于曉輝，李啟明，李秀玲，沈榮，張愛(ài)華，張?jiān)茲?/p>

1.中國(guó)生物技術(shù)股份有限公司，北京 100029 2.北京生物制品研究所有限責(zé)任公司，北京 101111 3.蘭州生物制品研究所有限責(zé)任公司，蘭州 730046

人用疫苗規(guī)模化生產(chǎn)工藝與技術(shù)

于曉輝1，李啟明2，李秀玲2，沈榮3，張愛(ài)華1，張?jiān)茲?

1.中國(guó)生物技術(shù)股份有限公司，北京 100029 2.北京生物制品研究所有限責(zé)任公司，北京 101111 3.蘭州生物制品研究所有限責(zé)任公司，蘭州 730046

張?jiān)茲?，中?guó)生物技術(shù)股份有限公司研究員，博士，總裁助理。主要從事新型病毒性疫苗研發(fā)及產(chǎn)業(yè)化、生物技術(shù)藥物（單抗等）的開(kāi)發(fā)、免疫診斷試劑的開(kāi)發(fā)及產(chǎn)業(yè)化。擔(dān)任“十二五”傳染病重大專項(xiàng)“新型乙肝疫苗研制”項(xiàng)目組組長(zhǎng)和“鼻腔噴霧型乙肝疫苗的研究”課題組組長(zhǎng)。作為課題負(fù)責(zé)人承擔(dān)“十二五”重大新藥創(chuàng)制項(xiàng)目課題“原創(chuàng)性全人源單克隆抗體藥物研發(fā)技術(shù)平臺(tái)的建立及應(yīng)用”。作為主要執(zhí)行人承擔(dān)“863”課題“甲型H1N1流感病毒裂解疫苗上市后效果和安全性評(píng)價(jià)”和“國(guó)藥集團(tuán)技術(shù)創(chuàng)新產(chǎn)學(xué)研聯(lián)盟建設(shè)”。作為課題負(fù)責(zé)人完成北京市科技計(jì)劃專項(xiàng)課題“生物藥（疫苗類）中試放大服務(wù)平臺(tái)標(biāo)準(zhǔn)體系的建設(shè)”。發(fā)表SCI文章5篇。 主持“抗生素系列檢測(cè)試劑”的研制工作，已完成8種抗生素食品安全檢測(cè)試劑的研制。2013年“肝炎診斷試劑的研制”獲得省科技進(jìn)步二等獎(jiǎng)。E-mail:zhangyuntao@sinopharm.com

隨著社會(huì)進(jìn)步和人類健康需求的提高，人用疫苗研發(fā)及生產(chǎn)技術(shù)發(fā)展迅速，我國(guó)在疫苗研發(fā)技術(shù)和生產(chǎn)工藝的改進(jìn)取得了長(zhǎng)足的發(fā)展。分別闡述了滅活病毒性疫苗、多糖蛋白結(jié)合疫苗、基因工程疫苗規(guī)?；a(chǎn)工藝和技術(shù)的國(guó)內(nèi)外現(xiàn)狀和未來(lái)發(fā)展趨勢(shì)。

疫苗；規(guī)模化生產(chǎn)；工藝；技術(shù)

疫苗在保障國(guó)民健康和國(guó)家生物安全方面發(fā)揮了巨大作用。我國(guó)自實(shí)施計(jì)劃免疫以來(lái)，傳染病的發(fā)病率和死亡率得到有效控制，成功消滅了天花、脊髓灰質(zhì)炎和孕婦新生兒破傷風(fēng)，常見(jiàn)兒童傳染病如麻疹、腮腺炎、風(fēng)疹、百日咳、白喉、破傷風(fēng)、乙型性腦炎、流行性腦脊髓膜炎等疾病的發(fā)病率和死亡率下降幅度在95%以上，乙肝感染降到1%以下，具有巨大的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。我國(guó)疫苗產(chǎn)業(yè)雖已取得了長(zhǎng)足的進(jìn)展，但疫苗產(chǎn)業(yè)的自主創(chuàng)新能力、新產(chǎn)品轉(zhuǎn)化、關(guān)鍵核心技術(shù)應(yīng)用、規(guī)?；a(chǎn)工藝和技術(shù)水平，同發(fā)達(dá)國(guó)家相比仍有一定差距。而且隨著全球經(jīng)濟(jì)一體化和社會(huì)的迅速發(fā)展，抗生素濫用、大氣污染等多種因素影響，傳染病的多發(fā)和高發(fā)態(tài)勢(shì)仍然沒(méi)有得到根本改變，生物恐怖的危害也不斷加劇，一些重大疾病及新發(fā)、突發(fā)傳染病，如艾滋病、流感、登革熱、手足口病、埃博拉等仍嚴(yán)重威脅著人類生命健康。

