方美仙　王　燕　黃海龍　何德欽　林　娜　林　元*

1.福建醫(yī)科大學(xué)附屬南平市第一醫(yī)院(353000);2.福建醫(yī)科大學(xué)附屬福建省婦幼保健院

胎兒染色體異常是常見(jiàn)出生缺陷的原因之一，約占全部活產(chǎn)胎兒的1/500[1]，常伴有智力低下、發(fā)育遲緩、多器官畸形，目前尚無(wú)有效的治療方法，介入性產(chǎn)前診斷是主要的干預(yù)措施。而對(duì)于較大孕周的高危孕婦，由于錯(cuò)過(guò)了絨毛活檢和羊膜腔穿刺的時(shí)機(jī)，臍血管穿刺成為唯一選擇。本文回顧性分析619例高危孕婦臍血穿刺產(chǎn)前診斷資料，探討其臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

2015年6月—2016年12月在福建省婦幼保健院產(chǎn)前診斷中心行臍血穿刺產(chǎn)前診斷的高危孕婦共619例，年齡20～43歲，孕周≥24周，臍血穿刺指征主要包括：胎兒超聲異常(包括結(jié)構(gòu)異常和超聲軟指標(biāo)異常，如心室強(qiáng)回聲點(diǎn)、側(cè)腦室增寬、腸管回聲增強(qiáng)等)、血清學(xué)篩查高風(fēng)險(xiǎn)、高齡(孕婦預(yù)產(chǎn)年齡≥35歲)、羊水異常核型鑒別、染色體異常兒妊娠史、無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前基因檢測(cè)高風(fēng)險(xiǎn)、TORCH感染、夫妻雙方同型地貧基因攜帶等。

1.2 臍血染色體檢查

在超聲引導(dǎo)下經(jīng)腹行臍靜脈穿刺術(shù)，抽取臍血2.5ml，其中1.5ml按照常規(guī)方法進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)、收獲、制片、顯帶及核型分析，另外1ml乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管冷藏備用。核型結(jié)果根據(jù)ISCN 2015命名。所有孕婦術(shù)前常規(guī)遺傳咨詢(xún)并簽署臍血穿刺知情同意書(shū)。

1.3 分子遺傳學(xué)診斷

對(duì)于胎兒超聲發(fā)現(xiàn)異常，常規(guī)染色體核型分析未見(jiàn)異常或不能明確診斷的樣本，家屬知情同意后行產(chǎn)前液相芯片(BoBs)( Illumina公司，美國(guó))或單核苷酸多態(tài)性微陣列(SNP array)(Affymetrix 750K，USA)檢測(cè)。

1.3.1臍血DNA提取使用DNA提取試劑盒(Qiagen公司，德國(guó))提取基因組DNA，并用微量分光光度計(jì)測(cè)定DNA濃度和純度。

1.3.2產(chǎn)前BoBs檢測(cè)使用染色體非整倍體和基因微缺失檢測(cè)試劑盒(Perkin Elmer公司，美國(guó))檢測(cè)染色體變異，按照操作手冊(cè)完成檢測(cè)[2]。

1.3.3 SNP array檢測(cè)按照Affymetrix 750K基因芯片操作手冊(cè)進(jìn)行DNA的消化、擴(kuò)增、純化、片段化、標(biāo)記信號(hào)、雜交、洗片染色及掃描等步驟。采用Agilent Genomic Workbench 7.0.4.0軟件、Chromosome Analysis Suite(ChAS)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析判斷?？截悢?shù)變異的報(bào)告閾值為缺失≥200 kb，重復(fù)≥500 kb。

1.4 隨訪

依據(jù)住院分娩病歷及電話隨訪妊娠結(jié)局。

2 結(jié)果

2.1 穿刺及細(xì)胞培養(yǎng)情況

穿刺成功率100%。6例培養(yǎng)失敗，培養(yǎng)成功率99.0%(613/619)，胎兒丟失率0.3%(2/619)。均符合我國(guó)產(chǎn)前診斷行業(yè)規(guī)定[3]。

2.2 不同指征異常核型檢出情況

臍血穿刺指征主要為胎兒超聲異常、胎兒超聲異常合并高齡或血清學(xué)篩查高風(fēng)險(xiǎn)、高齡、血清學(xué)篩查高風(fēng)險(xiǎn)。在培養(yǎng)成功的613例樣本中，具有單一診斷指征539例，檢出異常核型43例(8.0%)，同時(shí)具有2種指征74例，檢出異常核型10例(13.5%)。見(jiàn)表1。

