸偉桃

(廣州市黃埔區(qū)紅十字會(huì)醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東廣州510760)

目的了解對(duì)碳青霉烯類藥物耐藥的肺炎克雷伯菌（CRKP）碳青霉烯酶基因的攜帶情況。方法收集本院2013年1月至2016年6月臨床標(biāo)本中分離的630株肺炎克雷伯菌，采用VITEK-2 Compact全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)進(jìn)行細(xì)菌鑒定和藥敏檢測(cè)以及改良Hodge試驗(yàn)篩選CRKP，采用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）檢測(cè)碳青霉烯酶基因，采用多位點(diǎn)序列分型（MLST）技術(shù)對(duì)CRPK進(jìn)行分子遺傳學(xué)分析。結(jié)果630株肺炎克雷伯菌中，61株對(duì)亞胺培南耐藥，為CRKP，占9.7%，CRKP對(duì)多種臨床常用抗菌藥物均顯著耐藥，對(duì)替加環(huán)素具有良好的敏感性。PCR結(jié)果顯示59株CRKP攜帶碳青霉烯酶基因，其中53株攜帶bla KPC-2型基因(89.8%)，4株攜帶bla NDM-1型基因（6.8%），2株攜帶bla OXA-48型基因（3.4%）。MLST分型主要以ST11為主（49株，80.3%)。結(jié)論我院CRKP基因型主要為KPC-2型，另外有散在NDM-1和OXA-48型，MLST分型主要為ST11型。

肺炎克雷伯菌；抗藥性細(xì)菌；碳青霉烯酶；多位點(diǎn)測(cè)序分型

肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）是一種常見的主要寄生于人體上呼吸道和腸道中的革蘭陰性桿菌，長(zhǎng)期大量使用抗生素或人體免疫力下降時(shí)可引起呼吸、消化以及泌尿系統(tǒng)等多部位感染[1]，是醫(yī)院內(nèi)感染重要的條件致病菌，同時(shí)也是臨床上比較常見的耐藥菌[2，3]。由于超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBLs）等耐藥機(jī)制的介導(dǎo)，肺炎克雷伯菌對(duì)常用的青霉素類以及頭孢菌素類等β-內(nèi)酰胺類藥物的耐藥率較高[4]，但對(duì)碳青霉烯類和β-內(nèi)酰胺酶抑制劑復(fù)合制劑的耐藥率相對(duì)較低[5]。但由于近幾年來碳青霉烯類藥物在臨床上的廣泛應(yīng)用，并且編碼碳青霉烯酶的基因位于可移動(dòng)的基因元件上，致使耐碳青霉烯類藥物的肺炎克雷伯菌（Carbapenem Resistant Klebsiella Pneumoniae，CRKP）的檢出率逐漸上升以及發(fā)生醫(yī)院內(nèi)感染的局部暴發(fā)流行[6-8]。本研究應(yīng)用多重PCR技術(shù)和多位點(diǎn)序列分型（multilocus sequence typing，MLST）技術(shù)對(duì)我院2013年1月至2016年6月分離的CRKP進(jìn)行基因分型研究，為指導(dǎo)臨床合理使用抗生素和院內(nèi)感染控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來源收集廣州市黃埔區(qū)紅十字會(huì)醫(yī)院2013年1月至2016年6月臨床分離的非重復(fù)肺炎克雷伯菌630株，篩選出碳青霉烯類藥物不敏感（美羅培南或亞胺培南）肺炎克雷伯菌61株，其中31株分離自下呼吸道標(biāo)本，16株分離自尿液標(biāo)本，6株分離自血液標(biāo)本，8株分離自其他無菌體液標(biāo)本。菌株鑒定和藥敏試驗(yàn)采用法國(guó)梅里埃公司的Vitek2-Compact全自動(dòng)微生物鑒定儀，碳青霉烯酶表型確證使用CLSI推薦的改良Hodge試驗(yàn)。質(zhì)控菌株大腸埃希菌ATCC 25922和肺炎克雷伯菌ATCC 700603、ATCC BAA 1705和ATCC BAAl706為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 藥物敏感試驗(yàn)應(yīng)用VITEK-2 Compact全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)檢測(cè)CRKP對(duì)阿米卡星、頭孢曲松、頭孢他啶、頭孢吡肟、哌拉西林/舒巴坦、美羅培南、亞胺培南、厄他培南、復(fù)方磺胺甲唑、環(huán)丙沙星和左氧氟沙星等藥物的敏感性，藥物敏感性判定標(biāo)準(zhǔn)參照CLSI的折點(diǎn)判讀標(biāo)準(zhǔn)[9]。應(yīng)用E-test條法檢測(cè)替加環(huán)素的敏感性，判斷標(biāo)準(zhǔn)參照美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）文件標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 細(xì)菌總DNA的提取采用煮沸法提取細(xì)菌總DNA，方法為挑取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌落3~5個(gè)，混懸于100μl超純水中，煮沸10min，15400g離心2min，上清使用分光光度計(jì)測(cè)量DNA含量，并分裝-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 碳青霉烯酶基因bla KPC、bla IMP、bla VIM、bla NDM-1和bla OXA-48檢測(cè)根據(jù)參考文獻(xiàn)[10]設(shè)計(jì)并合成PCR引物，引物序列見表1。PCR擴(kuò)增條件為：95℃5min；95℃45s，60℃45s，72℃1min，共35個(gè)循環(huán)；72℃8min。擴(kuò)增產(chǎn)物送Invitrogen公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)查詢（www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/）并確定基因類型。