1 國(guó)內(nèi)外滅活病毒性疫苗的生產(chǎn)工藝與技術(shù)

滅活病毒性疫苗為通過(guò)化學(xué)、熱處理或輻射處理經(jīng)培養(yǎng)純化的病毒性疫苗，其主要優(yōu)點(diǎn)是：與活病毒疫苗相比更穩(wěn)定和安全，不會(huì)發(fā)生因疫苗接種而導(dǎo)致的感染；被滅活但仍可被機(jī)體的免疫系統(tǒng)識(shí)別，并產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答；可用于免疫系統(tǒng)相對(duì)較弱的個(gè)體；穩(wěn)定性較好，無(wú)需冷凍，方便運(yùn)輸。其缺點(diǎn)主要為免疫原性相對(duì)較弱，一般需進(jìn)行多次接種。

目前已經(jīng)上市的滅活病毒性疫苗主要有脊髓灰質(zhì)炎滅活疫苗、甲型肝炎滅活疫苗、流感病毒滅活疫苗、人用狂犬滅活疫苗、乙型腦炎滅活疫苗、雙價(jià)腎出血熱滅活疫苗（表1）[1]。

1.1 細(xì)胞基質(zhì)和培養(yǎng)方式

目前國(guó)內(nèi)外滅活病毒性疫苗的細(xì)胞基質(zhì)主要為人二倍體細(xì)胞、原代細(xì)胞、雞胚細(xì)胞和Vero細(xì)胞。其中人二倍體細(xì)胞主要有2BS株、KMB-17株、WI-38株和MRC-5株。各種細(xì)胞的特性不一樣，培養(yǎng)方式也不一樣。人二倍體細(xì)胞傳代比例和傳代代次比較受限，不利于大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)，且對(duì)培養(yǎng)基和牛血清質(zhì)量要求較高。原代細(xì)胞主要有地鼠腎細(xì)胞、沙鼠腎細(xì)胞，操作繁瑣，存在外源因子污染風(fēng)險(xiǎn)。人二倍體細(xì)胞和原代細(xì)胞的培養(yǎng)方式主要為轉(zhuǎn)瓶、細(xì)胞工廠，這兩種培養(yǎng)方式較為傳統(tǒng)，每批培養(yǎng)體積較小，較為費(fèi)時(shí)費(fèi)力，其生產(chǎn)規(guī)模僅僅是轉(zhuǎn)瓶或細(xì)胞工廠數(shù)量上的增加，難以規(guī)?；糯蟆?/p>

Vero細(xì)胞是第一個(gè)可連續(xù)傳代的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，來(lái)源于非洲綠猴腎細(xì)胞，目前廣泛用于疫苗的生產(chǎn)，為滅活病毒性疫苗常用的細(xì)胞基質(zhì)。國(guó)內(nèi)外主要采用微載體生物反應(yīng)器進(jìn)行Vero細(xì)胞培養(yǎng)。與細(xì)胞工廠培養(yǎng)方式相比，微載體生物反應(yīng)器培養(yǎng)具有明顯的優(yōu)點(diǎn)：可進(jìn)行高密度培養(yǎng)；可保證細(xì)胞在規(guī)定細(xì)胞傳代限定代次內(nèi)進(jìn)行分級(jí)放大，易于進(jìn)行規(guī)模化放大。國(guó)外已有企業(yè)建立了在8周內(nèi)從1mL安瓶到6000L生物反應(yīng)器的Vero細(xì)胞放大生產(chǎn)工藝，在整個(gè)規(guī)?；糯筮^(guò)程中Vero細(xì)胞的產(chǎn)量和活性并不降低[2]。表2顯示了不同反應(yīng)器規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)的生長(zhǎng)狀態(tài)。從中可以看出，在反應(yīng)器內(nèi)進(jìn)行15～6000L規(guī)?；糯笈囵B(yǎng)時(shí)，Vero細(xì)胞密度體現(xiàn)較好的一致性[2]。

正是由于Vero細(xì)胞在病毒性疫苗生產(chǎn)中的應(yīng)用，使得現(xiàn)代病毒性疫苗的生產(chǎn)進(jìn)入工業(yè)化、規(guī)?；瘯r(shí)代，生產(chǎn)過(guò)程更加可控，批間一致性更好。目前國(guó)內(nèi)外主流的以Vero細(xì)胞為基質(zhì)的疫苗生產(chǎn)均采用微載體生物反應(yīng)器培養(yǎng)工藝。

