高 燕，魏宇昆，奉樹成*

(1.上海植物園 上海城市植物資源開發(fā)應(yīng)用工程技術(shù)研究中心，上海 200231； 2.上海辰山植物園，上海 201602)

貴州鼠尾草組織培養(yǎng)育苗技術(shù)

高 燕1，魏宇昆2，奉樹成1*

(1.上海植物園 上海城市植物資源開發(fā)應(yīng)用工程技術(shù)研究中心，上海 200231； 2.上海辰山植物園，上海 201602)

以貴州鼠尾草為試驗材料，探討以種子和莖基部為外植體的組織培養(yǎng)過程。結(jié)果表明：以種子為外植體時，75%乙醇消毒30 s，然后2%次氯酸鈉(含吐溫- 80)消毒7 min為最佳滅菌方法，此時1 mg·L-16- BA和0.1 mg·L-1NAA誘導(dǎo)率可以達(dá)到90%，且誘導(dǎo)出的小苗生長健康、發(fā)育較快；以莖基部為外植體時，75%乙醇消毒30 s，然后0.1%氯化汞(含吐溫- 80)消毒10 min為最佳滅菌方法，此時2 mg·L-16- BA和0.2 mg·L-1NAA誘導(dǎo)率可以達(dá)到75%，誘導(dǎo)出的小苗比較健康。在增殖過程中，以種子和莖基部為外植體誘導(dǎo)的植株沒有表現(xiàn)出差異，最佳培養(yǎng)基為MS+ 0.6 mg·L-16- BA +0.05 mg·L-1NAA，生根培養(yǎng)基為1/2 MS。

貴州鼠尾草； 種子； 莖基部； 組織培養(yǎng)； 快繁

唇形科(Lamiaceae)鼠尾草屬(Salvia)是一年或多年生草本或小灌木，藥用芳香植物，原產(chǎn)于歐洲南部與地中海沿岸地區(qū)，阿拉伯、美國、加拿大等國和我國均有栽培[1]。中國植物志記錄我國有78種，24變種，8變型，分布于全國各地，尤以西南地區(qū)為最多[2]。鼠尾草葉對生，橢圓形，香味濃郁，夏季開紫色花，生長強(qiáng)健，耐病蟲害。近些年，由于其品種繁多，花色鮮艷，又為芳香植物，在園林綠化中得到了一定的應(yīng)用。

貴州鼠尾草(SalviacavalerieiLévl.)又名紫背鼠尾草、朱砂草、血盆草、葉下紅等。一方面，貴州鼠尾草可以作為園林綠化植物，另外一方面由于全草可入藥，具有涼血解毒、散瘀止血的功效，用于肺結(jié)核咳血、衄血、血痢、血崩、刀傷出血、月經(jīng)過多、胃脘痛的治療，外用治療跌打損傷，癤腫等[3]。本文通過組織培養(yǎng)的方式實現(xiàn)貴州鼠尾草的快速繁殖，不僅為快速獲得大量鼠尾草優(yōu)質(zhì)苗木提供可能，也為后期貴州鼠尾草遺傳轉(zhuǎn)化奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗于2014—2015年在上海植物園進(jìn)行。供試材料為上海辰山植物園魏宇昆博士提供的貴州鼠尾草種子和1年生貴州鼠尾草植株。4月初，分別用種子和植株莖基部作為外植體，嘗試鼠尾草組織培養(yǎng)誘導(dǎo)。

1.2 方法

取鼠尾草莖基部，去除上部的莖和下部的根，保留1～1.5 cm，洗潔精清洗干凈。分別將種子和莖基部放置在玻璃瓶中，紗布封口，流水沖洗1 h。準(zhǔn)備75%乙醇、0.1%氯化汞、2%次氯酸鈉溶液、0.5%(V/V)吐溫80、滅菌水、100 mL無菌三角瓶、無菌鑷子、無菌濾紙備用。

超凈工作臺中，先用無菌水沖洗種子和莖基部2次，75%乙醇震蕩浸泡30 s，無菌水沖洗3遍，后用消毒液消毒，消毒液中加入0.5%(V/V)吐溫- 80，無菌水沖洗5遍，濾紙吸去外植體表面水分。

1.2.1 滅菌方法

鼠尾草種子和鼠尾草莖基部分別用0.1%氯化汞或2%次氯酸鈉溶液消毒。種子消毒時間和莖基部消毒時間不同，比較不同時間和不同消毒液對外植體污染率的影響，確定不同外植體的最佳消毒方法。

