侯麗萍，何駿駒，馮子懿，鄭 果，梁藝聰，方少彬

（廣州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510006）

甲基睪酮對(duì)雌斑馬魚內(nèi)分泌干擾效應(yīng)的研究

侯麗萍，何駿駒，馮子懿，鄭 果，梁藝聰，方少彬

（廣州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510006）

甲基睪酮（MT）廣泛存在于造紙廢水中，為了研究其對(duì)水生動(dòng)物內(nèi)分泌的干擾效應(yīng)，選用斑馬魚為模式生物，開展甲基睪酮對(duì)斑馬魚的慢性毒性暴露實(shí)驗(yàn)。將雌性斑馬魚分別暴露在含 10、50、100 和 150 μg/L 的甲基睪酮水環(huán)境中 48 d，另設(shè)空白對(duì)照和 0.01% 甲醇對(duì)照，觀察斑馬魚的個(gè)體生長(zhǎng)指標(biāo)及組織結(jié)構(gòu)的變化。結(jié)果表明：當(dāng) MT 濃度為 150 μg/L 時(shí)，斑馬魚全部死亡；而在 0～100 μg/L 的 MT 暴露處理中，隨著MT濃度的增加，斑馬魚的體重逐漸減輕，體長(zhǎng)逐漸縮短，臀鰭逐漸變大，體色轉(zhuǎn)向偏黃，出現(xiàn)了雄性化的特征；而且肝臟和性腺重量均明顯減輕，卵巢出現(xiàn)明顯的退化特征，肝細(xì)胞逐漸腫大，細(xì)胞核偏移中央，且伴隨細(xì)胞中空等現(xiàn)象；其中，50 和 100 μg/L MT 處理的斑馬魚鰓絲變得高低不一，有的開始斷裂甚至結(jié)構(gòu)無法辨認(rèn)。

斑馬魚；環(huán)境激素；甲基睪酮；毒理作用

近年來，隨市場(chǎng)需求的不斷增長(zhǎng)，激素因見效快、輻射廣、周期短及獲取途徑多等優(yōu)點(diǎn)在養(yǎng)殖業(yè)被廣泛使用。某些商家為了快速牟利，便將激素混入飼料中喂養(yǎng)畜禽，讓畜禽畸形生長(zhǎng)，使其適應(yīng)市場(chǎng)需求。這種做法不僅會(huì)使牲畜內(nèi)分泌系統(tǒng)失調(diào)，各器官出現(xiàn)畸形化病變，殘留的激素還可能流入周圍環(huán)境禍害當(dāng)?shù)氐钠渌麆?dòng)物，破壞生態(tài)平衡。在激素使用中，環(huán)境激素的使用最為廣泛。

環(huán)境激素又稱內(nèi)分泌干擾物（Endocrine disruptors chemicals，EDCs），因分子結(jié)構(gòu)與天然荷爾蒙相似，故易與激素受體結(jié)合，影響動(dòng)物內(nèi)分泌系統(tǒng)，導(dǎo)致動(dòng)物多種機(jī)能如生育和神經(jīng)機(jī)能不能正常運(yùn)作[1-2]。其中運(yùn)用最多的就是雄性激素。

雄激素能將雌性動(dòng)物雄性化，使其擁有部分雄性動(dòng)物的體征，在養(yǎng)殖水環(huán)境中添加一定量的雄激素如雄 烯 二 酮（4-androstene-3,17-dine，ADSD） 或 甲 基 睪酮（17 a-methyltestosterone，MT）可使雌魚肉質(zhì)更緊湊，魚類生長(zhǎng)速度加快，生長(zhǎng)周期縮短，但其會(huì)損害魚類如日本鰻鱺和劍尾魚等水生動(dòng)物的器官功能，并影響激素正常分泌，導(dǎo)致肝臟和性腺等出現(xiàn)病變[3-5]，甚至死亡。而死亡個(gè)體又會(huì)分泌出環(huán)境激素繼續(xù)污染環(huán)境，毒害其他水生動(dòng)物，影響自然狀態(tài)下物種的性別比例。各國(guó)對(duì)環(huán)境激素風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估結(jié)果表明，環(huán)境激素對(duì)各脊椎動(dòng)物長(zhǎng)期侵染有巨大危害[6]，但不同濃度甲基睪酮對(duì)魚類的影響并非呈絕對(duì)正相關(guān)或負(fù)相關(guān)[7-8]。