以Vero細(xì)胞為基質(zhì)生產(chǎn)的滅活病毒性疫苗主要有脊髓灰質(zhì)炎滅活疫苗、狂犬病滅活疫苗、日本乙型腦炎滅活疫苗，目前Vero細(xì)胞還被用于小兒輪狀病毒活疫苗Rotateq1（Merck）和Rotarix1（葛蘭素史克）[3]、H5N1大流感疫苗Preflucel1（Baxter）[4]、日本腦炎疫苗Ixiaro1（Intercell）的生產(chǎn)[2]。此外，還被批準(zhǔn)用于天花活疫苗ACAM20001（Sanofi Pasteur）的生產(chǎn)[2]。

表1 已上市滅活病毒性疫苗

表2 不同規(guī)格生物反應(yīng)器培養(yǎng)Vero細(xì)胞

Vero細(xì)胞等傳代細(xì)胞培養(yǎng)均采用含血清培養(yǎng)，但含血清培養(yǎng)對(duì)于病毒性疫苗的下游純化也有較高的要求，需要嚴(yán)格控制血清中BSA的含量、純化的回收率等一些關(guān)鍵的指標(biāo)，所以無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)成為國(guó)內(nèi)外細(xì)胞培養(yǎng)研究熱點(diǎn)之一。Vero細(xì)胞的研究的另一個(gè)熱點(diǎn)是進(jìn)行細(xì)胞懸浮化高密度培養(yǎng)。與使用微載體不同，細(xì)胞進(jìn)行懸浮化培養(yǎng)后，細(xì)胞的貼壁特性發(fā)生了改變，細(xì)胞不需要消化可直接傳代，并且可以提高細(xì)胞的發(fā)酵密度。

1.2 生產(chǎn)工藝

國(guó)內(nèi)外的滅活病毒性疫苗均需要經(jīng)過(guò)收獲、澄清、濃縮、純化、滅活等生產(chǎn)工藝。其中純化主要采用柱層析或蔗糖密度梯度離心法。這兩種方式各有優(yōu)缺點(diǎn)：層析法便于線性放大，批間一致性較好，但是試劑成本較高；蔗糖密度梯度離心法純化的抗原成分單一，可有效區(qū)分空心和實(shí)心病毒顆粒，但每批處理量較小，后期需要除糖處理。國(guó)內(nèi)外上市的滅活病毒性疫苗多采用層析純化工藝。

目前病毒滅活主要采用β-丙內(nèi)酯和甲醛兩種滅活劑。β-丙內(nèi)酯常溫下是無(wú)色黏稠狀液體，主要通過(guò)作用于病毒RNA從而達(dá)到滅活病毒的效果。目前上市的疫苗中采用β-丙內(nèi)酯滅活的主要有狂犬疫苗和雙價(jià)腎出血熱滅活疫苗。

在疫苗研究初期人們就已使用甲醛進(jìn)行細(xì)菌和病毒性疫苗的滅活。甲醛對(duì)于病毒核酸和蛋白質(zhì)都具有破壞作用。甲醛對(duì)單鏈核酸的破壞最為有效，因此常被用于RNA病毒的滅活。脊髓灰質(zhì)炎滅活疫苗、甲型肝炎滅活疫苗、流感病毒滅活疫苗、乙型腦炎滅活疫苗等均采用甲醛滅活工藝。

1.3 質(zhì)量控制

滅活病毒性疫苗的主要控制指標(biāo)為病毒抗原活性成分、純度以及宿主細(xì)胞DNA、宿主細(xì)胞蛋白（HCP）、滅活劑等的殘留成分控制。純度的檢測(cè)方法主要有HPLC、SDS-PAGE或比活等指標(biāo)。其中不同疫苗對(duì)Vero細(xì)胞殘余DNA含量要求不太統(tǒng)一，WHO生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)化專業(yè)委員會(huì)評(píng)估殘留DNA引起的轉(zhuǎn)化事件的風(fēng)險(xiǎn)后認(rèn)為注射產(chǎn)品的DNA含量每劑小于10ng均可以接受[5]。目前，國(guó)內(nèi)的狂犬疫苗等中的Vero細(xì)胞殘余DNA含量標(biāo)準(zhǔn)為每劑不高于100pg。但美國(guó)上市的IPV（IPOL?，Sanof Pasteur）Vero細(xì)胞殘余DNA含量每劑低于10pg。國(guó)內(nèi)上市的sIPV DNA含量為每劑不高于50pg。Vero細(xì)胞HCP含量一般為每劑不高于50ng。

2 多糖蛋白結(jié)合疫苗規(guī)模化生產(chǎn)工藝與技術(shù)