1.2.2 誘導(dǎo)培養(yǎng)基

以MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的細(xì)胞分裂素6- BA和生長素NAA。其中，細(xì)胞分裂素6- BA 0～4 mg·L-1，生長素NAA 0～0.4 mg·L-1。根據(jù)不同激素配比的培養(yǎng)基下鼠尾草的生長狀態(tài)確定最適合的激素含量。

1.2.3 增殖培養(yǎng)基

誘導(dǎo)鼠尾草出芽后，以MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的細(xì)胞分裂素6- BA和生長素NAA調(diào)節(jié)芽增殖。其中，細(xì)胞分裂素6- BA 0～1.2 mg·L-1，生長素NAA 0～0.1 mg·L-1。根據(jù)不同激素配比的培養(yǎng)基中鼠尾草的生長狀態(tài)確定最適合的激素含量。

1.2.4 不定根誘導(dǎo)及馴化移栽

以1/2 MS為基本培養(yǎng)基，觀察鼠尾草生根情況。完成生根后，在培養(yǎng)室揭開瓶蓋，室溫下放置3 d。取出組培苗，清洗附著在組培苗上的培養(yǎng)基，整理根并種植于配好的基質(zhì)中。

2 結(jié)果與分析

2.1 滅菌方法

起始材料是鼠尾草種子和莖基部2種。初期用流水沖洗1 h后，后續(xù)操作在超凈工作臺中進(jìn)行。選擇2%次氯酸鈉溶液和0.1%氯化汞溶液，各加入1滴0.5%(V/V)吐溫80，分別對種子和莖基部進(jìn)行消毒處理。如表1所示，每個起始材料每種滅菌方式都分別用3種滅菌時間處理。

表1 不同滅菌液和滅菌時間對鼠尾草種子和莖基部誘導(dǎo)脫菌的影響

以種子為起始材料時，2%次氯酸鈉溶液4 min和0.1%氯化汞溶液2 min滅菌處理后污染率較高，分別是80.0%和73.3%，對應(yīng)的出芽率分別是13.3%和6.7%。隨著滅菌時間的增加，污染率降低，2%次氯酸鈉溶液和0.1%氯化汞溶液分別處理7和5 min后污染率降為6.7%和13.3%，對應(yīng)的出芽率分別為86.7%和63.3%。采用2%次氯酸鈉溶液和0.1%氯化汞溶液分別處理10和8 min后污染率均為0，而出芽率分別為33.3%和0。綜上，以鼠尾草種子作為起始材料，2%次氯酸鈉溶液消毒7 min或0.1%氯化汞溶液消毒5 min為最佳滅菌方法；從污染率和出芽率來看，2%次氯酸鈉溶液消毒7 min效果更優(yōu)。

以鼠尾草莖基部為起始材料時，因為莖基部與土壤接觸，土壤中攜帶的菌類會影響莖基部的滅菌時間和滅菌程度，因此，設(shè)置滅菌時間相較于種子略長。2%次氯酸鈉溶液處理10 min和0.1%氯化汞溶液處理5 min，污染率較高，分別是86.7%和83.3%，對應(yīng)的出芽率分別為6.7%和13.3%。2%次氯酸鈉溶液消毒20 min和0.1%氯化汞溶液消毒10 min，污染率分別為40.0%和13.3%，對應(yīng)出芽率分別為53.3%和66.7%。當(dāng)2%次氯酸鈉溶液和0.1%氯化汞溶液的處理時間分別達(dá)到30和15 min時，污染率分別為20.0%和3.3%，對應(yīng)出芽率分別為36.7%和20.0%。綜上，以鼠尾草莖基部為起始材料，2%次氯酸鈉溶液消毒20 min或0.1%氯化汞溶液消毒10 min為最佳滅菌方法；從污染率和出芽率來看，0.1%氯化汞溶液消毒10 min效果更優(yōu)。

2.2 誘導(dǎo)培養(yǎng)基

以MS為基本培養(yǎng)基，添加生長素和細(xì)胞分裂素。植物細(xì)胞中生長素和細(xì)胞分裂素是啟動細(xì)胞分化、脫分化和再分化的關(guān)鍵因素。

從表2看出，以種子為起始材料時，1 mg·L-16- BA+0.1 mg·L-1NAA是最佳誘導(dǎo)激素配比，誘導(dǎo)率可以達(dá)到90%，最快7 d就可以誘導(dǎo)出2片子葉的無菌幼苗(圖1)。一般情況下，20 d左右可以誘導(dǎo)出苗，出苗后，子葉快速長大，莖伸長，個別幼苗在接觸培養(yǎng)基的部位長出細(xì)弱的根。當(dāng)激素濃度低時，未能生長出幼苗或者誘導(dǎo)率低，幼苗生長緩慢。而激素濃度過高，可能會導(dǎo)致玻璃化。

