狄正鴻，許靜，侯殿東，紀(jì)蓮，劉曉梅，孫魯寧

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)1.附屬盛京醫(yī)院皮膚科，沈陽(yáng)110004；2.附屬第一醫(yī)院皮膚科，沈陽(yáng)110001；3.附屬盛京醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心，沈陽(yáng)110004；4.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，沈陽(yáng)110122）

小鼠SPINK5基因重組過(guò)表達(dá)腺病毒載體構(gòu)建及其對(duì)特應(yīng)性皮炎小鼠模型皮損療效的研究

狄正鴻1，許靜1，侯殿東2，紀(jì)蓮3，劉曉梅3，孫魯寧4

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)1.附屬盛京醫(yī)院皮膚科，沈陽(yáng)110004；2.附屬第一醫(yī)院皮膚科，沈陽(yáng)110001；3.附屬盛京醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心，沈陽(yáng)110004；4.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，沈陽(yáng)110122）

目的構(gòu)建表達(dá)小鼠SPINK5基因的重組腺病毒載體，觀察其對(duì)特應(yīng)性皮炎小鼠模型的治療效果。方法采用DNA重組技術(shù)，將攜帶小鼠SPINK5基因的腺病毒穿梭質(zhì)粒與攜帶腺病毒基因組的包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，產(chǎn)生重組腺病毒。采用卵清蛋白，通過(guò)腹腔，皮下注射系統(tǒng)致敏結(jié)合皮膚局部外涂局部致敏Balb/c小鼠，建立特應(yīng)性皮炎小鼠模型。將攜帶SPINK5基因的腺病毒載體注射至特應(yīng)性皮炎小鼠模型皮損內(nèi)，觀測(cè)其對(duì)特應(yīng)性皮炎小鼠模型的治療效應(yīng)。結(jié)果成功構(gòu)建了表達(dá)小鼠SPINK5基因的重組腺病毒載體及小鼠特應(yīng)性皮炎模型，該病毒載體注射于特應(yīng)性皮炎小鼠模型皮損內(nèi)，治療2周可明顯減輕皮損處潮紅，水腫及炎性反應(yīng)。皮損處病理檢測(cè)顯示，與模型對(duì)照相比較，皮損厚度，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯改善。結(jié)論SPINK5基因治療對(duì)特應(yīng)性皮炎小鼠模型具有明顯的治療效果。SPINK5基因產(chǎn)物局部外用有望用于特應(yīng)性皮炎的治療。

SPINK5基因；重組腺病毒載體；特應(yīng)性皮炎；小鼠模型

特應(yīng)性皮炎（atopic dermatitis，AD）是一種好發(fā)于嬰幼兒并可延續(xù)至成人的慢性瘙癢性皮膚病，生命早期患有AD可進(jìn)一步啟動(dòng)特應(yīng)性進(jìn)程，引發(fā)哮喘、過(guò)敏性鼻炎等其他過(guò)敏性疾病。近年來(lái)AD的發(fā)病率在全球呈迅速上升趨勢(shì)，可累及20%的兒童及3%的成人［1］。AD發(fā)病與皮膚屏障功能障礙密切相關(guān)，絲聚合蛋白（filaggrin，F(xiàn)LG）是維持皮膚屏障結(jié)構(gòu)及功能完整性的關(guān)鍵蛋白［2］。而由絲氨酸蛋白酶抑制劑Kazal 5型基因（serine protease inhibitor Ka?zal type 5，SPINK5）編碼的淋巴上皮Kazal型相關(guān)抑制劑（lympho?epithelial Kazal?type?related inhibitor，LEKTI）是FLG正常表達(dá)代謝的重要調(diào)控通路［3］。既往研究［4］表明AD急性及慢性皮損中FLG及LEK?TI表達(dá)均明顯下降，AD異常免疫反應(yīng)模式可降低體外培養(yǎng)的人角質(zhì)形成細(xì)胞LEKTI的表達(dá)，增強(qiáng)包括絲氨酸蛋白酶在內(nèi)的多種蛋白酶的表達(dá)，從而干擾FLG表達(dá)，顯示了LEKTI在AD發(fā)病中具有保護(hù)作用。本研究擬構(gòu)建表達(dá)小鼠LEKTI的腺病毒載體，將攜帶小鼠SPINK5基因的腺病毒穿梭質(zhì)粒與攜帶腺病毒基因組的包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，通過(guò)Cre/loxP重組酶系統(tǒng)的作用產(chǎn)生重組腺病毒。構(gòu)建小鼠AD模型，并觀察SPINK5基因重組過(guò)表達(dá)腺病毒對(duì)小鼠AD模型皮損的療效，為進(jìn)一步用于人類研究建立理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑

