侯沛秋，祝 丹，唐 曦，林 川，曾大奎

組織型纖溶酶原激活物突變體對鼠急性腦梗死及腦組織保護(hù)作用實(shí)驗(yàn)研究

侯沛秋1，祝 丹1，唐 曦2，林 川3，曾大奎3

（1.成都醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)影像系，四川 成都 610500；2.成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 醫(yī)學(xué)影像系，四川 成都 610500；3.四川省宜賓市第二人民醫(yī)院 腫瘤二科，四川 宜賓 644000）

目的 評價(jià)新型組織型纖溶酶原激活物突變體（t-PAm）對鼠急性腦梗死溶栓作用及腦組織保護(hù)作用。 方法 84只成年Wistar大鼠隨機(jī)分為對照組、組織型纖溶酶原激活物組（t-PA）、低劑量組織型纖溶酶原激活物突變體組（低劑量t-PAm組）及常規(guī)劑量組織型纖溶酶原激活物突變體組（常規(guī)劑量t-PAm組），大腦中動(dòng)脈血栓形成3 h后進(jìn)行相應(yīng)治療。觀察溶栓24 h后腦梗死面積、神經(jīng)損傷評分、腦出血的情況，并通過中性粒細(xì)胞浸潤及蛋白酶激活受體1（PAR-1）濃度的變化了解t-PAm對腦組織的保護(hù)作用。結(jié)果 梗死后應(yīng)用低劑量t-PAm[（108.5±27.3）mm3]及常規(guī)劑量t-PAm[（68.3±17.2）mm3]組梗死面積均較對照組降低，同時(shí)梗死面積與神經(jīng)評分有明確的相關(guān)性（r=0.613，P=0.000），且低劑量t-PAm在溶栓的同時(shí)沒有明顯增加腦出血的概率。t-PAm還減少髓過氧化物酶的生成，并與t-PA組相比減少PAR-1的生成（P＜0.001）。結(jié)論 新型組織型纖溶酶原激活物突變體有較好的溶栓作用，同時(shí)對缺血腦組織有明顯的保護(hù)作用。

尿激酶；血栓；組織型纖溶酶原激活物；突變體

腦組織具有不可再生的特點(diǎn)，隨著腦梗死時(shí)間的延長，腦細(xì)胞壞死逐漸增加，因此，盡早開通閉塞血管有著決定性的意義。溶栓劑被廣泛應(yīng)用在急性腦梗死中，目前急性腦梗死的溶栓窗限定在血栓形成后3 h內(nèi)，延遲溶栓增加腦出血及血腦屏障損傷的風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)增加其他腦血管疾病的發(fā)生率。因此，尋找一個(gè)療效好、副作用低的溶栓劑會(huì)給患者及社會(huì)帶來極大的益處[1-5]。本實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)觀察新型組織型纖溶酶原激活物突變體（tissue type plasminogen activator mutant，t-PAm）對大鼠急性腦梗死的溶栓療效。本研究希望新藥t-PAm能減少出血風(fēng)險(xiǎn)，提高再通率，并對缺血再灌注的腦組織有保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