圖1 鼠尾草種子誘導(dǎo)的無菌苗

表2 不同激素含量對鼠尾草誘導(dǎo)的影響

以莖段為起始材料時，2 mg·L-16- BA+0.2 mg·L-1NAA是最佳誘導(dǎo)激素配比，誘導(dǎo)率可以達(dá)到75%，最快的出苗時間是25 d，從莖基部長出腋芽并成長迅速。普遍的出苗時間為30～40 d。在此濃度配比下，腋芽生長健壯。待腋芽生長至1～2 cm，更換至增殖培養(yǎng)基。

2.3 增殖培養(yǎng)基

幼苗生長至2 cm左右，從莖基部切下，接至增殖培養(yǎng)基中。以種子和莖段為起始材料，在增殖過程中沒有發(fā)現(xiàn)明顯差異。在不同6- BA和NAA激素配比的培養(yǎng)基中繼代1個月，觀察伸長倍率和增殖倍率。如表3所示，0.6 mg·L-16- BA+0.05 mg·L-1NAA培養(yǎng)基中，伸長倍率為3.24倍，而增殖倍率可以達(dá)到4.62倍，芽生長迅速并且粗壯，適合后期持續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)。0.6 mg·L-16- BA+0.1 mg·L-1NAA培養(yǎng)基中，增值倍率和伸長率均達(dá)到最大值，且芽生長迅速，但出現(xiàn)個別畸形現(xiàn)象，芽下端有部分連接在一起，因此不予考慮。6- BA達(dá)到1.2 mg·L-1時，芽比較細(xì)弱，且芽的生長量差異較大，長勢不整齊。NAA的濃度達(dá)到0.1 mg·L-1時，經(jīng)過幾次繼代后，玻璃化現(xiàn)象比較嚴(yán)重，芽脆，含水較高，并逐漸透明化。

表3 繼代1個月時不同激素含量對鼠尾草增殖的影響

2.4 生根培養(yǎng)基及試管苗移栽

以1/2 MS為基本培養(yǎng)基，含蔗糖20%，30 d后生根率可以達(dá)到100%，根長約4.23 cm，生根均勻，根白綠色，平均每株生根數(shù)為4.23條(圖2)。

在培養(yǎng)基上生根1個月后，在培養(yǎng)間揭去瓶蓋2～3 d，后用清水沖洗根部，去除黏附的培養(yǎng)基。在穴盤中裝入泥炭和蛭石體積比1∶1的混合土。整理鼠尾草根部并種植于混合土中，澆透水并加蓋穴盤。上方安置遮光網(wǎng)，放置于大棚內(nèi)，濕度保持在85%左右。生長2個月后，鼠尾草成活率90%以上。每半個月澆水時混用0.1%多菌靈溶液可以在一定程度上殺菌。另外，每半個月施加薄肥(1/1 000氮磷鉀肥)以促進(jìn)鼠尾草生長。

圖2 鼠尾草的生根培養(yǎng)

3 小結(jié)與討論

植物組織培養(yǎng)技術(shù)是指在無菌條件下，將離體的植物器官、組織、細(xì)胞以及原生質(zhì)體，在人工配制的環(huán)境里培養(yǎng)成完整的植株。植物組織培養(yǎng)的依據(jù)是植物細(xì)胞全能性及植物的再生作用[4]。高度分化的植物細(xì)胞具有全能性。植物細(xì)胞在離體條件時，在一定的營養(yǎng)物質(zhì)、激素和適當(dāng)?shù)耐獠凯h(huán)境下能夠表現(xiàn)出全能性。植物體分生能力強(qiáng)的部位，例如植物根尖、莖尖，在無機(jī)鹽、糖類、激素、酵母提取物等配置成的培養(yǎng)基中，能夠分化成具有根、莖、葉的完整植株。鼠尾草培養(yǎng)過程中，采用種子和莖基部2種外植體進(jìn)行培養(yǎng)，在適當(dāng)?shù)募に卣{(diào)節(jié)下，可以形成完整植株。