6周齡Balb/c雌性小鼠（北京華阜康公司），腺病毒載體GV314（CMV?MCS?3FLAG?SV40?EGFP，克隆位點(diǎn)BamHⅠ/AgeⅠ，吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司），大腸桿菌菌株DH5α（吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司），限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、AgeⅠ（美國(guó)NEB公司），HEK293細(xì)胞（美國(guó)ATCC公司），輔助包裝質(zhì)粒PBHG（中國(guó)Microbix公司），In?Fusion?PCR Clon?ing Kit（美國(guó)Clontech公司），Taq聚合酶（中國(guó)Sino?Bio公司），Plasmid抽提Kit（美國(guó)Promega公司），EndoFree midi Plasmid Kit（中國(guó)Tiangen公司），胎牛血清FBS（美國(guó)GIB公司），DMEM培養(yǎng)基（美國(guó)GIB公司），LB液體培養(yǎng)基（美國(guó)ATCC公司），Lipo?fectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑（美國(guó)Invitrogen公司），PrimeSTAR HS DNA聚合酶（日本TaKaRa公司），Adeno?X?Virus Purification Kit（BD Biosciences，美國(guó)Clontech公司），明礬、卵清蛋白（ovalbumin，OVA）（美國(guó)Sigma公司），引物由上海捷瑞生物合成，測(cè)序由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 小鼠SPINK5基因克隆及過(guò)表達(dá)腺病毒載體構(gòu)建：根據(jù)小鼠SPINK5（NM?001081180）基因cDNA的序列，設(shè)計(jì)合成含有同源重組序列及酶切位點(diǎn)的擴(kuò)增引物序列：SPINK5?P1，AGGTCGACTCTAGAG GATCCCGCCACCATGAAGACAGCCACGGTGCCAA TGCTTCTG；SPINK5?P2，CCTTGTAGTCCATACCG GTTTGCATCATTTTTTCAGATGCAGGTGTGCC。

PCR反應(yīng)擴(kuò)增SPINK5DNA片段，50 μL反應(yīng)體系如下：ddH2O 32.5 μL；5×PS Buffer 10 μL；dNTP Mix 4 μL；上下游擴(kuò)增引物（10 μmol）各1 μL；模板（10 ng/μL），1 μL；PrimeSTAR HS DNA聚合酶0.5 μL。利用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ，AgeⅠ消化腺病毒載體GV314獲得線性化載體，參照GV314載體說(shuō)明書構(gòu)建反應(yīng)體系，完成GV314線性載體與SPINK5基因片段的環(huán)化。將此重組產(chǎn)物加入到含有大腸桿菌DH5α的LB液體培養(yǎng)基菌液中，在培養(yǎng)板上恒溫37℃培養(yǎng)12 h。取其單克隆菌落進(jìn)行PCR鑒定。鑒定引物序列如下：P1，AAACAAACAAGAGC GATAAGG；P2，CCTTATAGTCCTTATCATCGTC，對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序。在LB液體培養(yǎng)基中，37℃擴(kuò)大培養(yǎng)測(cè)序正確的菌液。按照天根無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒試劑盒操作步驟進(jìn)行質(zhì)粒抽提，用于下游病毒包裝。

1.2.2 腺病毒包裝與滴度檢測(cè)：采用AdMax腺病毒包裝系統(tǒng)，將含有SPINK5基因的GV314載體重組產(chǎn)物，輔助包裝質(zhì)粒PBHG（該質(zhì)粒含有Cre/loxP重組酶系統(tǒng)）加入Lipofectamine 2000稀釋混合形成DNA/Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染復(fù)合物；將此轉(zhuǎn)染復(fù)合液滴加至HEK293細(xì)胞培養(yǎng)液中，利用Cre?loxP重組酶切割系統(tǒng)，產(chǎn)生攜帶SPINK5基因的重組腺病毒載體。轉(zhuǎn)染后15 d，待50%HEK 293細(xì)胞脫壁飄落，細(xì)胞顯示典型細(xì)胞病變效應(yīng)，離心收集細(xì)胞并重懸于DMEM液中，-70℃/37℃反復(fù)凍融3次，離心收集病毒上清，采用終點(diǎn)稀釋法進(jìn)行滴度測(cè)定，于-70℃保存。