雄激素中 17 α- 甲基睪酮（MT）一般由人工合成，因其合成簡(jiǎn)單、效果明顯，被廣泛用于各個(gè)領(lǐng)域。MT能促進(jìn)日本鰻鱺、羅非魚及鯽魚生長(zhǎng)，還可讓雌性的魚雄性化，產(chǎn)生精子[9]，甚至可使雌性赤點(diǎn)石斑變成功能性雄魚與雌魚交配[10]。但在各國(guó)的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估報(bào)告中，MT對(duì)人類危害的評(píng)估幾乎為空白。因此，以基因與人類相似性達(dá) 85% 的斑馬魚[11]為材料，利用不同濃度 MT 進(jìn)行為期 48 d 的暴露試驗(yàn)，觀察斑馬魚的各項(xiàng)生長(zhǎng)指標(biāo)和組織結(jié)構(gòu)的變化，進(jìn)而分析判斷MT對(duì)斑馬魚的病理學(xué)作用，由此推斷MT對(duì)人類生理的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以基因與人類相似性達(dá) 85% 的斑馬魚[11]為材料（購自芳村花鳥魚市場(chǎng)），體長(zhǎng)均為 4～5 cm，體重均為 0.7～0.9 g，魚齡相當(dāng)于成體斑馬魚，以紅蟲為餌料。在實(shí)驗(yàn)室馴養(yǎng)至不再出現(xiàn)死亡個(gè)體則開始暴露試驗(yàn)。

試驗(yàn)主要試劑有甲基睪酮、0.01% 甲醇、70% 乙醇、Bouin 氏液等。暴露容器為 25 cm×20 cm×20 cm的方形玻璃缸。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 MT 暴露處理 MT 溶液設(shè)置 4 個(gè)濃度，分別為 10、50、100 和 150 μg/L，另設(shè)空白對(duì)照（CK1）與 0.01%甲醇對(duì)照（CK2）。每個(gè)處理放入 30 條魚齡相當(dāng)、大小相似的雌性斑馬魚。連續(xù)暴露 48 d，期間每隔 24 h換水一次，每次換總水量的 1/3。

1.2.2 形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采集 暴露 48 d 后斑馬魚深埋冰里致死，記錄魚的長(zhǎng)度及體重，把臀鰭切下在解剖鏡下觀察臀鰭數(shù)。

1.2.3 組織切片制作 斑馬魚冰處死后，取出其腮、肝、性腺，用 Bouin 液、乙醇、二甲苯等制作石蠟切片，切片進(jìn)行EH染色。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

試 驗(yàn)數(shù)據(jù)采 用 SPSS 軟 件進(jìn)行 分 析，并 用單因素方差分析（ANOVA） 來檢驗(yàn)不同濃度組斑馬魚各生理指標(biāo)的差異，用 LSD 對(duì)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)后多重比較。P<0.05，則認(rèn)為有顯著性統(tǒng)計(jì)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度甲基睪酮暴露對(duì)雌斑馬魚生長(zhǎng)發(fā)育的影響

試驗(yàn)結(jié)果顯示，不同濃度的MT暴露處理，對(duì)斑馬魚均產(chǎn)生了一定毒性作用，其中，150 μg/L 的處理斑馬魚全部死亡。由圖 1～ 圖6 可知，經(jīng)過 48 d 的MT 暴露，在 0～100 μg/L 濃度范圍內(nèi)，斑馬魚的身長(zhǎng)、臀鰭條數(shù)、鰓重、肝臟重及性腺重的數(shù)值均隨濃度的升高而減少，但并未表現(xiàn)出顯著性變化；而魚體重在10、50 和 100 μg/L 的 MT 暴露 下 表 現(xiàn)出極顯著減少（P<0.01）?？偟膩碚f，斑馬魚隨著甲基睪酮濃度增加，體重、體長(zhǎng)逐漸減低，外觀上臀鰭變大，體色逐漸偏黃，出現(xiàn)雄性化特征。

2.2 不同濃度甲基睪酮暴露對(duì)雌斑馬魚組織細(xì)胞的影響

圖1 甲基睪酮暴露對(duì)雌斑馬魚體長(zhǎng)的影響

圖2 甲基睪酮暴露對(duì)雌斑馬魚體重的影響[（圖中 ** 表示各處理與對(duì)照差異達(dá)極顯著水平（P ＜ 0.01）]