2.1 國(guó)外行業(yè)現(xiàn)狀

2.1.1 肺炎球菌結(jié)合疫苗

目前，全球已上市的肺炎球菌結(jié)合疫苗有3種，分別是惠氏（Wyeth）公司生產(chǎn)的7價(jià)肺炎球菌結(jié)合疫苗Prevnar7（2000年上市）和13價(jià)肺炎球菌結(jié)合疫苗Prevnar13（2010年上市），以及葛蘭素史克公司生產(chǎn)的11價(jià)肺炎球菌結(jié)合疫苗Synf orix（2009年上市）[6-8]。

（1）Prevnar

Prevnar7配方中包括了4、6B、9V、14、18C、19F、23F共7個(gè)血清型的結(jié)合物，Prevnar13包括了1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F共13個(gè)血清型的結(jié)合物，比Prevnar7多6個(gè)型別的結(jié)合物（1、3、5、6A、7F、19A），兩者均以CRM197為載體蛋白，均為磷酸鋁佐劑吸附劑型?；菔瞎窘Y(jié)合物制備采用的工藝路線為：將天然多糖進(jìn)行酸水解降低分子量至適宜范圍（有些型多糖在氧化反應(yīng)中自行降解，不需要預(yù)先進(jìn)行水解），用高碘酸鈉氧化多糖鄰羥基使多糖重復(fù)單位產(chǎn)生醛基，醛基與CRM197分子上的氨基，在還原劑（如NaBH4）存在的條件下發(fā)生還原胺化反應(yīng)生成酰胺鍵，該方法被稱為還原胺化法。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是對(duì)多糖重復(fù)單位上的鄰羥基進(jìn)行可控的修飾，不破壞多糖分子的其他結(jié)構(gòu)，易于質(zhì)控。缺點(diǎn)是還原胺化反應(yīng)需要的時(shí)間較長(zhǎng)，有的型結(jié)合反應(yīng)需要5d。在0.5mL Prevnar13中，有12種血清型多糖各2μg，4μg 6B型多糖，0.125mg磷酸鋁佐劑。Prevnar13的劑型為不含膠乳的單劑預(yù)充式注射器灌裝注射液[9-10]。

（2）Synf orix

Synf orix配方包括1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F、23F共10個(gè)血清型結(jié)合物。該產(chǎn)品使用了3種不同的載體蛋白，其中1、4、5、6B、7F、9V、14、23F載體蛋白為不可分型流感嗜血桿菌表面蛋白D（PD），19F載體蛋白為白喉類毒素（DT），18C載體蛋白為破傷風(fēng)類毒素（TT）。劑型同樣為磷酸鋁佐劑吸附劑型（0.5mg磷酸鋁佐劑/劑）。每劑疫苗含1、5、6B、7F、9V、14、23F這7個(gè)血清型多糖各1μg，4、18C、19F各3μg。所采用的技術(shù)路線為對(duì)除5、6B、23F這3個(gè)型外的其他天然多糖分子進(jìn)行微流化（microf uidization）處理以降低分子量，在不同條件下用1-氰基-4-（二甲氨基）吡啶四氟硼酸鹽［1-cyano-4-（dimethylamino）pyridinium tetraf uo-roborate，CDAP］將多糖的羥基活化為氰酸酯，活化后的多糖的氰酸酯通過(guò)與載體蛋白或己二酸二酰肼（adipicdihydazide，ADH）衍生的載體蛋白的氨基或肼基形成異脲衍生物而實(shí)現(xiàn)結(jié)合。其原理與傳統(tǒng)的溴化氰活化法相同，但活化條件更加溫和，活化物副反應(yīng)發(fā)生率低，對(duì)多糖的結(jié)構(gòu)改變較少。與還原胺化法相比，耗時(shí)少。此方法的缺點(diǎn)是活化時(shí)間僅幾十秒，要在這幾十秒內(nèi)對(duì)溶液迅速變化的pH進(jìn)行控制并不容易，由于多糖活化和結(jié)合是連續(xù)完成的，難以對(duì)多糖活化進(jìn)行有效質(zhì)控，反應(yīng)條件偏堿性，對(duì)多糖上堿性條件敏感的基團(tuán)難免會(huì)造成破壞，結(jié)合載體蛋白利用率不高[11]。

2.1.2 腦膜炎球菌多價(jià)結(jié)合疫苗

當(dāng)前國(guó)際上腦膜炎球菌結(jié)合疫苗的發(fā)展趨勢(shì)為包含A、C、Y、W135等4個(gè)血清群的多價(jià)結(jié)合疫苗，目前全球已上市的有3家產(chǎn)品，分別為賽諾菲巴斯德的Menactra、諾華的Menveo（2014年被葛蘭素史克收購(gòu)）、葛蘭素史克的Nimenrix。

此外，還有一種聯(lián)合疫苗，葛蘭素史克的C、Y群腦膜炎球菌與b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗，其產(chǎn)品名為Menhibrix。