1.2.3 特應(yīng)性皮炎小鼠模型建立：采用6周齡Balb/c雌性小鼠，改良OVA致敏方法［5?6］。（1）第1天（系統(tǒng)致敏）：小鼠腹腔內(nèi)注射200 μg/mL OVA溶液0.5 mL（含5%明礬佐劑）。（2）第6天（系統(tǒng)致敏）：小鼠背部皮下注射100 μg/mL OVA溶液0.5 mL。（3）第18天（第1次局部致敏）：7%水合氯醛，1 mL腹腔注射麻醉后，剃除背部毛發(fā)，用毛刷反復(fù)刺激背部皮膚，使之有微小均勻裂口。取1 000 μg/mL OVA溶液100 μL置于1 cm2無(wú)菌紗布上，貼于小鼠背部皮膚，采用保鮮膜覆蓋藥布防止藥物揮發(fā)，外纏黏性彈力繃帶，每天更換，持續(xù)1周。（4）第39天（第2次局部致敏）：重復(fù)第18天局部OVA給藥方法，持續(xù)1周。（5）第60天（第3次局部致敏）：重復(fù)第18天局部OVA給藥方法，持續(xù)1周。

1.2.4 AD小鼠模型皮損內(nèi)注射SPINK5腺病毒過(guò)表達(dá)載體：皮損處皮內(nèi)注射病毒載體，每只病毒質(zhì)?？偭?.5×108PFU，分多點(diǎn)均勻注射，注射間距0.5 cm。觀測(cè)其對(duì)AD小鼠模型的療效。分組：正常對(duì)照組、模型空白對(duì)照組、模型10 d空白對(duì)照組、模型17 d空白對(duì)照組、SPINK5腺病毒過(guò)表達(dá)載體皮損內(nèi)局部注射后10 d組、SPINK5腺病毒過(guò)表達(dá)載體皮損內(nèi)局部注射后17 d組，每組3只。

1.2.5 皮損變化及不良反應(yīng)評(píng)價(jià)：分別于上述分組時(shí)間評(píng)價(jià)皮損變化，皮膚取材，記錄皮損外觀變化，皮損組織病理HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察皮損處厚度及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)強(qiáng)度。評(píng)價(jià)SPINK5腺病毒過(guò)表達(dá)載體對(duì)AD小鼠模型的大體及組織病理學(xué)影響。觀察皮內(nèi)注射病毒載體后小鼠活動(dòng)、飲食及體質(zhì)量變化。

2 結(jié)果

2.1 SPINK5基因的克隆合成

成功克隆合成小鼠SPINK5基因片段，該DNA片段長(zhǎng)度為3 095 bp。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳可清晰顯示，見圖1。

2.2 SPINK5基因腺病毒載體構(gòu)建及測(cè)定結(jié)果

圖1 克隆合成小鼠SPINK5基因DNA片段Fig.1PCR produce fragment of mice SPINK5 gene

GV314載體與SPINK5基因片段環(huán)化后，在含有大腸桿菌DH5α的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，將獲得的單克隆菌落經(jīng)PCR鑒定，鑒定產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳，可見到小鼠SPINK5基因1、2、3、5、7、8號(hào)轉(zhuǎn)化子清晰表達(dá)，見圖2。

2.3 SPINK5基因重組腺病毒包裝及病毒濃度測(cè)定

圖2 經(jīng)瓊脂糖電泳鑒定GV314線性載體與SPINK5基因片段重組產(chǎn)物Fig.2Agarose electrophoresis of recombination product of GV314 and mouse SPINK5 gene sequence

SPINK5基因重組腺病毒載體轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞36 h，細(xì)胞內(nèi)即可觀察到明顯的熒光信號(hào)，表明目的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及熒光標(biāo)記基因表達(dá)正常，見圖3。濃縮收集病毒質(zhì)粒經(jīng)檢測(cè)濃度為1E+10 PFU/mL