表1 耐碳青霉烯類藥物肺炎克雷伯菌PCR擴(kuò)增引物序列

1.5 MLST分析通過對(duì)gapA、infB、mdh、pgi、rpoB、pheE和tonB 7個(gè)管家基因進(jìn)行PCR和測(cè)序，對(duì)所有CRKP進(jìn)行MLST分析。引物合成和反應(yīng)條件參照MLST數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//bigsdb.web.pasteur.fr），即94℃2min，94℃20s，50℃1min，72℃30s，35個(gè)循環(huán)；72℃5min。測(cè)序結(jié)果提交至MLST數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.pasteur.fr/recherche/genopole/ PF8/mlst/Kpneumoniae.html）進(jìn)行序列比對(duì)以確定菌株的序列型（Sequence Type，ST）。

2 結(jié)果

2.1 CRKP藥物敏感性檢測(cè)結(jié)果本次分離的61株CRKP對(duì)阿米卡星、頭孢曲松、頭孢他啶、頭孢吡肟、哌拉西林/舒巴坦、美羅培南、亞胺培南、厄他培南、復(fù)方磺胺甲噁唑、環(huán)丙沙星和左氧氟沙星的耐藥率分別為93.4%(57/61)、98.4%(60/61)、96.7% (59/61)、98.4%(60/61)、98.4%(60/61)、100.0%(61/ 61)、100.0%(61/61)、100.0%(61/61)、14.8%(9/61)、96.7%(59/61)和95.1%(58/61)，未檢出對(duì)替加環(huán)素耐藥菌株。

2.2 碳青霉烯酶基因檢測(cè)結(jié)果對(duì)61株CRKP進(jìn)行碳青霉烯酶基因擴(kuò)增和測(cè)序后，結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行并對(duì)，結(jié)果顯示有59株CRKP攜帶有碳青霉烯酶基因，其中53株攜帶bla KPC-2型基因，占89.8%(53/59)；4株攜帶bla NDM-1型基因，占6.8%(4/59)；2株攜帶bla OXA-48型基因，占3.4%(2/59)；未檢測(cè)到編碼VIM和IMP酶的基因，基因擴(kuò)增結(jié)果見圖1。

圖1 CRKP碳青霉烯酶基因擴(kuò)增結(jié)果

2.3 MLST分析結(jié)果將7個(gè)管家基因的基因測(cè)序結(jié)果與數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)結(jié)果顯示，61株CRKP中最常見的型別為ST11型，有49株，占80.3%，其次為ST101型（3株）、ST15型（3株）、ST437型（2株），ST17、ST709、ST147、ST2068型各1株。53株攜帶bla KPC-2基因的菌株中46株為ST11型，2株ST101型，2株ST15型，ST437、ST17型和ST709型各1株。

3 討論

肺炎克雷伯菌是臨床分離和醫(yī)院內(nèi)獲得性感染非常重要的條件致病菌之一，其可引起下呼吸道感染、尿路感染、敗血癥、肝膿腫等。碳青霉烯類抗菌藥物是治療肺炎克雷伯菌感染的有效藥物，但2015年CHINET對(duì)國(guó)內(nèi)主要地區(qū)20所醫(yī)院細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)顯示腸桿菌科細(xì)菌中耐碳青霉烯類藥物主要以肺炎克雷伯菌為主，并且肺炎克雷伯菌對(duì)碳青霉烯類藥物的耐藥率在2005年至2015年的10年間呈快速上升趨勢(shì)，從最開始的3%上升至2015年的15%左右[11]，使臨床的抗感染治療面臨巨大挑戰(zhàn)。

本次分離的CRKP具有多重耐藥的特點(diǎn)，對(duì)青霉素類、頭孢菌素類以及β內(nèi)酰胺類藥物的耐藥率非常高，幾乎全部耐藥，對(duì)喹諾酮類和氨基糖苷類藥物也具有較高的耐藥率，但對(duì)磺胺類抗菌藥物耐藥率較低，對(duì)替加環(huán)素?zé)o耐藥菌株，顯示良好的敏感性。

