靳廷麗，劉麗萍，易志強(qiáng)，張娜，唐翼龍，丁晨，廖清華

(1、江西省疾病預(yù)防控制中心，江西南昌330029；2、深圳市疾病預(yù)防控制中心，廣東深圳518055)

江西人群CCL3L1基因拷貝數(shù)與HIV感染相關(guān)性研究

靳廷麗1，劉麗萍1，易志強(qiáng)1，張娜1，唐翼龍1，丁晨1，廖清華2

(1、江西省疾病預(yù)防控制中心，江西南昌330029；2、深圳市疾病預(yù)防控制中心，廣東深圳518055)

目的研究江西省HIV/AIDS（艾滋病感染者/艾滋病病人）人群趨化性細(xì)胞因子配體蛋白CCL3L1（CC chemokine ligand 3－like－1）的拷貝數(shù)及其與HIV病毒（艾滋病病毒）易感性及艾滋病進(jìn)展的關(guān)系。方法收集192例HIV/AIDS和131例陽(yáng)性者配偶陰性血樣標(biāo)本，提取基因組DNA，應(yīng)用PRT（the Paralogue Ratio Test）法檢測(cè)其CCL3L1基因拷貝數(shù)，計(jì)算江西省人群CCL3L1基因拷貝數(shù)中位數(shù)，用SPPS統(tǒng)計(jì)軟件分析CCL3L1拷貝數(shù)與HIV感染的關(guān)系。結(jié)果江西人群CCL3L1基因拷貝數(shù)中位數(shù)為2；HIV慢性感染者與健康人無(wú)顯著性差異（P＞0．05）；第一次CD4淋巴細(xì)胞數(shù)與基因拷貝數(shù)的變化有顯著相關(guān)(P＜0．05)。結(jié)論江西人群的CCL3L1基因拷貝數(shù)與HIV易感性無(wú)相關(guān)性，與感染進(jìn)程有一定相關(guān)性。

江西；CCL3L1基因；艾滋病病毒；感染；相關(guān)性

CCL3L1蛋白是由CCL3L1基因編碼，它是一種強(qiáng)效化學(xué)趨化細(xì)胞因子，可以調(diào)節(jié)免疫、參與免疫細(xì)胞分化發(fā)育并介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，也是CCR5（HIV感染時(shí)主要輔助受體）的天然配體之一，據(jù)報(bào)道CCL3L1基因拷貝數(shù)量與HIV易感性和疾病進(jìn)程有著重要的關(guān)系[1，2]，CCL3L1基因拷貝數(shù)在不同個(gè)體之間、不同地域的人種之間是有差異的，在同一區(qū)域的同一人種的CCL3L1基因拷貝數(shù)均圍繞其平均值呈分散分布。例如，HIV陰性的非裔美洲人CCL3L1基因拷貝數(shù)平均為4個(gè)，而歐裔美洲人該值為2個(gè)[3，4]，對(duì)中國(guó)漢族人群的報(bào)道數(shù)值有1～4不等[5－7]，本研究針對(duì)江西省人群的CCL3L1基因拷貝數(shù)與HIV病毒感染相關(guān)性進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1．1研究對(duì)象收集2011年及之前確診的HIV/ AIDS患者血樣192份，男性110例，女性82例，平均年齡40歲，均已抗病毒治療并排除合并肺結(jié)核感染。同時(shí)收集131份健康人群血樣，該人群為陽(yáng)性者配偶，男性39例，女性92例，平均年齡為42歲。

1．2實(shí)驗(yàn)方法

1．2．1基因組DNA提取按照QIAGEN試劑盒說(shuō)明書提取DNA，提取的DNA濃度的測(cè)定利用NanoDrop－5000微量分光光度計(jì)，根據(jù)實(shí)際測(cè)量濃度值稀釋或濃縮至5ng/μl。CCL3L1基因擴(kuò)增的引物選擇參考Gonzalez E等[3]CCL3AF－FAM：TCATA GTGGGTTCTCTGTTTC，CCL3AR：ATCCAGGGCTGCTTACTT，擴(kuò)增條件37℃2min，95℃3min，預(yù)變性，94℃15s變性，60℃20s延伸，72℃20s，35個(gè)循環(huán)72℃10min 25℃1min反應(yīng)結(jié)束后，制備瓊脂糖凝膠進(jìn)行PCR產(chǎn)物鑒定，CCL3L1基因長(zhǎng)度為220bp，內(nèi)參CCL3為226bp。

1．2．2 PCR產(chǎn)物的處理及毛細(xì)管電泳分析將鑒定完成的PCR產(chǎn)物稀釋20倍，再分別將1μl稀釋后的PCR產(chǎn)物、1μl LIZ500分子量?jī)?nèi)標(biāo)和8μl Hi－Di Formamide置于0．2ml單管中渦旋振蕩10s，2000 r/min分離心15s。將處理好的產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到96孔自動(dòng)進(jìn)樣托盤上進(jìn)行毛細(xì)管電泳（原理如圖1）。見(jiàn)圖2。