2.4 AD小鼠模型構(gòu)建

經(jīng)系統(tǒng)及局部致敏過(guò)程后，小鼠在第1次局部激發(fā)致敏后具有明顯搔抓行為，背部可出現(xiàn)明顯紅斑滲出結(jié)痂，第2、3次局部激發(fā)致敏后背部皮膚逐漸增厚，局部潮紅，伴有脫屑，皮損可持續(xù)存在3～4周。表現(xiàn)為從急性皮損逐漸向慢性皮損的演變的過(guò)程。正常對(duì)照小鼠及AD模型小鼠背部皮損情況見圖4A、4B。

2.5 AD小鼠模型經(jīng)皮損內(nèi)注射SPINK5腺病毒過(guò)表達(dá)載體后皮損變化（圖4）

經(jīng)皮損內(nèi)注射SPINK5腺病毒過(guò)表達(dá)載體后10 d、17 d，與模型空白對(duì)照比較，使用腺病毒載體小鼠體質(zhì)量無(wú)明顯改變，未見局部破潰紅腫等不良反應(yīng)，飲食活動(dòng)未見明顯改變，治療組與對(duì)照組比較體質(zhì)量未見明顯差異。皮損局部潮紅明顯減輕，皮損厚度變薄。皮損處組織病理HE染色下觀察AD小鼠模型可見表皮細(xì)胞增厚，細(xì)胞間水腫，真皮內(nèi)淋巴細(xì)胞及嗜酸性粒細(xì)胞明顯浸潤(rùn)。經(jīng)皮損內(nèi)注射SPINK5腺病毒1～2周后，與模型對(duì)照比較皮損處厚度明顯減小，浸潤(rùn)炎性細(xì)胞數(shù)目明顯減少，見圖5。

圖3 SPINK5基因重組腺病毒載體轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞×200Fig.3HEK 293 cells transformed with recombinant adenovirus vector containing mouse SPINK5 gene×200

圖4 AD小鼠模型皮損內(nèi)注射SPINK5基因腺病毒過(guò)表達(dá)載體治療后皮損局部改變Fig.4The effect of SPINK5 gene recombinant adenovirus on the lesions of atopic dermatitis mice model

3 討論

目前，AD皮損處外用藥治療以糖皮質(zhì)激素、鈣調(diào)磷酸酶抑制劑為主。糖皮質(zhì)類固醇激素具有導(dǎo)致皮膚萎縮，毛細(xì)血管擴(kuò)張，色素改變等不良反應(yīng)；鈣調(diào)磷酸酶抑制劑長(zhǎng)期外用具有潛在的致癌風(fēng)險(xiǎn)，因而不能長(zhǎng)期使用。FLG蛋白是維持皮膚正常屏障結(jié)構(gòu)及功能的關(guān)鍵性蛋白。LEKTI在表皮分化的過(guò)程中通過(guò)抑制性調(diào)節(jié)Matriptase、CAP1、caspase14、SCCE、SCTE等多種蛋白酶的活性而參與FLG代謝及皮膚屏障功能的維持與平衡的多個(gè)環(huán)節(jié)。LEKTI主要通過(guò)抑制Matriptase、CAP1、caspase14而抑制FLG的過(guò)度降解；還可通過(guò)抑制SCCE、SCTE活性而阻止角質(zhì)形成細(xì)胞（keratinocyte，KC）過(guò)早成熟所導(dǎo)致的過(guò)度脫屑，因此，LEKTI是維持表皮屏障及皮膚外觀的關(guān)鍵性蛋白酶［7］。LEKTI低表達(dá)可繼發(fā)SC?CE、SCTE酶活性增高，加重炎癥反應(yīng)及過(guò)度脫屑，典型病例是在基因缺陷性皮膚病Netherton綜合征中，由LEKTI蛋白編碼基因SPINK5缺陷導(dǎo)致AD樣皮損及皮膚過(guò)度脫屑，套疊性脆發(fā)癥［8］。研究［4］表明AD皮損中FLG表達(dá)普遍下降，并伴有多種蛋白酶表達(dá)增高，而LEKTI表達(dá)明顯下降。近年的研究［9］表明SPINK5也是AD的易感基因之一，AD患者皮損中LEKTI及SPs表達(dá)普遍異常，但SPINK5基因的無(wú)義變異在AD患者中并非普遍存在。盡管FLG異常表達(dá)是AD的重要發(fā)病機(jī)制，然而由于ProFLG是400×103的超大分子量蛋白，包含10～12個(gè)高度相似，但又有細(xì)微差別的FLG重復(fù)片段，且在不同種族中存在遺傳異質(zhì)性等特征，因此針對(duì)FLG進(jìn)行基因治療目前尚難以實(shí)現(xiàn)。而LEKTI作為FLG表達(dá)代謝的核心性調(diào)控蛋白，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，是適合基因治療的理想分子。最近，有研究［10］表明人SPINK5基因重組腺病毒可增高Netherton綜合征患者體外培養(yǎng)的KC細(xì)胞SPINK5 mRNA的表達(dá)。顯示LEKTI在AD治療方面具有令人期待的藥用前景。目前缺乏SPINK5持續(xù)表達(dá)的載體，并且對(duì)人體的其他影響不明，因此需要一個(gè)持續(xù)表達(dá)的LEKTI蛋白系統(tǒng)。