84只雄性成年Wistar大鼠，平均體重（332± 19）g，合格證號：SCXK（滬）2013-0009（上海大學(xué)醫(yī)學(xué)院）。愛通立粉劑（德國勃林格殷格翰公司），普通肝素（常州千紅生物制藥有限公司），2，3，5-氯化三苯四唑（上海源葉生物科技有限公司），戌二醛固定液（常州千紅生物制藥有限公司），0.1%四氮唑藍(lán)溶液（深圳中晶生物技術(shù)有限公司），異氟醚（杭州維康科技有限公司），三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽（廣州偉伯化工有限公司），0.05%聚環(huán)氧乙烯月桂酰醚（深圳銘科化工有限公司），1%聚乙二醇辛基苯基醚（廣州偉伯化工有限公司），10%聚丙烯酰胺瓊脂糖凝膠（天津比克化學(xué)科技有限公司），抗髓過氧化物酶（Myelopero xidase，MPO）的鼠單克隆抗體（上海葉民生物技術(shù)有限公司），兔多克隆抗體（南京金斯瑞生物科技有限公司），β-微管蛋白（北京博奧森生物技術(shù)有限公司），抗兔二抗（上海歐韋達(dá)儀器科技有限公司），山羊抗小鼠多克隆抗體（美國Santa Cruz公司），兔抗山羊免疫球蛋白G（Immunoglobulin G，IgG）（上海西唐生物科技有限公司），鏈霉親和素-生物素復(fù)合物（strept avidin-biotin complex，SABC）（武漢博士德生物工程有限公司），二氨基聯(lián)苯氨（Diaminobezidin，DAB）（上海西唐生物科技有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組 84只雄性成年Wistar大鼠，平均體重（332±19）g，異氟醚麻醉（5%誘導(dǎo)，2%手術(shù)，1.2%維持）。恒溫加熱裝置使大鼠肛溫控制在（37.0±0.5）℃。體外復(fù)制新鮮血栓（直徑=0.35 mm，長度=18 mm），注射入鼠的右側(cè)大腦中動(dòng)脈（middle cerebral artery，MCA）形成急性腦梗死[6]。急性腦梗死形成3 h后大鼠被隨機(jī)分入下列4組：對照組，使用生理鹽水；組織型纖溶酶原激活物組（t-PA組），采用愛通立粉劑，總量10 mg/kg（其中10%劑量溶于鹽水后靜脈推注，余量用微量泵在30 min內(nèi)勻速泵入體內(nèi)）；常規(guī)劑量組織型纖溶酶原激活物突變體組（常規(guī)劑量t-PAm組），用法與t-PA組類似，總量10 mg/kg（其中10%劑量溶于鹽水后靜脈推注，余量用微量泵在30 min內(nèi)勻速泵入體內(nèi)）；低劑量組織型纖溶酶原激活物突變體組（低劑量t-PAm組），總量5 mg/kg，用法與t-PA組相似[7-8]。血栓形成后24h后斷頭法處死小鼠。

1.2.2 梗死面積測量、神經(jīng)系統(tǒng)損傷評分及腦出血評價(jià) 大鼠腦組織切片，應(yīng)用2，3，5-氯化三苯四唑染色評估梗死面積。采用9分法評價(jià)神經(jīng)系統(tǒng)損傷，0分=正常，9分=最重?fù)p傷[9-12]。用藥后大鼠腦出血評價(jià)大鼠腦組織沿冠狀溝切成1.5mm薄片，肉眼分析腦出血情況，分為：①HI-1型（hemorrhagic infarction type 1，HI-1），定義為梗死區(qū)周圍有點(diǎn)狀出血；②HI-2型（hemorrhagic infarction type 2，HI-2），定義為梗死區(qū)周圍有片狀出血；③PH型（parenchymal hematoma，PH）腦實(shí)質(zhì)出血，定義為梗死區(qū)周圍有大的血腫[6]。計(jì)算各組大鼠各種類型出血的數(shù)量[13-14]。

1.2.3 中性粒細(xì)胞浸潤及蛋白酶激活受體1（protease-activated receptor-1，PAR-1）濃度測量 評價(jià)中性粒細(xì)胞浸潤：腦梗死形成24 h后應(yīng)用Western blot測定髓過氧化物酶來評價(jià)中性粒細(xì)胞浸潤。腦組織分離后切片成2 mm厚，分離出同側(cè)及對側(cè)MCA范圍，組織冷凍用于分析。組織放置在緩沖液中[由50 mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽（pH=7.6），150 mmol/L氯化鈉NaCl，5 mmol/L氯化鈣CaCl2，0.05%聚環(huán)氧乙烯月桂酰醚，0.02%疊氮化鈉NaN3，1%聚乙二醇辛基苯基醚混合而成]，4℃、12 000 r/min離心5 min。在上清液中分離蛋白組織。10%聚丙烯酰胺瓊脂糖凝膠著色。蛋白轉(zhuǎn)到薄膜上，4℃孵化過夜，加抗MPO的鼠單克隆抗體，稀釋到1∶500，室溫孵化2 h，加鼠二抗，稀釋到1∶2 500，加兔多克隆抗體對抗β-微管蛋白（β-tubulin），稀釋到1∶10 000。再加過氧化物酶相連的抗兔二抗，抗兔二抗稀釋到1∶2 500。免疫組織化學(xué)法測定PAR-1。標(biāo)本置甲醛溶液中固定、包埋。按下述步驟行PAR-1免疫組織化學(xué)染色：切片、微波修復(fù)抗原、3%過氧化氫抑制、兔血清封閉、加一抗（山羊抗小鼠多克隆抗體）、4℃過夜、加生物素二抗（兔抗山羊IgG）、加SABC、DAB顯色，蘇木素復(fù)染。高倍鏡下隨機(jī)選取左側(cè)海馬皮質(zhì)相鄰而不重疊的4個(gè)視野區(qū)，用圖像分析軟件計(jì)算PAR-1陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，直線回歸分析評價(jià)梗死面積與神經(jīng)系統(tǒng)損傷評分的關(guān)系，方差分析進(jìn)行多組間比較，若有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義用LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

