董菲菲 潘宇政 彭玲玲 鄧淑蓉 張 慧

廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 廣西壯族自治區(qū)南寧市 530021

肉桂水提取物對重型顱腦損傷大鼠腦細胞凋亡、IL-6的影響

董菲菲 潘宇政 彭玲玲 鄧淑蓉 張 慧

廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 廣西壯族自治區(qū)南寧市 530021

目的：通過觀察肉桂水提取物對重型顱腦損傷大鼠腦細胞凋亡、血清白細胞介素(interleukin，IL)-6的影響，探討肉桂對重型顱腦損傷腦組織的保護作用。方法：54只SD大鼠隨機分為三組，根據(jù)Feeney′s自由落體打擊造模法復(fù)制動物模型。于傷后6h灌胃。灌胃后24h、72h、168h分別通過TUNEL法、ELISA法檢測腦細胞凋亡、血清IL-6的含量。結(jié)果：（1）重型顱腦損傷大鼠受傷后血清IL-6明顯升高，持續(xù)至168h。用肉桂水提取物干預(yù)后，在72h明顯加重血清IL-6的升高，而在168h可以抑制血清IL-6的升高。（2）重型顱腦損傷大鼠在受傷后存在明顯的腦細胞凋亡，這種凋亡一直持續(xù)至168h。用肉桂水提取物干預(yù)后，在72h明顯加重這種凋亡，而在168h可以改善腦細胞凋亡。其作用與IL-6的含量相關(guān)。結(jié)論：肉桂水提取物對重型顱腦損傷早期用藥會加劇炎癥反應(yīng)和細胞凋亡，三天后用藥則呈現(xiàn)明顯的保護作用。

肉桂；重型顱腦損傷；腦細胞凋亡；IL-6

中藥肉桂系樟科植物肉桂的干燥樹皮，性辛、甘、大熱，歸腎、肝、心、脾經(jīng)，具有補火助陽，散寒止痛，溫通經(jīng)脈等功能；主要用于陽虛、寒凝瘀滯等病癥的治療[1]。當(dāng)代有人發(fā)現(xiàn)，肉桂水提液對非創(chuàng)傷性缺血性腦損傷具有一定的保護作用[2]，可以通過提高神經(jīng)因子的表達，從而促進慢性腦缺血后腦組織損傷修復(fù)過程[3]。然而這些研究主要是觀察肉桂對缺血性腦損傷的保護作用，對創(chuàng)傷性顱腦損傷的保護作用還未見研究報道。為此，本實驗通過炎癥反應(yīng)介質(zhì)IL-6和細胞凋亡等指標(biāo)，觀察肉桂對重型顱腦損傷腦組織修復(fù)的保護作用。

1 實驗材料及儀器

1.1 主要藥品、試劑及儀器

肉桂（產(chǎn)于廣西）購于廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房；TUNEL試劑盒購自于Roche公司； ELISA試劑盒購自欣博盛生物科技有限公司，編號∶ERC003。改良的Feeney’s 自由落體打擊裝置；Multiskan FC酶標(biāo)儀（塞默飛世爾儀器有限公司生產(chǎn)）；高速冷凍離心機（英國生產(chǎn)，型號：英泰TDL5M）；正置熒光相差顯微成像鏡（型號：BΧ53+DP73+cellsens）

1.2 實驗動物、動物分組及給藥

SPF級雄性SD大鼠56只，體質(zhì)量（230±20）g，購自于廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心,許可證號∶SCΧK(桂)2014-0002。SD大鼠隨機分成A組（正常對照組）﹑B組(模型組)﹑C組（肉桂水提取物組）三組，每組各18只。給藥組在造模后6h予肉桂水提取物灌胃，劑量用成人每日常用量5g，換算成大鼠劑量，計算方法依據(jù)徐淑云藥理實驗方法學(xué)公式計算【劑量=(成人的用量×換算系數(shù)0.018×3.16倍)/2】，正常對照組與模型組分別在傷后6h以等量生理鹽水灌胃，各組灌胃均每日1次，連續(xù)7天。

1.3 重型顱腦損傷模型制備

根據(jù)文獻[4]建立模型。于造模6h后，參照有相關(guān)文獻[5]對每只動物行神經(jīng)功能缺損評分，評分標(biāo)準(zhǔn)參照《現(xiàn)代藥理實驗方法學(xué)》[6]，采用10 分制、單盲法進行評分；＞2 分則說明造模成功，＜2 分則剔除。

1.4 標(biāo)本采集及檢測

1.4.1 標(biāo)本采集

各組分別在造模后第24、72、168h三個時間段取材，每組每個時間段隨機取6只大鼠。（1）以心臟采血法采血3mL，4℃，2200 r/min離心15min，取上清液，置-80℃冰箱待測IL-6。（2）經(jīng)升主動脈灌注250mL的0.9%氯化鈉注射液，直至從右心房流出的液體變清亮為止，再灌注4%多聚甲醛液250mL，斷頭取腦，并迅速浸入4%多聚甲醛液中，固定24h后修成4mm塊，常規(guī)酒精脫水、石蠟包埋待測腦細胞凋亡。