圖3 甲基睪酮暴露對(duì)雌斑馬魚臀鰭條數(shù)的影響

圖4 甲基睪酮暴露對(duì)雌斑馬魚鰓重的影響

圖5 甲基睪酮暴露對(duì)雌斑馬魚肝重的影響

圖6 甲基睪酮暴露對(duì)雌斑馬魚性腺重的影響

2.2.1 性腺組織切片觀察 如圖 7A 和 B 所示，空白對(duì)照和甲醇對(duì)照處理的斑馬魚，卵巢表現(xiàn)正常，卵母細(xì)胞間排列緊密，包含了5個(gè)時(shí)期卵母細(xì)胞，成熟卵母細(xì)胞豐富 ；10 μg/L 甲基睪酮暴露處理后，斑馬魚卵巢中Ⅲ期以上成熟卵母細(xì)胞數(shù)目減少（圖 7C），50 μg/L 處理組卵母細(xì)胞之間排列開始出現(xiàn)明顯松散現(xiàn)象，成熟卵期的卵母細(xì)胞發(fā)生了變形腫脹，出現(xiàn)了退化的卵母細(xì)胞（圖 7D）；100 μg/L 處理組中卵母細(xì)胞排列松散，細(xì)胞變形嚴(yán)重，表明卵母細(xì)胞退化加重，圖中Ⅱ、Ⅲ期細(xì)胞占大多數(shù)，基本沒有Ⅴ期成熟的卵母細(xì)胞（圖 7E）。

2.2.2 肝組織切片觀察 如圖8 F 和 G 所示，空白對(duì)照與甲醇對(duì)照處理的斑馬魚，肝細(xì)胞緊密排列，細(xì)胞清晰胞質(zhì)均勻，細(xì)胞核于細(xì)胞中心，細(xì)胞相對(duì)較小；10 μg/L 甲基睪酮暴露處理后，斑馬魚肝細(xì)胞腫大，細(xì)胞核偏移中央，細(xì)胞出現(xiàn)中空現(xiàn)象，細(xì)胞脂質(zhì)化逐

漸加深（圖 8H）；50 和 100 μg/L 處理組，肝細(xì)胞的空泡結(jié)構(gòu)尤為嚴(yán)重，出現(xiàn)核固縮現(xiàn)象，細(xì)胞腫大較嚴(yán)重（圖8 I、J）。

2.2.3 鰓絲切片觀察 如圖 9K、L 所示，空白對(duì)照與甲醇對(duì)照處理的斑馬魚，鰓絲排列整齊緊密，均勻細(xì)長(zhǎng) ；10 μg/L 甲基睪酮暴露處理后，斑馬魚腮絲排列變得松散且高低不一（圖 9N）；隨著甲基睪酮濃度的升高，鰓絲結(jié)構(gòu)退化越來越嚴(yán)重，50 μg/L 處理的腮絲出現(xiàn)斷裂，排列非常不整齊，腮絲變得粗短，結(jié)構(gòu)開始模糊（圖 9M）；100 μg/L 處理的鰓絲結(jié)構(gòu)退化尤為嚴(yán)重，很多部分已無法辨認(rèn)（圖 9O）。

3 討 論

圖7 不同濃度甲基睪酮暴露 48 d 后雌斑馬魚卵巢組織的變化（A：空白對(duì)照，正常卵巢；B：甲醇對(duì)照，卵巢無明顯變化；C：10 μg/L 處理，卵巢中成熟卵母細(xì)胞數(shù)目減少；D：50 μg/L 處理，卵巢細(xì)胞排列疏松；E：100 μg/L處理，卵巢中Ⅱ、Ⅲ期細(xì)胞占絕大多數(shù)）

圖8 不同濃度甲基睪酮暴露 48 d 后雌斑馬魚肝臟組織的變化（F：空白對(duì)照，正常肝臟細(xì)胞；G：甲醇對(duì)照；H：10 μg/L 處理，肝臟細(xì)胞出現(xiàn)腫大；I：50 μg/L 處理；J：100 μg/L 處理，空泡結(jié)構(gòu)嚴(yán)重，出現(xiàn)核固縮）