（1）Menactra

液體劑型，2005年獲得批準(zhǔn)上市，規(guī)格為0.5mL，其中含A、C、Y、W135群腦膜炎球菌多糖各4μg，含載體蛋白白喉類毒素DT約48μg。

其基本工藝路線為：①用弱酸和雙氧水水解多糖，制備多糖水解物；②各群多糖水解物分別按照不同工藝進(jìn)行衍生（A群衍生物為多糖溶液中加入EDAC和ADH，在A群多糖的磷酸基團(tuán)上連接肼基。C群、Y群、W135群衍生物為利用氰基硼氫化鈉將ADH與多糖的末端醛基結(jié)合，衍生出肼基。然后多糖衍生物溶液加入EDAC，直接與DT結(jié)合）。

（2）Menveo

2010年獲得批準(zhǔn)上市。A群為凍干劑型，C、Y、W135群為液體劑型，規(guī)格為0.5mL。每劑含A群多糖10μg，C、Y、W135群多糖各5μg，載體蛋白為CRM197蛋白。

其基本工藝路線為：首先多糖用弱酸水解為分子量約為12～16個(gè)重復(fù)單位的片段；在還原劑作用下，將多糖的末端醛基還原成氨基；然后經(jīng)酯化產(chǎn)生末端活性酯基團(tuán)；最后與CRM197結(jié)合[12]。

（3）Nimenrix

2012年獲得批準(zhǔn)上市，為凍干劑型，蔗糖作為賦形劑。每劑含A、C、Y、W135群多糖各5μg，載體蛋白為破傷風(fēng)類毒素。

其基本工藝路線如下。①將莢膜多糖進(jìn)行降解。②采用氰基活化法活化多糖。③A群和C群結(jié)合：多糖用CDAP活化后與ADH進(jìn)行衍生，然后與TT結(jié)合；④Y群和W135群結(jié)合：用CDAP活化后直接與TT結(jié)合。

（4）Menhibrix

2012年獲得批準(zhǔn)上市。為凍干劑型，賦形劑為蔗糖。每劑含b型流感嗜血桿菌莢膜多糖2.5μg，C、Y群多糖各5μg。載體蛋白為破傷風(fēng)類毒素。每劑含12.6mg蔗糖。

2.2 國(guó)內(nèi)行業(yè)現(xiàn)狀

2.2.1 13價(jià)肺炎球菌結(jié)合疫苗

國(guó)內(nèi)企業(yè)尚無(wú)上市的產(chǎn)品，當(dāng)前進(jìn)度領(lǐng)先的為玉溪沃森，已經(jīng)完成Ⅲ期臨床疫苗的接種工作，蘭州生物正在進(jìn)行Ⅱ期臨床研究，民海生物也已進(jìn)入了臨床研究。

2.2.2 AC群腦膜炎球菌結(jié)合疫苗

我國(guó)在20世紀(jì)80年代已開(kāi)始研發(fā)A群腦膜炎球菌結(jié)合疫苗（TT為載體），上海生物制品研究所采用的先將蛋白質(zhì)衍生后與多糖偶聯(lián)的工藝，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明該法可增強(qiáng)結(jié)合物中多糖的免疫原性[13]，但研究未能進(jìn)一步持續(xù)下去。后來(lái)國(guó)內(nèi)多使用先將多糖衍生，再與蛋白質(zhì)載體偶聯(lián)的方法研制腦膜炎球菌結(jié)合疫苗。

2006年以來(lái)我國(guó)先后有4家企業(yè)的AC群腦膜炎球菌結(jié)合疫苗獲準(zhǔn)生產(chǎn)（表3）。這些產(chǎn)品都以TT為載體，每劑每群多糖含量為10μg，以乳糖為保護(hù)劑；均采用氰基活化法進(jìn)行多糖的衍生；結(jié)合物都采用柱層析純化工藝。

2.2.3 ACYW135群腦膜炎球菌結(jié)合疫苗

ACYW135群腦膜炎球菌結(jié)合疫苗在國(guó)內(nèi)尚未形成上市產(chǎn)品，據(jù)統(tǒng)計(jì)，國(guó)內(nèi)已有6家企業(yè)獲得臨床研究批件并進(jìn)入臨床階段。進(jìn)度最快的已經(jīng)完成Ⅲ期臨床研究，正在進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。

3 基因工程疫苗規(guī)?；a(chǎn)工藝和技術(shù)