肺炎克雷伯菌對(duì)碳青霉烯類藥物產(chǎn)生耐藥的最主要的機(jī)制是其產(chǎn)生碳青霉烯酶，主要的碳青霉烯酶包括A類、B類和D類。A類主要有KPC、SME、IMI、NMC和GES等類型，以KPC型最為常見。KPC酶可水解碳青霉烯酶類藥物的β內(nèi)酰胺環(huán)，于1997年在美國(guó)北卡羅來納州被發(fā)現(xiàn)[12]，并命名為KPC-1，隨后在肺炎克雷伯菌中發(fā)現(xiàn)了11種KPC酶，國(guó)外以產(chǎn)KPC-3型酶的檢出率較高，而在我國(guó)臨床上以KPC-2型最為常見[13]。攜帶有KPC酶基因的肺炎克雷伯菌對(duì)亞胺培南和美羅培南高度耐藥。B類又稱金屬β-內(nèi)酰胺酶，主要有IMP、VIM和NDM-1等類型，可水解具有β-內(nèi)酰胺環(huán)的多種抗生素，水解活性不被克拉維酸/舒巴坦等復(fù)合劑抑制，對(duì)氨曲南無水解活性。D類酶又稱苯唑西林酶（OXA酶），在肺炎克雷伯菌中主要是OXA-48型[14]，其對(duì)亞胺培南親合力較高，但水解效能較低，不能水解氨曲南和廣譜頭孢菌素[15]。

結(jié)果顯示，本院分離的61株CRKP中有59株攜帶碳青霉烯酶基因，檢出率為96.7%，其中53株攜帶bla KPC-2型基因，占89.8%(53/59)，提示本院CRKP以KPC-2型為主，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[16，17]，同時(shí)提示，產(chǎn)KPC-2型碳青霉烯酶是肺炎克雷伯菌對(duì)碳青霉烯類藥物耐藥的最主要原因。本研究同時(shí)有2株CRKP未檢測(cè)出碳青霉烯酶基因，其對(duì)碳青霉烯類藥物耐藥的機(jī)制可能與高水平產(chǎn)AmpC酶，對(duì)碳青霉烯類藥物的親和力下降以及膜通透性改變或外排泵增強(qiáng)相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)4株CRKP攜帶bla NDM-1基因，2株攜帶bla OXA-48基因，未檢測(cè)到編碼VIM和IMP酶的基因。

MLST技術(shù)是一種源于多位點(diǎn)酶電泳分型（MLEE）技術(shù)的，基于核酸序列測(cè)定的細(xì)菌分型方法，通過PCR擴(kuò)增多個(gè)管家基因片段，測(cè)定其序列，分析菌株的變異。MLST分析結(jié)果可在不同的實(shí)驗(yàn)室間進(jìn)行比較，實(shí)現(xiàn)了全球范圍的數(shù)據(jù)交流。

研究顯示，世界范圍內(nèi)流行的CRKP主要為ST11和ST258型，二者有較近的親緣關(guān)系，僅tonB基因有差異[18，19]。我國(guó)以ST11型CRKP為主要流行株[18，20]，本研究顯示，本院分離的CRKP主要為ST11型，占80.3%，53株KPC-2型CRKP中有46株為ST11型，占88.5%，并未發(fā)現(xiàn)ST258型CRKP，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。

綜上所述，我院CRKP基因型主要為KPC-2型，MLST分型主要為ST11型，產(chǎn)KPC-2型碳青霉烯酶是我院肺炎克雷伯菌對(duì)碳青霉烯酶類藥物耐藥的主要原因，因此，臨床上需加強(qiáng)對(duì)CRKP的監(jiān)測(cè)，并采取有效措施預(yù)防CRKP的感染。

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Study on carbapenem resistance genes and genotypes of carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae

ZHOU Daoping，LU Weitao.Clinical Laboratory，the Red Cross Hospital of Huangpu District in Guangzhou City，Guangdong Province，Guangzhou 510760，China.

Objective To investigate the carbapenem resistance genes and genotypes of carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae(CRKP)isolates.Methods Six hundred and thirty isolates of Klebsiella pneumoniae were isolated from various clinical specimens between January 2013 and June 2016 in our hospital.Identification and antimicrobial susceptibility testing for Klebsiella pneumoniae isolates were conducted by VITEK-2 Compact automatic microbiological assay system.Modified Hodges test was used for detecting carbapenemase-producing isolates.The carbapenemase-encoding genes among CRKP isolates were identified by PCR and sequencing.Multilocus sequence typing(MLST)was used for determining the sequence type of CRKP isolates.Results Among 630 Klebsiella pneumoniae isolates，61 were resistant to imipenem with high-level resistance to most of clinically oftenused antimicrobial agents.Carbapenemase-encoding genes were identified in 59 isolates of CRKP，among which 53(89.8%)，4(6. 8%)and 2(3.4%)were found to carry blaKPC-2，bla NDM-1，and bla OXA-48.MLST results showed that ST11 was the most prevalent sequence type，accounting for 80.3%(49/61)of CRKP isolates.Conclusion In Guangzhou area，blaKPC-2 is the most prevalent carbapenemase gene and ST11 is the most prevalent sequence type among CRKP isolates.

Klebsiella pneumoniae；Antimicrobial resistance；Carbapenemase；Multilocus sequence typing

R446.5，Q939.92

A

1674-1129(2017)02-0212-03

10.3969/j.issn.1674-1129.2017.02.023

2017-01-19；

2017-03-17)

周道平，男，1973年生，學(xué)士學(xué)位，副主任技師，主要從事臨床微生物及免疫診斷研究。