圖1 來(lái)源Walker e tal./Genomics 93(2009)98-103

圖2 CCL3A基因毛細(xì)電泳圖譜

1．3數(shù)據(jù)分析根據(jù)樣本DNA與內(nèi)對(duì)照DNA擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度及熒光標(biāo)記信息，利用GeneMarker V2．2．0對(duì)ABI3130測(cè)序儀生成的數(shù)據(jù)文件進(jìn)行分析，輸出每個(gè)產(chǎn)物峰的峰面積值，輸出數(shù)據(jù)采用Excel進(jìn)行處理分析。利用參照基因峰面積值（I）對(duì)目標(biāo)基因峰面積值（S）進(jìn)行校準(zhǔn)后獲取目標(biāo)基因的準(zhǔn)確拷貝數(shù)。計(jì)算：CCL3L1基因拷貝數(shù)=目標(biāo)基因拷貝數(shù)/參考基因拷貝數(shù)×2。計(jì)算出各樣本的CCL3L1基因拷貝數(shù)，用統(tǒng)計(jì)軟件分別計(jì)算HIV陽(yáng)性者和陽(yáng)性者配偶的基因拷貝數(shù)的中位數(shù)；從艾滋病綜合防治信息系統(tǒng)中查找出隨訪后第一次CD4淋巴細(xì)胞數(shù)和最近一次CD4淋巴細(xì)胞數(shù)，并計(jì)算CD4淋巴細(xì)胞數(shù)平均每月下降個(gè)數(shù)；采用SPSS21統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，根據(jù)概率P＜0．05，判斷差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 HIV陽(yáng)性者和陽(yáng)性者配偶的基因拷貝數(shù)的中位數(shù)均為2。

表1 HIV陽(yáng)性者和陽(yáng)性者配偶的基因拷貝數(shù)情況

2．2 CCL3L1基因拷貝數(shù)與HIV易感性分析結(jié)果192名HIV/AIDS患者和131名健康的陽(yáng)性配偶的CCL3L1基因拷貝數(shù)用中位數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述，用卡方檢驗(yàn)CCL3L1基因拷貝數(shù)變異與HIV易感性的相關(guān)關(guān)系，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 CCL3L1基因拷貝數(shù)與HIV易感性進(jìn)行卡方檢驗(yàn)分兩種情況

2．3 CCL3L1基因拷貝數(shù)與CD4淋巴細(xì)胞數(shù)每月CD4淋巴平均變化數(shù)與CCL3L1基因拷貝數(shù)做相關(guān)統(tǒng)計(jì)。分別將前后兩次的CD4淋巴細(xì)胞數(shù)均分為三組，分別為大于350個(gè)/μl，200～350個(gè)/μl和小于200個(gè)/μl，與CCL3L1拷貝數(shù)中位數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述，用Spearman相關(guān)分析CCL3L1基因拷貝數(shù)變異與CD4淋巴細(xì)胞數(shù)變化關(guān)系。結(jié)果是與第一次CD4淋巴細(xì)胞數(shù)有顯著相關(guān)性，與最近一次CD4細(xì)胞數(shù)結(jié)果及CD4細(xì)胞平均月下降數(shù)均無(wú)相關(guān)性。

表3 與第一次CD4淋巴細(xì)胞數(shù)的關(guān)系

表4 與第二次CD4淋巴細(xì)胞數(shù)的關(guān)系

表5 與平均每月CD4淋巴細(xì)胞數(shù)變化的關(guān)系

3 討論

CCL3L1基因位于17q的一個(gè)重復(fù)區(qū)域，該區(qū)域包括CCL3L1和CCL4基因，它們?cè)诓煌瑐€(gè)體間存在拷貝數(shù)的差異。其編碼的CCL3L1蛋白是CCR5的高親和性配體，可最有效地抑制HIV-1與CCR5結(jié)合進(jìn)入細(xì)胞。早在2002年就有人提出CCL3L1基因拷貝數(shù)的變異可能會(huì)影響某些疾病的易感性和進(jìn)程，但CCL3L1基因拷貝數(shù)與HIV-1感染的關(guān)系尚無(wú)定論。2004年Bugeja MJ等[8]首先對(duì)CCL3L1基因與HIV易感性、感染進(jìn)程的影響進(jìn)行了人群研究。發(fā)現(xiàn)CCL3L1基因拷貝數(shù)與HIV易感性、感染進(jìn)程無(wú)關(guān)。