基因工程疫苗是指使用DNA重組技術(shù)，改造病原微生物的基因組，以降低其致病性，提高其免疫原性；或者將病原微生物基因組中的一個(gè)或多個(gè)保護(hù)性抗原編碼的基因片段克隆到表達(dá)載體，通過(guò)原核或真核表達(dá)系統(tǒng)誘導(dǎo)表達(dá)外源蛋白，經(jīng)純化等工藝步驟制成疫苗，接種動(dòng)物產(chǎn)生保護(hù)性抗體，達(dá)到防治傳染病的目的。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)、反相遺傳學(xué)和結(jié)構(gòu)生物學(xué)等理論研究和技術(shù)方法的不斷突破，以及專業(yè)儀器的不斷升級(jí)，基因工程疫苗的進(jìn)展也日新月異。目前利用基因工程技術(shù)已經(jīng)使用和正在研制開(kāi)發(fā)的新型疫苗主要有基因工程亞單位疫苗、基因工程活載體疫苗、核酸疫苗、合成肽疫苗、轉(zhuǎn)基因植物疫苗等，這些疫苗統(tǒng)稱為基因工程疫苗。與傳統(tǒng)疫苗相比，基因工程疫苗具有如下諸多優(yōu)勢(shì)：①抗原成分明確，表達(dá)通路清楚可控，安全性高；②生產(chǎn)成本低，工藝步驟穩(wěn)定，易于規(guī)模化放大；③質(zhì)量控制的方法和標(biāo)準(zhǔn)具有一定通用性，從而提高安全性；④通過(guò)載體或抗原蛋白的上游設(shè)計(jì)，可構(gòu)建能夠?qū)Χ喾N疾病產(chǎn)生保護(hù)的多價(jià)疫苗。現(xiàn)在基因工程疫苗已成為生物制品產(chǎn)業(yè)發(fā)展的一種趨勢(shì)，在各種疾病的防控方面發(fā)揮重要作用。

表3 我國(guó)已上市的AC群腦膜炎球菌結(jié)合疫苗

基因工程疫苗的生產(chǎn)技術(shù)流程包括四個(gè)步驟：上游保護(hù)性抗原/表位和表達(dá)載體設(shè)計(jì)，基因工程菌/細(xì)胞構(gòu)建，大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)，目的蛋白純化?；蚬こ痰鞍椎难邪l(fā)和規(guī)模化生產(chǎn)進(jìn)入門(mén)檻高，尤其是建立工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)平臺(tái)，需要技術(shù)、人才和資本的多年積累。其中，高表達(dá)工程菌株/細(xì)胞株的構(gòu)建和下游生產(chǎn)純化工藝是關(guān)鍵技術(shù)[14]。以提高單位制品產(chǎn)量、細(xì)胞高密度培養(yǎng)及表達(dá)[15]、簡(jiǎn)化生產(chǎn)工藝、降低生產(chǎn)成本、保證大規(guī)模生產(chǎn)制品質(zhì)量為目的的核心工藝開(kāi)發(fā)已成為各大生物公司競(jìng)相開(kāi)展的前沿課題。

3.1 國(guó)外基因工程疫苗規(guī)?；a(chǎn)工藝與技術(shù)

國(guó)際上一些知名疫苗制造企業(yè)在基因工程疫苗的制備方面已開(kāi)始逐漸走向工藝規(guī)?；⒆詣?dòng)化和一次性化制備階段。工藝的規(guī)?；闆r在一定程度上反映了制造工藝的先進(jìn)性和穩(wěn)定性。在大幅降低了疫苗產(chǎn)品成本的同時(shí)也降低了疫苗批間質(zhì)量差異帶來(lái)的風(fēng)險(xiǎn)。規(guī)?；囵B(yǎng)是常規(guī)疫苗生產(chǎn)領(lǐng)域的主要技術(shù)，目前國(guó)際主流的培養(yǎng)規(guī)模為3000～8000L，多采用批式或批式加量培養(yǎng)，進(jìn)行計(jì)算機(jī)二級(jí)控制，實(shí)現(xiàn)完全自動(dòng)化[16]。近幾年，針對(duì)不同宿主細(xì)胞特點(diǎn)和疫苗制品生產(chǎn)工藝，用于疫苗生產(chǎn)的個(gè)性化細(xì)胞培養(yǎng)基的需求不斷增加，市場(chǎng)供求已趨于正規(guī)化。自動(dòng)化是規(guī)?；a(chǎn)的目標(biāo)和趨勢(shì)，即采用自動(dòng)化的分離純化體系，包括細(xì)胞破碎、微濾、超濾和層析等技術(shù)，同時(shí)，整體柱、移動(dòng)模擬床色譜、膜色譜等新興技術(shù)也逐漸應(yīng)用于規(guī)?；a(chǎn)中。自動(dòng)化的優(yōu)點(diǎn)在于生產(chǎn)過(guò)程中減少人力成本，提高效率，降低人為操作誤差及污染風(fēng)險(xiǎn)。一次性產(chǎn)品包括規(guī)?；a(chǎn)過(guò)程中接觸制品的裝置、器具和耗材，其應(yīng)用可使制品質(zhì)量可控、便于驗(yàn)證。一次性細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器已發(fā)展為生物醫(yī)藥（包括疫苗）產(chǎn)品生產(chǎn)的主要形式，其發(fā)展對(duì)于降低疫苗生產(chǎn)成本、提高經(jīng)濟(jì)效益、確保制品的安全具有重要意義。國(guó)外疫苗生產(chǎn)企業(yè)多采用“個(gè)性化”服務(wù)的方式與某些企業(yè)合作建立一種“協(xié)議服務(wù)”的商業(yè)關(guān)系。通過(guò)模塊化、平臺(tái)化操作研制最適合自身產(chǎn)品特點(diǎn)的個(gè)性化技術(shù)應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐，廠家為客戶提供最優(yōu)化的技術(shù)服務(wù)以及相關(guān)的技術(shù)支持，例如定制培養(yǎng)基、定制層析介質(zhì)等，幫助其提高產(chǎn)能，實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)效率的大幅度提升[16]。規(guī)模性自動(dòng)化、多參數(shù)系統(tǒng)化的疫苗生產(chǎn)技術(shù)平臺(tái)為疫苗生產(chǎn)效率提高、生產(chǎn)工藝的一致性以及疫苗質(zhì)量的穩(wěn)定提供了保障。