圖5 HE染色顯示皮損內(nèi)注射SPINK5腺病毒過(guò)表達(dá)載體對(duì)AD小鼠模型的療效×200Fig.5HE staining of AD mice model with SPINK5 gene recombinant adenovirus×200

OVA致敏小鼠AD模型是目前廣泛應(yīng)用的AD小鼠模型之一，其外周血免疫細(xì)胞及細(xì)胞因子，皮損局部病理及免疫反應(yīng)與AD患者復(fù)合度高。其皮損處IL?4、IL?5增高，IFN?γ隨病程延長(zhǎng)而增高，呈現(xiàn)出由Th2向Th1型Th2型混合免疫反應(yīng)轉(zhuǎn)化，類似于AD慢性皮損［5?6］。筆者通過(guò)改良的OVA致敏方法建立小鼠AD動(dòng)物模型，造模成功率高，臨床及病理顯示了從急性皮損逐漸向慢性皮損演變的過(guò)程。

本研究構(gòu)建了SPINK5基因表達(dá)腺病毒載體，腺病毒載體對(duì)非分裂期及分裂期細(xì)胞均具感染力，其通過(guò)受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入宿主細(xì)胞，可將腺病毒基因轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)染色體外，但不整合入宿主細(xì)胞基因組，是目前較為安全的基因治療載體。本研究結(jié)果表明小鼠皮損內(nèi)注射整合了SPINK5基因的腺病毒載體，小鼠飲食睡眠正常，無(wú)體質(zhì)量下降、死亡等表現(xiàn)。皮損內(nèi)注射SPINK5基因表達(dá)腺病毒質(zhì)粒后與模型對(duì)照比較，治療2周可明顯減輕皮損處潮紅、水腫及炎癥反應(yīng)。皮損處病理與模型對(duì)照比較，皮損厚度、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯改善。

LEKTI分子量相對(duì)較小，皮膚外用基因治療具有基因?qū)敕奖悖瑒┝恳子谡{(diào)控等特點(diǎn)，推測(cè)蛋白酶抑制劑LEKTI有望成為未來(lái)AD藥物治療的重要靶點(diǎn)，局部使用LEKTI生物活性片段具有高度藥理前途，開發(fā)LEKTI類藥物有望經(jīng)AD治療帶來(lái)新的突破。

［1］NUTTEN S.Atopic dermatitis：global epidemiology and risk factors［J］.Ann Nutr Metab，2015，66（Suppl 1）：8-16.DOI：10.1159/ 000370220.

［2］THYSSEN JP，KEZIC S.Causes of epidermal filaggrin reduction and their role in the pathogenesis of atopic dermatitis［J］.J Allergy Clin Immunol，2014，134（4）：792-799.DOI：10.1016/j.ja?ci.2014.06.014.

［3］O’REGAN GM，SANDILANDS A，MCLEAN WH，et al.Filaggrinin atopic dermatitis［J］.J Allergy Clin Immunol，2008，122（4）：689-693.DOI：10.1016/j.jaci.2008.08.002.