2005年Gonzalez E等[3]對(duì)不同地區(qū)和不同種族人群的CCL3L1基因拷貝數(shù)的分布進(jìn)行了全面研究，以相應(yīng)陰性人群的CCL3L1基因拷貝數(shù)的中位數(shù)為分界值，分析拷貝數(shù)與HIV感染易感性反應(yīng)關(guān)系，發(fā)現(xiàn)其中高于中位數(shù)者，隨拷貝數(shù)的增加獲得HIV感染的危險(xiǎn)性降低，而低于中位數(shù)者，隨拷貝數(shù)減少獲得HIV感染的危險(xiǎn)性增高。這些結(jié)果顯示，CCL3L1基因的相對(duì)拷貝數(shù)與HIV易感性之間存在劑量反應(yīng)關(guān)系，個(gè)體對(duì)HIV易感性的差異決定于其CCL3L1基因拷貝數(shù)在相應(yīng)種族人群的相對(duì)水平，即相對(duì)拷貝數(shù)，此外，CCL3L1拷貝數(shù)低于人群拷貝數(shù)中位數(shù)者的HIV感染者發(fā)展為艾滋病或死亡病程更短，提示CCL3L1基因相對(duì)拷貝數(shù)可影響艾滋病的發(fā)展進(jìn)程。

本研究針對(duì)江西人群CCL3L1基因拷貝數(shù)對(duì)HIV影響的關(guān)系，采用的方法是Armour JA等[9，10]建立的一種精確測(cè)量基因拷貝數(shù)的新方法-the Paralogue Ratio Test(PRT)，采用一對(duì)引物擴(kuò)增出兩種產(chǎn)物，一種是目的基因產(chǎn)物，另外一種是參考基因產(chǎn)物，基因拷貝數(shù)通過(guò)他們的比值獲得，這種方法已經(jīng)成功用于DEFB4基因拷貝數(shù)與牛皮癬的關(guān)系研究中[11，12]，并與Gonzalez E等[3]的檢測(cè)方法原理一致。本研究中陰性人群和陽(yáng)性人群的CCL3L1基因拷貝數(shù)中位數(shù)均為2，采用人群的CCL3L1基因相對(duì)拷貝數(shù)中位數(shù)2為分界點(diǎn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，研究的結(jié)果得出HIV易感性與基因相對(duì)拷貝數(shù)無(wú)相關(guān)性。由于CD4淋巴細(xì)胞是艾滋病病毒侵犯的主要免疫細(xì)胞，本研究通過(guò)參照我省艾滋病感染人群的CD4淋巴細(xì)胞數(shù)的相關(guān)研究[13-15]來(lái)分析CCL3L1基因拷貝數(shù)對(duì)艾滋病進(jìn)程影響，由于艾滋病常合并結(jié)核感染，為排除結(jié)核病對(duì)CD4淋巴細(xì)胞數(shù)的影響，我們收集血樣時(shí)已經(jīng)排除了合并結(jié)核病的樣本。研究結(jié)果顯示相對(duì)拷貝數(shù)與第一次CD4淋巴細(xì)胞數(shù)呈正相關(guān)性，而與第二次CD4淋巴細(xì)胞數(shù)及平均月CD4淋巴細(xì)胞數(shù)變化均無(wú)相關(guān)性，考慮原因可能為第一次CD4淋巴細(xì)胞數(shù)檢測(cè)時(shí)均未開(kāi)展抗病毒治療，而第二次是經(jīng)過(guò)了抗病毒治療，而且治療時(shí)間長(zhǎng)短不一，治療效果不一致，導(dǎo)致可比性降低，相比第一次CD4更有參考意義，由此提示CCL3L1基因相對(duì)拷貝數(shù)影響艾滋病進(jìn)程。由于本研究樣本量較小，陽(yáng)性者配偶者相對(duì)一般人群接觸艾滋病病毒的幾率更高，作為實(shí)驗(yàn)陰性對(duì)照更有意義，但是不能排除部分陽(yáng)性者配偶一直使用避孕套或者沒(méi)有性生活，因此和艾滋病病毒接觸機(jī)會(huì)就少，降低了陰性對(duì)照的可比性。我們得出的CCL3L1基因相對(duì)拷貝數(shù)與HIV易感性無(wú)相關(guān)性需進(jìn)一步數(shù)據(jù)支持，進(jìn)一步的研究需加大樣本量，并選定更具有參照意義的人群，收集更多的病程進(jìn)展的指標(biāo)如病毒載量作為參數(shù)等。本研究的成果為我們進(jìn)一步研究奠定了重要基礎(chǔ)。

[1]deSilva E，Stumpf MP.HIV and the CCR5-Delta32 resistance allele[J].FEMS Microbiol Lett，2004，241(1)：1-12.

[2]Edward J.Hollox，Boon-Peng Hoh.Human gene copy number variation and infectious disease[J].Human Genetics，2014，133（10）：1217-1233.