3.2 國(guó)內(nèi)基因工程疫苗規(guī)模化生產(chǎn)工藝與技術(shù)

中國(guó)生物醫(yī)藥企業(yè)起步于20世紀(jì)80年代初期，經(jīng)過(guò)30年的努力，生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)取得一定發(fā)展，生物產(chǎn)業(yè)已初具規(guī)模，在發(fā)展中國(guó)家屬于較高水準(zhǔn)。但我國(guó)疫苗的規(guī)模化生產(chǎn)工藝研究起步較晚，大多處于半自動(dòng)化階段，其根本原因在于，研發(fā)人員在“研究和生產(chǎn)的關(guān)聯(lián)意識(shí)”和“質(zhì)量源于設(shè)計(jì)”等理念上認(rèn)識(shí)的差距，致使初期的研發(fā)設(shè)計(jì)與規(guī)?；a(chǎn)制備脫節(jié)。臨床前期的研究很少考慮到工藝的可放大性和終產(chǎn)品質(zhì)量的可控性。制備工藝往往僅限于實(shí)驗(yàn)室規(guī)模，不適合規(guī)?；a(chǎn)。如純化工藝中，實(shí)驗(yàn)室研究階段廣泛的采用超速離心和親和層析法，均為間斷性操作且費(fèi)用較高，很難應(yīng)用于生產(chǎn)。隨著國(guó)外疫苗研發(fā)和生產(chǎn)企業(yè)在國(guó)內(nèi)廣泛設(shè)廠投產(chǎn)及國(guó)內(nèi)疫苗質(zhì)量控制監(jiān)察體系的不斷完善，這方面差距在逐漸縮小。此外，疫苗生產(chǎn)用表達(dá)系統(tǒng)和宿主細(xì)胞方面，國(guó)外的研發(fā)機(jī)構(gòu)通常擁有專利技術(shù)保護(hù)，具有相對(duì)成熟的技術(shù)儲(chǔ)備；規(guī)?；a(chǎn)的儀器設(shè)備方面，無(wú)論是高密度發(fā)酵的生物反應(yīng)器還是規(guī)?；蛛x純化的層析介質(zhì)、膜分離技術(shù)[17]，幾乎所有的關(guān)鍵儀器設(shè)備都依賴進(jìn)口，這極大地限制了我國(guó)疫苗規(guī)?；l(fā)展的進(jìn)程。

基因工程疫苗領(lǐng)域重點(diǎn)在于上游設(shè)計(jì)，在疫苗研發(fā)初期綜合考慮工藝放大可行性、質(zhì)量可控性甚至廠房和設(shè)備需求，可迅速實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)占領(lǐng)市場(chǎng)，同時(shí)降低生產(chǎn)成本，提高生產(chǎn)效率，確保安全。因此，相比傳統(tǒng)疫苗，我國(guó)的基因工程疫苗更容易在產(chǎn)業(yè)化能力方面與國(guó)際接軌。

4 未來(lái)發(fā)展趨勢(shì)與展望

4.1 滅活病毒性疫苗技術(shù)和工藝的發(fā)展趨勢(shì)