血栓形成后24 h測量各組小鼠校正的梗死面積以及神經(jīng)系統(tǒng)損傷評分比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，LSD-t檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，對照組梗死面積和神經(jīng)系統(tǒng)損傷評分均較其他組增高，低劑量t-PAm組梗死面積和神經(jīng)系統(tǒng)損傷評分較t-PAm組有增加，但較t-PA組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。24 h后小鼠神經(jīng)系統(tǒng)損傷評分與梗死面積的大小有相關(guān)性（r=0.613，P=0.000）。見附表和圖1、2。

在梗死外組織未見出血。出血位于梗死血管周圍的皮層下、皮層及外周腦組織中。各組出血部位無差異。分析腦出血的類型發(fā)現(xiàn)，HI-1和HI-2型的出血較PH型更常見（P＜0.05）。

t-PA組和常規(guī)劑量t-PAm組HI-2型出血較對照組有增高，而低劑量t-PAm組HI-2型出血較對照組有增高趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。t-PA組和常規(guī)劑量t-PAm組間HI-2型腦出血差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但較低劑量t-PAm組增高。這也表明低劑量t-PAm組在溶解腦梗死的同時(shí)HI-2型的腦出血的發(fā)生率有減低趨勢。

附表 不同治療方法的梗死面積和神經(jīng)系統(tǒng)損傷評分的比較 （n=21，x±s）

圖1 不同治療方法的梗死面積對比圖

圖2 梗死面積和神經(jīng)系統(tǒng)損傷評分的比較

各處理組中髓過氧化物酶表達(dá)不同（F=3.752，P=0.042），而在梗死部位的對側(cè)未見表達(dá)，LSD-t檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在愛通立溶栓后會(huì)阻止因缺血帶來的MPO的升高（t=8.536，P=0.032），應(yīng)用t-PAm后則更明顯阻止MPO的升高（t=12.536，P=0.022）。通過電泳圖看到t-PAm能夠通過提高再通率及縮短再通的時(shí)間來減少中性粒細(xì)胞的浸潤，從而減輕急性缺血帶來的炎癥反應(yīng)。見圖3、4。

凝血酶的細(xì)胞外效應(yīng)在腦組織缺血損傷中起重要作用，其細(xì)胞外效應(yīng)由凝血酶受體介導(dǎo)，PAR-1對凝血酶的介導(dǎo)作用最強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)可知隨著腦動(dòng)脈血栓形成，每個(gè)統(tǒng)計(jì)場（0.26 mm2）腦組織PAR-1陽性細(xì)胞數(shù)升高（F=12.356，P=0.012），經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，與對照組比較，應(yīng)用t-PA后，PAR-1陽性細(xì)胞數(shù)繼續(xù)升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.536，P=0.046）。而低劑量t-PAm組局部PAR-1陽性細(xì)胞數(shù)卻有下降趨勢（t=8.536，P=0.040），但較t-PA組無顯著減低，而t-PAm組PAR-1陽性細(xì)胞數(shù)較t-PA組有減低（t= 16.536，P=0.016），表明t-PAm對PAR-1生成有抑制作用。見圖5。

圖3 不同治療方法電泳圖

圖4 不同治療方法MPO相對水平比較

圖5 各組PAR-1陽性細(xì)胞數(shù)比較

3 討論

急性腦梗死在我國有較高的發(fā)生率和較大的危害，早期開通閉死的腦血管，并盡可能地降低再灌注損傷是臨床治療的方向。早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷、早期應(yīng)用有效的溶栓物及加強(qiáng)缺血腦組織的保護(hù)治療是臨床治療的基本策略，尋找理想的溶栓劑是永遠(yuǎn)努力的方向。