1.4.2 腦細胞凋亡檢測

以TUNEL原位法檢測損傷區(qū)凋亡細胞，嚴(yán)格按試劑盒說明步驟進行檢測。每組6只大鼠分別選同一冠狀層的切片在高倍鏡下觀察，細胞核中出現(xiàn)棕黃色的為陽性細胞，8 個高倍視野計數(shù)TUNEL陽性標(biāo)記細胞，計算凋亡陽性細胞百分比，陽性率=陽性細胞數(shù)/（陽性細胞數(shù)+ 陰性細胞數(shù)）×100%。

1.4.3 血清IL-6檢測

采用ELISA法檢測，嚴(yán)格按照試劑盒說明書步驟進行檢測。最后使用酶標(biāo)儀450nm波長按順序測量各孔的濃度值。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

表1：各組血清IL-6含量（±s，pg/ml）

表1：各組血清IL-6含量（±s，pg/ml）

與A組比較，#P＜0.05；與同時間段B組比較，*P＜0.05；與同組168h比較，△P＜0.05

組別N24h72h168h A組1851.03 ±23.7651.02 ±24.3650.03 ±13.76 B組18142.23±52.32#126.53±34.74#102.82±34.50# C組18141.67±6.99#△275.80± 98.67#*△60.09±17.65*

表2：各組腦組織TUNEL細胞凋亡率（±s，%）

表2：各組腦組織TUNEL細胞凋亡率（±s，%）

與A組比較，#P＜0.05；與同時間段B組比較，*P＜0.05；與同組168h比較，△P＜0.05

組別N24h72h168h A組189.44 ± 2.8610.05± 3.1210.25± 2.90 B組1874.75±10.13#68.55±11.46#68.23± 5.46# C組1872.84±6.90#△81.14± 6.86#*△39.74± 12.26#*

2.1 血清IL-6含量

結(jié)果見表1。B、C組與A組比較，血清IL-6含量明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。C組在72h與B組比較，C組IL-6含量明顯高于B組。C組在168h與B組比較，C組IL-6含量明顯低于B組。C組在168h時間段與24h、72h兩個時間段比較有差異。B組各時間段比較，無明顯差異（P＞0.05）。這些結(jié)果提示，重型顱腦損傷大鼠受傷后外周血血清IL-6明顯升高，一直持續(xù)至168h。用肉桂水提取物干預(yù)后，在24h無變化，在72h血清IL-6水平明顯升高，而在168h血清IL-6水平明顯下降，接近正常組水平。

2.2 腦組織TUNEL細胞凋亡率

結(jié)果見表2。B、C組與A組比較，腦細胞凋亡率明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。C組在72h與B組比較，C組明顯高于B組。C組在168h與B組比較，C組明顯低于B組。C組在168h時間段與24h、72h兩個時間段比較有差異。B組各時間段比較，無明顯差異（P＞0.05）。這些結(jié)果提示，重型顱腦損傷大鼠在受傷后存在明顯的腦細胞凋亡，這種凋亡一直持續(xù)至168h。用肉桂水提取物干預(yù)后，在24h凋亡無變化，在72h凋亡加重，而在168h腦細胞凋亡則比模型組明顯下降。

2.3 血清IL-6水平與腦細胞凋亡的關(guān)系

結(jié)果見圖1。C 組血清IL-6水平與腦細胞凋亡率相關(guān)關(guān)系Pearson 的系數(shù)r = 0.816，P = 0.000（雙側(cè)）。其他各組血清IL-6水平與腦細胞凋亡率無相關(guān)關(guān)系。結(jié)果顯示C組血清IL-6水平與腦細胞凋亡率有正相關(guān)關(guān)系。

3 討論

重型顱腦損傷早期都存在繼發(fā)炎癥反應(yīng)，這一炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致腦損傷的主要機制之一[7，8]。IL-6 在炎癥反應(yīng)中扮演著重要角色，Marklund等人[9]認為IL-6在損傷發(fā)生后即刻就上升，而且損傷程度越嚴(yán)重，血中IL-6的含量就越高，IL-6含量與腦損傷程度呈正比。本研究發(fā)現(xiàn)，重型顱腦損傷大鼠受傷后外周血血清IL-6即明顯升高，這一現(xiàn)象一直持續(xù)至第168h。結(jié)果與Marklund等人的研究結(jié)果基本一致。說明顱腦損傷后一周內(nèi)一直存在明顯的炎癥反應(yīng)。用肉桂水提取物干預(yù)后，在72hIL-6水平比模型組明顯升高，而在168h IL-6水平則明顯降低，接近正常水平。這說明顱腦損傷早期（72h內(nèi)）用藥，肉桂會加劇顱腦損傷的炎癥反應(yīng)，從而加重腦組織損傷。而72h后用藥則能夠抑制顱腦損傷的炎癥反應(yīng)，呈現(xiàn)保護腦細胞的作用。