滅活病毒性疫苗技術(shù)和工藝的發(fā)展趨勢(shì)主要體現(xiàn)在以下幾點(diǎn)。產(chǎn)業(yè)化與規(guī)模化程度進(jìn)一步提高，微載體生物反應(yīng)器規(guī)模更大、高密度發(fā)酵技術(shù)參數(shù)的優(yōu)化等；新型細(xì)胞基質(zhì)研究，進(jìn)一步提高細(xì)胞基質(zhì)的安全性和培養(yǎng)濃度；細(xì)胞和病毒培養(yǎng)基的優(yōu)化，包括無(wú)動(dòng)物來(lái)源的培養(yǎng)基配方研究等；純化技術(shù)的進(jìn)一步提高，最大限度提高目標(biāo)抗原純度和比活；利用反向遺傳學(xué)等技術(shù)進(jìn)行疫苗生產(chǎn)用毒株的改造。

4.2 多糖蛋白結(jié)合疫苗技術(shù)和工藝的發(fā)展趨勢(shì)

使用符合歐盟標(biāo)準(zhǔn)的原料多糖,并在此基礎(chǔ)上把原料多糖的C多糖、殘余蛋白和核酸含量控制在1%以內(nèi)。載體蛋白質(zhì)使用精制后進(jìn)一步純化的TT，TT單體含量達(dá)到90%，并使用基質(zhì)輔助激光解吸-飛行時(shí)間（MALDI-TOF）質(zhì)譜技術(shù)檢測(cè)蛋白質(zhì)準(zhǔn)確的分子量和單體含量。通過(guò)這些技術(shù)研發(fā)，使結(jié)合效率提高至30%～40%，建立新的過(guò)程質(zhì)量控制方法和臨床效果評(píng)價(jià)方法，與國(guó)際接軌。

4.3 基因工程疫苗技術(shù)和工藝的發(fā)展趨勢(shì)

目前以基因工程制品為主導(dǎo)的基因工程應(yīng)用產(chǎn)業(yè)已成為全球發(fā)展最快的產(chǎn)業(yè)之一，發(fā)展前景廣闊?；蚬こ讨破分饕?xì)胞因子、抗體、疫苗、激素和寡核苷酸藥物等。它們對(duì)預(yù)防人類的腫瘤、心血管疾病、遺傳病、糖尿病、包括艾滋病在內(nèi)的各種傳染病、類風(fēng)濕疾病等有重要作用。在很多領(lǐng)域特別是疑難病癥上，基因工程制品起到了傳統(tǒng)化學(xué)藥物難以達(dá)到的作用。中國(guó)生物醫(yī)藥市場(chǎng)將成為僅次于美國(guó)的全球第二大生物醫(yī)藥市場(chǎng)，預(yù)計(jì)在10年創(chuàng)新發(fā)展的基礎(chǔ)上，基因工程疫苗行業(yè)將迎來(lái)最佳時(shí)期。同時(shí)，基因工程疫苗的產(chǎn)業(yè)化也面臨不小的挑戰(zhàn)。由于在規(guī)?；矫嬷袊?guó)長(zhǎng)期以來(lái)以仿制為主，沒(méi)有形成具有技術(shù)優(yōu)勢(shì)的領(lǐng)域，不能發(fā)揮技術(shù)的累積效應(yīng)，制約了具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的產(chǎn)品的研發(fā)。因此，面對(duì)國(guó)際新藥研發(fā)的過(guò)程細(xì)化精準(zhǔn)，擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)，并依托研發(fā)產(chǎn)品的創(chuàng)新性平臺(tái)技術(shù)是基因工程疫苗規(guī)?；a(chǎn)的重中之重。平臺(tái)技術(shù)的延續(xù)性和創(chuàng)新性將為更多基因工程疫苗的開(kāi)發(fā)提供更廣闊的發(fā)展空間。

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Large-scale production processes and technologies of human vaccines

YU Xiaohui1，LI Qiming2，LI Xiuling2，SHEN Rong3，ZHANG Aihua1，ZHANG Yuntao1
1. China National Biological Group, Co., Ltd., Beijing 100029, China 2. Beijing Institute of Biological Products Co., Ltd., Beijing 101111, China 3. Lanzhou Institute of Biological Products Co., Ltd., Lanzhou 730046, China

With the social progress and human health improvement, the production technologies of human vaccines make great progress. China achieved important improvement on the vaccine research and development technologies. This paper expounds currently domestic and abroad situations and future development trend of the production process and technologies of the inactivated viral vaccines, polysaccharide protein conjugate vaccines and large-scale genetic engineering vaccines.

vaccine; large-scale production; process; technology

10.3969/j.issn.1674-0319.2017.02.007

于曉輝，哲學(xué)博士，講師。研究方向：生物醫(yī)學(xué)工程。E-mail：yuxiaohui@sinopharm.com

重大新藥創(chuàng)制科技重大專項(xiàng)（2014ZX09304316）