為降低t-PA對PAR的敏感性，延長其半衰期從而提高溶栓效果，根據(jù)t-PA與PAR的結(jié)合特性，賀石漢設(shè)計(jì)了t-PA與PAR結(jié)合部位的定點(diǎn)突變，成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pU CT-t-PAm，并表達(dá)t-PAm，t-PAm克隆到pFT-his原核表達(dá)載體上，誘導(dǎo)表達(dá)出的目的蛋白主要以不可溶的包涵體形式存在于細(xì)胞內(nèi)。在沒有PAR存在的體外實(shí)驗(yàn)已表明t-PAm活性比t-PA高很多，為減少給藥量、提高治療效果、進(jìn)一步開發(fā)半衰期較長的溶栓藥物打下良好的基礎(chǔ)[8-9]。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，急性腦梗死形成3 h后與對照組及t-PA組相比，t-PAm能減少梗死面積，并不明顯提高腦出血的發(fā)生率。低劑量t-PAm組與t-PA組有相似的溶栓療效并有較低的腦出血的發(fā)生率，而常規(guī)劑量t-PAm較t-PA組的溶栓療效更佳，且與t-PA組有相似的腦出血的發(fā)生率。因此可見，t-PAm的療效較t-PA更好。同時(shí)，梗死面積與神經(jīng)系統(tǒng)評分有密切的相關(guān)性，t-PAm組評分低于對照組。溶栓后出血是常見并發(fā)癥，在溶栓組HI-2型的出血升高，低劑量t-PAm組與t-PA組比較，HI-2型出血有降低，說明在保證溶栓療效的同時(shí)，新藥t-PAm會(huì)帶來相對較少的出血風(fēng)險(xiǎn)。

腦梗死后及時(shí)進(jìn)行抗凝血酶治療，有可能抑制PAR-1的高表達(dá)，減少氧自由基的生成，從而減輕腦組織炎癥反應(yīng)和腦組織損傷。同時(shí)積極減少中性粒細(xì)胞的浸潤也對腦組織的損傷有預(yù)防作用。已有許多藥物如S-0139、尿酸、他汀類調(diào)脂藥等[12-14]也有一定作用。本實(shí)驗(yàn)證明t-PAm有較好的抑制中性粒細(xì)胞浸潤及減低PAR-1表達(dá)的作用，表明在溶解血栓再灌注的同時(shí)，t-PAm提供很好的腦組織保護(hù)作用。

通過本實(shí)驗(yàn)證明，新型溶栓物t-PAm對急性腦梗死有良好的溶解作用，同時(shí)，腦出血的并發(fā)癥相對較少，而且能抑制中性粒細(xì)胞浸潤，降低PAR-1生成，保護(hù)腦細(xì)胞，為臨床應(yīng)用打下良好基礎(chǔ)。

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（張蕾 編輯）

Protective effect of tissue type plasminogen activator mutant on acute cerebral thrombosis and cerebral tissue in rats

Pei-qiu Hou1,Dan Zhu1,Xi Tang2,Chuan Lin3,Da-kui Zeng3
(1.Department of Medical Imaging,Chengdu Medical College,Chengdu,Sichuan 610500,China; 2.Department of Medical Imaging,the First Affiliated Hospital of Chengdu Medical College, Chengdu,Sichuan 610500,China;3.the Second Department of Oncology, the Second People's Hospital of Yibin,Yibin,Sichuan 644000,China)

Objective To evaluate the thrombolytic and brain-protective effect of new tissue plasminogen activator mutant in rat model of acute cerebral thrombosis.Methods Eighty-four adult Wistar rats were randomly divided into control group,tissue-type plasminogen activator(t-PA)group,low-dose tissue plasminogen activator mutant(lowdose t-PAm)group and conventional-dose tissue plasminogen activator mutant(regular-dose t-PAm)group.The rats of the three groups were treated separately 3 hours after thrombosis in middle cerebral artery.Volume of infarction, neurologic scores and severity of hemorrhage were observed 24 hours after treatment.The protective role of t-PAm for brain tissue was evaluated through neutrophil infiltration and the change in the concentration of PAR-1.Results Volume of infarction in the low-dose t-PAm group and the regular-dose t-PAm group was significantly smaller than that in the control group[(108.5±27.3)mm3and(68.3±17.2)mm3vs (323.4±42.3)mm3],and the neurologic scores were evidently correlated with the volume of infarction(r=0.613,P＝0.000),while the incidence of cerebral hemorrhage in the low-dose t-PAm group was not significantly increased.T-PAm also reduced the production of myeloperoxidase,as well as the production of PAR-1,compared with the t-PA group(P＜0.001).Conclusions Newtissue plasminogen activator mutant shows better thrombolytic effect with significant protection for ischemic brain tissue.

urokinase;thrombus;recombinant tissue-type plasminogen activator;mutant

R-332

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.04.005

1005-8982（2017）04-0022-05

2016-04-08

唐曦，Tel：13438105051；E-mail：zz13938972737@163.com