研究表明，顱腦損傷導(dǎo)致的腦細胞損害除了直接損傷引起的腦細胞死亡外，還存在繼發(fā)的細胞凋亡[10-12]。張劍濤[13]等人報道顱腦損傷傷灶周圍額皮質(zhì)在4h后即開始出現(xiàn)腦細胞凋亡現(xiàn)象，以后凋亡細胞逐漸增加，至3d達高峰，之后有所下降。腦細胞凋亡的原因很多，但顱腦損傷繼發(fā)的炎癥反應(yīng)可能是重要原因之一。實驗中觀察到，重型顱腦損傷大鼠在受傷后存在明顯的腦細胞凋亡，一直持續(xù)到168h。用肉桂干預(yù)后，腦細胞凋亡在早期明顯加劇，而在72h后明顯減少細胞的凋亡。細胞凋亡的趨勢與炎癥反應(yīng)重要指標(biāo)IL-6水平的變化趨勢基本一致。這表明顱腦損傷早期用藥，肉桂會加劇炎癥反應(yīng)，以致加重腦細胞的凋亡，而72h后用藥則可以抑制炎癥反應(yīng)，從而減輕腦細胞凋亡，起到保護腦細胞的作用。

肉桂對顱腦損傷炎癥反應(yīng)和細胞凋亡的影響機制還不是很清楚。可能與肉桂通過抑制炎癥因子降低腦水腫有關(guān)。細胞因子炎癥反應(yīng)可加重腦水腫、腦組織缺氧使得中樞神經(jīng)系統(tǒng)進一步遭受損害[14]。有人發(fā)現(xiàn)肉桂水提物通過減輕缺血區(qū)腦組織水腫而明顯降低腦含水量，而對缺血性腦損傷具有一定的保護作用[2]。楊小鋒[15]等人提出，腦組織凋亡細胞數(shù)與顱內(nèi)壓、腦組織含水量在不同時期呈正相關(guān), 在總體的變化過程中也有正相關(guān)性。

圖1

（通訊作者：潘宇政）

[1]高學(xué)敏.中藥學(xué)[M].2版.北京:中國中醫(yī)藥出版社,2007:240．

[2]黃宏妙,郭占京,蔣凌風(fēng)等.肉桂水提液對全腦缺血再灌注損傷大鼠MAO和CAT的影響[J].中國實驗方劑學(xué)雜志,2011(23):159-161.

[3]張文風(fēng).肉桂對慢性腦缺血大鼠氧化應(yīng)激及神經(jīng)因子表達的影響[J].中醫(yī)雜志,2010(07):645-647.

[4]潘宇政,黃李平,李凱等.牛膝對重型顱腦損傷大鼠血清IL-2 及神經(jīng)細胞凋亡的影響[J].中國中醫(yī)急癥,2015,24(02):197-200.

[5]仁增，張躍康，馬潞，等.川芎嗪對大鼠重型顱腦損傷后神經(jīng)細胞凋亡及Bcl-2、Bax表達的影響[J].中國臨床神經(jīng)外科雜志,2009,14(01):37-39.

[6]張均田.現(xiàn)代藥理實驗方法[M].北京:北京醫(yī)科大學(xué)中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社,1998:1241.

[7]董為偉.神經(jīng)保護的基礎(chǔ)與臨床[M].北京:科學(xué)出版社,2002:222-238.

[8]趙繼宗,肖新如.顱腦損傷實驗研究的現(xiàn)狀與展望[J].中華實驗外科雜志,2002,19(01):9-10.

[9]Marklund N,Keck C,Hoover R,et al.Administration of monoclonal antibodies neutralizing the inflammatory mediators tumor necrosis factor alpha and interleukin-6 does not attenuate acute behavioral deficits following experimental traumatic brain injury in the rat[J].Restor Neurol Neurosci,2005,23(01):31-[10] Rink A,Fung KM,Trojanowski JQ,et al.Evidence of apoptotic cell death after experimental traumatic brain injury in the rat[J].Am J Pathol,1995,147(06):1575.

[11]Colicos MA，Dash PK.Apoptotic morphology of dentate gyanule cells following experimental cortical impact injury in rats：Possible role in spatial menory deficits[J].Brain Res,1996,739(02):120-131.

[12]Clark RS,Cheng J,Watkins SL,et al.Apoptosis–suppressor gene Bcl -2 expression after traumatic brain injurey in the rats[J].J neurosci,1997,17(06):9172-9182.

[13]張劍濤,王宏磊,徐寧等.大鼠顱腦損傷后神經(jīng)細胞的凋亡[J].中國生物制品學(xué)雜志,2009(09):872-875.

[14]Maier B,Schwerdtfeger K,Mauter A,etal.Differential release of intedeukines-6,8,and 10 incerebrospinal fluid and plasma after traumatic brain injury[J]. Shock,2011:11(05):421-426.

[15]楊小鋒,龔江標(biāo),虞軍等.創(chuàng)傷性顱腦損傷后細胞凋亡狀態(tài)與腦水腫、顱內(nèi)壓的相關(guān)性研究[J].浙江預(yù)防醫(yī)學(xué),2005(01):17-19.

國家自然科學(xué)基金（NSFC.81460687），廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生廳中醫(yī)藥科技專項（GZLC14-29）。

董菲菲（1990-），女，碩士研究生。

潘宇政（1961-），男，碩士生導(dǎo)師。