［4］DI ZH，MA L，QI RQ，et al.T helper 1 and T helper 2 cytokines dif?ferentially modulate expression of filaggrin and its processing prote?ases in human keratinocytes［J］.Chin Med J（Engl），2016，129（2）：295-303.DOI：10.4103/0366?6999.174489.

［5］SPERGEL J，MIZOGUCHI E，BREWER J，et al.Epicutaneous sen?sitization with protein antigen induces localized allergic dermatitis and hyperresponsiveness to metacholine after single exposure to aerosolized antigen in mice［J］.Clin Invest，1998，101（8）：1614-1622.DOI：10.1172/JCI1647.

［6］YATSUZUKA R，INOUE T，JIANG S，et al.Development of new atopic dermatitis models characterized by not only itching but also inflammatory skin in mice［J］.Eur J Pharmacol，2007，565（1/3）：225-231.DOI：10.1016/j.ejphar.2007.02.062.

［7］MEYER?HOFFERT U.Reddish，scaly，and itchy：how proteases and their inhibitors contribute to inflammatory skin diseases［J］. Arch Immunol Ther Exp（Warsz），2009，57（5）：345-354.DOI：10.1007/s00005?009?0045?6.

［8］D’ALESSIO M，F(xiàn)ORTUGNO P，ZAMBRUNO G，et al.Netherton syndrome and its multifaceted defective protein LEKTI［J］.G Ital Dermatol Venereol，2013，148（1）：37-51.

［9］ZHAO LP，DI Z，ZHANG L，et al.Association ofSPINK5gene poly?morphisms with atopic dermatitis in Northeast China［J］.J Eur Acad Dermatol Venereol，2012，26（5）：572-577.DOI：10.1111/ j.1468?3083.2011.04120.x.

［10］ROEDL D，OJI V，BUTERS JT，et al.rAAV2?mediated restoration of LEKTI in LEKTI?deficient cells from Netherton patients［J］.J Dermatol Sci，2011，61（3）：194-198.DOI：10.1016/j.jderms?ci.2010.12.004.

（編輯武玉欣）

Construction of Recombinant Adenovirus Vector Expressing Mouse SPINK5 Gene and Its Curative Effect on Skin Lesions in Atopic Dermatitis Mice

DI Zhenghong1，XU Jing1，HOU Diandong2，JI Lian3，LIU Xiaomei3，SUN Luning4
（1.Department of Dermatology，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China；2.Department of Dermatology，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China；3.Experiment Center，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China；4.Department of Pathophysiology，College of Basic Medical Science，China Medical University，Shenyang 110122，China）

ObjectiveTo construct a recombinant adenovirus vector expressing mouseSPINK5gene，and observe its curative effect on the skin lesions in atopic dermatitis mice model.MethodsBy recombining DNA technology，the sequence of mouseSPINK5gene was cloned into adeno?virus shuttle plasmid.Then it was transformed into HEK 293 cells with the adenoviral backbone plasmid to obtain the recombinant adenovirus.A mouse model of atopic dermatitis was established by system and local sensitization of Balb/c mice with ovalbumin.The effect of recombinant adeno?virus on the lesions of atopic dermatitis mice model was observed.ResultsTheSPINK5over?expressing adenovirus vector and atopic dermatitis mice model were successfully constructed.After 2 weeks of adenovirus?mediatedSPINK5gene intracutaneous injection，the redness and edema of lesions of AD model mice were obvious relieved.The pathological detection indicated that epidermal thickness and prickle cell layer，inflammatory cell infiltration significant decreased accompanied with the model blank control.ConclusionThe adenovirus?mediatedSPINK5gene had signifi?cant therapeutic effect to the atopic dermatitis mice model，which provided a laboratory basis of application ofSPINK5gene product to therapy atopic dermatitis.

SPINK5gene；recombinant adenovirus vector；atopic dermatitis；mice model

R751.05

A

0258-4646（2017）01-0011-06

10.12007/j.issn.0258?4646.2017.01.003

國(guó)家自然科學(xué)基金（81301366）；遼寧省自然科學(xué)基金（2013021004，2014021056）

狄正鴻（1973-），女，副教授，博士. E-mail：dizh2005@163.com

2016-05-07

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