組培過程初期，要獲得完全無菌的接種材料，一方面可以選取植物組織內(nèi)部無菌的材料，另一方面，可以通過消毒處理殺死植物材料表面存在的各種微生物，根據(jù)不同材料選用不同的消毒劑及適合的濃度和處理時間，運用不同的消毒方法。常常使用5～10%漂白粉、70～75%乙醇、0.1～0.2%氯化汞及2～10%次氯酸鈉等滅菌液脫毒[5]。鼠尾草外植體脫毒培養(yǎng)時，首先用75%乙醇浸泡30 s，隨后對比氯化汞和次氯酸鈉消毒液的脫毒效果。鼠尾草不同的外植體部位適用的滅菌劑和滅菌時間略有不同。鼠尾草種子用2%次氯酸鈉溶液(含0.5%吐溫- 80)滅菌7 min，污染率為6.7%，出芽率為86.7%，是比較適合的滅菌方法。以鼠尾草莖基部為外植體時，0.1%氯化汞溶液(含0.5%吐溫80)滅菌10 min，污染率為13.3%，出芽率為66.7%。由此可見，針對不同的外植體，不同的滅菌劑和滅菌時間會有不同的滅菌效率。滅菌時間較短，滅菌不完全，污染率大幅度提高；滅菌時間過長，污染率雖然大幅度降低，但對植物造成不可逆轉(zhuǎn)的傷害，極大地影響鼠尾草的出芽率。另外，消毒完成后，鼠尾草種子在浸漲后，有膠質(zhì)包裹。在接種過程中，需要用解剖刀在種子一端輕戳破，可以顯著提高種子的萌發(fā)率。

脫分化和再分化的過程都需要在培養(yǎng)基中添加適當(dāng)比例的生長素和細(xì)胞分裂素，以誘導(dǎo)細(xì)胞的脫分化和再分化。生長素和細(xì)胞分裂素的合理配比在組培過程中具有調(diào)控細(xì)胞分裂、芽生長、愈傷形成等功能。在植物組織培養(yǎng)中生長素的主要作用是促進(jìn)細(xì)胞生長與分裂，用于誘導(dǎo)愈傷組織形成、根分化以及細(xì)胞分裂。細(xì)胞分裂素可以促進(jìn)植物細(xì)胞的分裂和分化，在誘導(dǎo)芽分化、葉綠體發(fā)育、運輸和分配養(yǎng)分、植物抗衰老等方面都扮演了重要角色[6]。組培中大多情況下兩者同時施用，通過調(diào)節(jié)兩者的濃度和比例實現(xiàn)理想的生長與繁殖效果。一般來說，當(dāng)細(xì)胞分裂素與生長素的比值較大時，可以促進(jìn)芽的形成；當(dāng)細(xì)胞分裂素與生長素的比值較小時，有利于根的分化[7]。在鼠尾草生長素和細(xì)胞分裂素配比研究中，發(fā)現(xiàn)生長素和細(xì)胞分裂素的合適比例非常重要。當(dāng)細(xì)胞分裂素和生長素比例較低時，鼠尾草可能出現(xiàn)愈傷，或者部分生根。而當(dāng)細(xì)胞分裂素和生長素過高時，鼠尾草細(xì)弱，生長緩慢，或者增殖率較高，但個體生長勢差異較大，部分出現(xiàn)玻璃化傾向。植物組織玻璃化即植物結(jié)構(gòu)發(fā)育畸形，是一種生理失調(diào)或生理病變，很難繼續(xù)用于繼代培養(yǎng)和擴(kuò)繁材料[4]。報道指出，激素種類和濃度對玻璃苗的發(fā)生有重要影響，但激素對玻璃苗的影響程度隨外植體種類和瓊脂濃度的不同而異[8]。Leshem等[9]發(fā)現(xiàn)，過量的NAA使培養(yǎng)物內(nèi)源細(xì)胞分裂素濃度過高而造成玻璃化。而培養(yǎng)基中外源細(xì)胞分裂素供應(yīng)過多同樣容易導(dǎo)致組培苗玻璃化。例如在重瓣絲石竹的組培過程中，高濃度的細(xì)胞分裂素，尤其6- BA為5.0 mg·L-1，是導(dǎo)致玻璃苗發(fā)生的主要原因[10]。根據(jù)本試驗?zāi)康?，為了鼠尾草誘導(dǎo)及繁殖最大化，且器官發(fā)生的繁殖正常，合理濃度的生長素和細(xì)胞分裂素至關(guān)重要。在鼠尾草的誘導(dǎo)過程中，以種子為外植體時，1 mg·L-16- BA+0.1 mg·L-1NAA具有較好的誘導(dǎo)效果；而以莖基部為外植體時，2 mg·L-16- BA+0.2 mg·L-1NAA具有較好的誘導(dǎo)效果。在增殖過程中，0.6 mg·L-16- BA+0.05 mg·L-1NAA最適合鼠尾草正常芽的生長發(fā)育，并保證繁殖的快速高效。