表1　不同診治指征異常核型檢出情況[例(%)]

a5例細(xì)胞培養(yǎng)失敗，已除外；b1例細(xì)胞培養(yǎng)失敗，已除外；c1例為嵌合型21-三體

2.3 檢出的異常核型分類(lèi)情況

共檢出染色體異常核型53例，異常率8.6%(53/613)。染色體數(shù)目異常25例，包括21-三體18例，18-三體3例，13-三體1例，性染色體數(shù)目異常3例。染色體結(jié)構(gòu)異常19例，包括平衡易位4例，倒位11例，其他[46,XY,20q+dn、46,XX,15cenh+、46,XY,21pstk+、46,XY,del(17)(?p11.2p11.2)]4例，嵌合體異常9例。見(jiàn)表2。

2.4 分子遺傳學(xué)診斷結(jié)果

9例樣本進(jìn)一步行分子遺傳學(xué)檢測(cè)，其中5例含致病性變異，分別是DiGeorgeⅠ異常、19號(hào)染色體q13.42q13.43區(qū)域出現(xiàn)4.3Mb重復(fù)、17號(hào)染色體p11.2區(qū)域出現(xiàn)4.8Mb缺失、12號(hào)染色體p11.21-q12區(qū)域出現(xiàn)11Mb重復(fù)、Y染色體多處重復(fù)合并缺失，大小15.3Mb。

2.5 妊娠結(jié)局

共隨訪染色體異常胎兒53例。妊娠結(jié)局見(jiàn)表2。

表2　53例核型異常類(lèi)型及妊娠結(jié)局(例)

-表示未進(jìn)一步診斷；隨訪情況中部分為超聲表現(xiàn)

3 討論

介入性產(chǎn)前診斷是目前公認(rèn)的染色體異常的確診方法。與絨毛、羊水相比，臍血具有培養(yǎng)時(shí)間短、方法簡(jiǎn)便、染色體制備容易的優(yōu)點(diǎn)，但臍血穿刺術(shù)的風(fēng)險(xiǎn)及難度均高于絨毛取樣及羊膜腔穿刺術(shù)，因此需要嚴(yán)格掌握手術(shù)適應(yīng)證，在有經(jīng)驗(yàn)的臨床及超聲醫(yī)師共同協(xié)助下完成。對(duì)于錯(cuò)過(guò)了絨毛、羊水等診斷時(shí)機(jī)的高危孕婦，臍血穿刺產(chǎn)前診斷就顯得尤為重要。

本研究中檢出染色體異常核型8.6%，與盧守蓮等[4]的報(bào)道(9.4%)接近，低于我們既往報(bào)道的14.3%[5]，可能因?yàn)闃颖玖康牟町惣按┐讨刚鲀?nèi)部構(gòu)成比不同。在檢出的53例異常核型中，21-三體仍然是妊娠中晚期最常見(jiàn)的異常核型，與其他學(xué)者研究結(jié)果一致[4]。超聲檢查是產(chǎn)前診斷的重要組成部分，分析臍血穿刺指征的構(gòu)成比發(fā)現(xiàn)，619例樣本中單純超聲異常占71.5%，算上超聲異常合并其他高危因素則達(dá)85.5%，說(shuō)明超聲異常是妊娠中晚期臍血穿刺的主要指征[5-6]。超聲發(fā)現(xiàn)的異常不僅包括胎兒結(jié)構(gòu)異常，還包括如心室強(qiáng)回聲點(diǎn)、側(cè)腦室擴(kuò)張、腸管回聲增強(qiáng)、淋巴水囊瘤等異常軟指標(biāo)。有研究發(fā)現(xiàn)，單個(gè)超聲軟指標(biāo)陽(yáng)性，染色體異常率為2%～3.5%[6-7]，但同時(shí)合并超聲結(jié)構(gòu)異?；蚨鄠€(gè)軟指標(biāo)異常，或同時(shí)合并其他高危因素時(shí)，染色體異常幾率明顯增高[8-9]。本研究中，單純超聲異常組染色體異常率為6.4%，而合并有其他高危因素時(shí)染色體異常率達(dá)13.5%，也證明了這一理論。因此，對(duì)于妊娠中晚期超聲提示胎兒異常，尤其是多發(fā)異常，應(yīng)行介入性產(chǎn)前診斷。此外，高齡和血清學(xué)篩查高風(fēng)險(xiǎn)也是染色體異常的高危因素。國(guó)際婦產(chǎn)科協(xié)會(huì)建議將≥35歲的妊娠稱(chēng)為高齡妊娠，而高齡妊娠造成胎兒遺傳缺陷的的原因是隨著年齡增長(zhǎng)而發(fā)生的母體卵母細(xì)胞的老化等[10]。由于本中心同時(shí)開(kāi)展多種篩查及診斷技術(shù)，能夠?qū)Ω呶Ｔ袐D及早干預(yù)，因此這兩類(lèi)高危人群僅占構(gòu)成比的4.7%和3.1%。但同時(shí)應(yīng)注意，高齡組核型異常率(10.3%)高于總體異常率(8.6%)，而血清學(xué)篩查高風(fēng)險(xiǎn)組臍血檢出的1例為21-三體?？梢?jiàn)，臍血穿刺為確診染色體異常的有效補(bǔ)救措施。