[3]Gonzalez E，KμLkarni H，Bolivar H，et al.The influence of CCL3L1 gene-containing segmental duplications on HIV-1/AIDS susceptibility[J].Science，2005，307(5714)：1434-1440.

[4]Aklillu E，Odenthal-Hesse L，Bowdrey J，et al.CCL3L1 copy number，HIV load，and immune reconstitution in sub-Saharan Africans [J].BMC Infect Dis，2013，(13)：536-539.

[5]柳雅立，石英，徐斌，等.中國(guó)健康人趨化性細(xì)胞因子CCL3L1的基因拷貝數(shù)及其與HIV-1易感性關(guān)系的初步研究[J].北京醫(yī)學(xué)，2010，32（6）：428-430.

[6]徐斌，石英，惠威，等.趨化性細(xì)胞因子CCL3L1基因拷貝數(shù)與HIV-1易感性研究[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)與診斷，2012，16(12)：2212-2215.

[7]鄭靈燕，裴元元，李淼新，等.CCL3L1基因拷貝數(shù)目變異與慢性乙肝的易感性相關(guān)[J].中國(guó)病理生理雜志，2011，27(10)：1951-1955.

[8]Bugeja MJ，Booth DR，Bennetts BH，et al.Analysis of the CCL3-L1 gene for association with HIV-1 susceptibility and disease progression[J].AIDS，2004，18(7)：1069-1071.

[9]Armour JA，Palla R，Zeeuwen PL，et al.Accurate，high-throughput typing of copy number variation using paralogue ratios from dispersed repeats[J].Nucleic Acids Research，2007，35(3)：19-23.

[10]Colobran R，Comas D，F(xiàn)aner R，et al.Population structure in copy number variation and SNPs inthe CCL4L chemokine gene[J]. Genes Immun，2008，9(4)：279-288.

[11]Shao W1，Tang J，Song W，et al.CCL3L1 and CCL4L1：variable gene copy number in adolescents with and without humanimmunodeficiency virus type 1(HIV-1)infection[J].Genes Immun，2007，8(3)：224-231.

[12]Hollox EJ，Huffmeier U，Zeeuwen PL，et al.Psoriasis is associated with increased beta-defensin genomic copy number[J].Nat Genet，2008，40(1)：23-25.

[13]楊健平，朱豐秀，黃棋.贛州市2007年至2012年新發(fā)現(xiàn)HIV感染者CD4檢測(cè)結(jié)果分析[J].實(shí)驗(yàn)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2013，(4)：381-383.

[14]胡芹，吳建英，張敏，等.125例HIV感染者首次CD4~+T淋巴細(xì)胞檢測(cè)分析[J].實(shí)驗(yàn)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2014，(4)：446-447.

[15]靳廷麗，廖清華，劉麗萍，等.江西省HIV感染者/AIDS人群首次CD4/CD8淋巴細(xì)胞數(shù)分析研究[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2014，6(24)：805-807.

Study of chemokine CCL3L1 gene copy number of people in Jiangxi province and its relationship with HIV-1 infection

JIN Tingli，LIAO Qinghua，LIU Liping，YI Zhiqiang ZHANG Na，TANG Yilong，DING Chen.Jiangxi Provincial Center for Disease Prevention and Control，Nanchang 330029，China.

Objective To study the chemokine CCL3L1 gene copy number of people in Jiangxi province and its relationship with HIV－1 infection．Methods Blood samples collected from the 192 cases of HIV/AIDS and 131 cases of HIV positive spouse who are HIV negative were used for the extraction of genomic DNA．The method of PRT(the Paralogue Ratio Test)was used to detect gene copy number of its CCL3L1，with that we calculated the median of CCL3L1 copy number in Jiangxi province．We investigated the relationship of CCL3L1 gene copy number with HIV by SPPS statistical software．Results The median of CCL3L1 copy number in Jiangxi province is two，and there is no statistical significant differences(P＞0．05)between the CCL3L1 copy number of HIV infected patients and that of healthy people．The first CD4 lymphocytes count after diagnosed is significantly correlated (P＜0．05)with CCL3L1 gene copy number．Conclusion The CCL3L1 gene copy numbers of people might not associate with the susceptibility to HIV but correlate with the progress of HIV/AIDS in Jiangxi．

Jiangxi；CCL3L1 HIV；Infection；Correlation

R512．91，R446．62

A

1674－1129(2017)02－0163－04

10．3969/j.issn.1674－1129．2017．02．008

2016-11-22；

2017-03-15)

江西省科技廳社會(huì)發(fā)展領(lǐng)域(20132BBG70098)

靳廷麗，1978年生，女，碩士，主管技師，主要從事艾滋病檢測(cè)與防制工作。Email:150225439@qq.com

廖清華，1972年生，主要從事艾滋病檢測(cè)與防制工作，Email：190898720@qq.com