比較鼠尾草增殖和生根情況，以鼠尾草種子和莖基部為外植體的起始材料對后期植物增殖和成活沒有太大影響，而鼠尾草種子從滅菌效率和誘導(dǎo)效率上來看，都明顯高于鼠尾草莖基部，因此，可優(yōu)先選用鼠尾草種子為外植體。

利用1/2 MS培養(yǎng)基進(jìn)行鼠尾草生根培養(yǎng)。培養(yǎng)基中生根培養(yǎng)1個月，生根率達(dá)到100%。繼續(xù)在培養(yǎng)基中生長，根可以延續(xù)伸長，但根繼續(xù)培養(yǎng)對后期煉苗沒有更多優(yōu)勢，過長的根進(jìn)入培養(yǎng)土中會腐爛枯萎。生根培養(yǎng)1個月后，開啟瓶蓋3 d左右，即可開始煉苗。將適應(yīng)環(huán)境的貴州鼠尾草轉(zhuǎn)至泥炭和蛭石體積比為1∶1的混合土中，放入大棚，培養(yǎng)溫度20 ℃，濕度85%以上。移栽開始2個月，鼠尾草種植于帶蓋子的穴盤中，減少水分散失。如果光線比較強(qiáng)，可以在上方安置遮光網(wǎng)。高濕度可能會造成雜菌滋生，2個月后開蓋培養(yǎng)，每半個月用0.1%多菌靈溶液噴灑。另外，每半個月施加薄肥(1/1 000氮磷鉀肥)以促進(jìn)鼠尾草生長。鼠尾草長大后，可以轉(zhuǎn)移到較大的營養(yǎng)缽或者盆中生長，以保證足夠的土壤空間和肥力。

[1] 魏宇昆, 王琦, 黃艷波. 唇形科鼠尾草屬的物種多樣性與分布[J]. 生物多樣性, 2015, 23(1): 3- 10.

[2] 孫雄才. 中國植物志[M]. 北京: 科學(xué)出版社， 1998.

[3] 何可群, 盧文蕓, 李相興, 等. 貴州鼠尾草的總黃酮含量測定[J]. 貴州農(nóng)業(yè)科學(xué), 2013, 41(1): 77- 79.

[4] 胡彥, 趙艷. 植物組織培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用以及在培養(yǎng)過程中存在的問題[J]. 陜西師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版), 2004, 32(增1): 130- 134.

[5] 楊海蓮, 孫曉潞, 宋未. 植物內(nèi)生細(xì)菌的研究[J]. 微生物學(xué)通報, 1998, 25(4): 224- 227.

[6] 柴娟. 細(xì)胞分裂素的生物合成及信號途徑的研究進(jìn)展[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2008, 36(10): 3985- 3989.

[7] 沈逢源, 李高燕, 劉思琪. 植物組織培養(yǎng)過程中的影響因素[J]. 現(xiàn)代園藝, 2011 (4): 12.

[8] 葉添謀. 植物組織培養(yǎng)過程中的常見技術(shù)難題研究進(jìn)展[J]. 韶關(guān)學(xué)院學(xué)報, 2010, 31(3): 84- 90.

[9] LESHEM B, WERKER E, SHALEV D P. The effect of cytokinins on vitrification in melon and carnation [J]. Annals of Botany, 1988, 62(3): 271- 276.

[10] 劉非燕, 郭達(dá)初. 重瓣絲石竹試管苗玻璃化發(fā)生原因初探[J].杭州大學(xué)學(xué)報, 1996, 23(4): 382- 387.

(責(zé)任編輯：侯春曉)

2016- 12- 09

高 燕(1982—)，女，江蘇鹽城人，高級工程師，博士，從事植物細(xì)胞生物學(xué)和細(xì)胞工程研究工作，E- mail：gaoyan106@126.com。

奉樹成(1966—)，男，湖南婁底人，高級工程師，碩士，從事植物學(xué)研究工作，E- mail：shbg2009@126.com。

10.16178/j.issn.0528- 9017.20170313

S567.53

A

0528- 9017(2017)03- 0407- 05

文獻(xiàn)著錄格式：高燕，魏宇昆，奉樹成. 貴州鼠尾草組織培養(yǎng)育苗技術(shù)[J].浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，58(3)：407- 411.