近年來(lái)，各種分子遺傳學(xué)篩查和診斷技術(shù)不斷涌現(xiàn)并應(yīng)用于產(chǎn)前診斷。無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前基因檢測(cè)技術(shù)就是其中之一，其利用母血清中胎兒游離DNA(cell- free fetal DNA，cffDNA)進(jìn)行胎兒染色體非整倍體(21、18、13、X)檢測(cè)，被認(rèn)為是一種“近似診斷的篩查”。有學(xué)者[11]匯總相關(guān)文獻(xiàn)后認(rèn)為：21、18、13三體的檢出率分別為99.0%、96.8%、92.1%，X單體檢出率也達(dá)88.6%。也有不一致的報(bào)道，認(rèn)為21-三體的真陽(yáng)性率只有93%，性染色體則不足50%[12]，胎盤(pán)嵌合、母體嵌合體、孕周、母血中胎兒游離DNA含量等均可能導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果[13-14]。本研究中，無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前基因檢測(cè)高風(fēng)險(xiǎn)組病例較少，且有4例提示性染色體異常均為假陽(yáng)性，故異常率較低。產(chǎn)前BoBs技術(shù)、SNP array技術(shù)，特別是SNP array技術(shù)，通過(guò)對(duì)拷貝數(shù)變異的檢測(cè)，能夠發(fā)現(xiàn)染色體的微小缺失和重復(fù)，相比傳統(tǒng)的核型分析技術(shù)，具有高通量、高分辨率、快速等優(yōu)點(diǎn)，不僅可以提高染色體異常的檢出率，還能明確異常片段的來(lái)源及致病性[15-16]。本研究中，9例樣本進(jìn)一步行分子遺傳學(xué)檢測(cè)，5例發(fā)現(xiàn)致病性異常。1例核型為46,XN,inv(9)，超聲提示胎兒心臟畸形：法洛四聯(lián)征，產(chǎn)前BoBs檢測(cè)提示DiGeorge Ⅰ綜合征(22q11.2微缺失)，明確了致病原因。1例血清學(xué)篩查高風(fēng)險(xiǎn)病例，核型為46,XY,20q+dn，屬多態(tài)性改變，一般不具有臨床效應(yīng)，不引起表型異常，而進(jìn)一步行SNP array檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)19號(hào)染色體q13.42q13.43微重復(fù)，可能致病。1例核型提示17號(hào)染色體存在缺失，而SNP array檢測(cè)明確為17p11.2微缺失。另2例為標(biāo)記染色體嵌合，通過(guò)SNP array檢測(cè)明確了來(lái)源及致病性，最終孕婦夫婦決定終止妊娠。另外4例分子遺傳學(xué)檢測(cè)未發(fā)現(xiàn)異常病例(2例孕婦高齡，胎兒核型為新發(fā)染色體平衡易位；1例超聲提示多發(fā)軟指標(biāo)異常，核型為多態(tài)改變；1例孕婦高齡，超聲提示胎兒右鎖骨下動(dòng)脈迷走，核型為嵌合體異常)，隨訪嬰兒表型均正常。然而，近年來(lái)研究認(rèn)為，染色體多態(tài)性、平衡易位等與生殖異常關(guān)系密切[17-18]，因此，對(duì)于出生后表型正常的嬰兒也應(yīng)當(dāng)延長(zhǎng)隨訪年限。

臍血穿刺是必要、安全可靠的產(chǎn)前診斷技術(shù)之一，可以滿足大孕周高危孕婦產(chǎn)前診斷的需要，對(duì)于臍血穿刺發(fā)現(xiàn)的胎兒染色體異常，應(yīng)結(jié)合超聲及孕婦夫婦外周血染色體檢查，必要時(shí)行分子遺傳學(xué)診斷，從而為臨床咨詢(xún)醫(yī)生提供更多理論依據(jù)，并準(zhǔn)確評(píng)估下次妊娠再發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)出生缺陷的干預(yù)具有重要意義。

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