圖9 不同濃度甲基睪酮暴露 48 d 后雌斑馬魚鰓組織的變化（K：空白對(duì)照，正常鰓絲結(jié)構(gòu)；L：甲醇對(duì)照；N：10 μg/L 處理，鰓絲結(jié)構(gòu)排列松散；M：50 μg/L 處理，鰓絲結(jié)構(gòu)排列不整齊，鰓絲粗短；O：100 μg/L 處理，鰓絲結(jié)構(gòu)部分已無法辨認(rèn)）

參考前人[12-13]的方法，對(duì)斑馬魚各指標(biāo)間的相關(guān)性進(jìn)行線性回歸分析，結(jié)果顯示，在試驗(yàn)選取的MT 濃度范圍中，10 和 50 μg/L 的 MT 濃度處理，斑馬魚的體重發(fā)生了顯著性變化，而其他試驗(yàn)指標(biāo)在各濃度處理的差異均未達(dá)到顯著性水平。綜合切片分析，造成這一結(jié)果的原因有二：一是試驗(yàn)所采取的MT最低濃度已超出顯著性變化范圍，所以更高濃度對(duì)斑馬魚除體重指標(biāo)外的其他指標(biāo)的影響升幅不明顯；二是此次試驗(yàn)MT最高濃度沒達(dá)到顯著性變化濃度。因此，仍需擴(kuò)大試驗(yàn)濃度范圍或縮小濃度區(qū)間作進(jìn)一步研究。

試驗(yàn)中，隨著MT濃度的增加，斑馬魚的體重逐漸減輕，體長(zhǎng)逐漸縮短，臀鰭逐漸變大，體色轉(zhuǎn)向偏黃，出現(xiàn)了雄性化的特征。尤其是在高濃度MT作用下，雄性化特征逐漸明顯。石蠟切片觀察顯示，隨著MT濃度的增加，斑馬魚的肝臟、性腺和腮的重量均明顯減輕，且卵巢出現(xiàn)明顯的退化特征。這與趙春剛等[14]的研究結(jié)果相似；肝細(xì)胞逐漸腫大，細(xì)胞核偏移中央，且伴隨細(xì)胞中空、細(xì)胞脂質(zhì)化加深等現(xiàn)象；其中，50和 100 μg/L MT 處理的斑馬魚鰓絲變得高低不一，有的開始斷裂甚至結(jié)構(gòu)無法辨認(rèn)。

研究表明，甲基睪酮對(duì)魚類轉(zhuǎn)雄效應(yīng)較顯著，其中包括鮭點(diǎn)石斑魚[15]、黃腹石斑魚[16]等多種石斑魚，食蚊魚[17]和劍尾魚。該試驗(yàn)也證實(shí)了外源激素甲基睪酮的長(zhǎng)期暴露可使雌魚斑馬魚趨向雄性化發(fā)育，而且多種器官出現(xiàn)病理性損害。因此，加強(qiáng)對(duì)環(huán)境中外源性激素的評(píng)估及其對(duì)人類等哺乳動(dòng)物影響的研究十分必要。

[1]胡 榮，楊 忠，魏 璐，等 . 類固醇和腦功能的研究進(jìn)展 [J]. 生理科學(xué)進(jìn)展，2006，37（1）：1-5.

[2]王 軼，施瀚超，劉文文，等 . 甲基睪酮對(duì)小鼠的急性毒性試驗(yàn) [J].云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，30（1）：151-153.

[3]張利紅，張為民，林浩然 . 雄烯二酮和甲基睪酮對(duì)日本鰻鱺血清睪酮和 17 β-雌二醇含量的影響 [J]. 水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2001，25（2）：107-111.

[4]韓 建，許 言，余逸敏，等 . 17 α-甲基睪酮對(duì)劍尾魚的影響 [J].中國(guó)試驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào)，2010，18（6）：484-488.

[5]劉少貞，趙凌瑞，朱玉婷，等 . 17 α-甲基睪酮對(duì)麥穗魚雌魚肝臟組織學(xué)的影響 [J]. 畜牧與飼料科學(xué)，2016，37（1）：1-5.

[6]Guillette L J，Jr.Endocrine disrupting contaminants -beyond the dogma[J]. Environ Health perspect，2006，114（Suppl 1）：9-12.

[7]Yamazaki F. Application of hormones in fish culture[J]. Journal of the Fisheries Research Board of Canada，1976，33（4）：948-958.

[8]周興華，向 梟，王進(jìn)文 . 甲基睪酮對(duì)珍珠瑪麗魚及紅劍尾魚性逆轉(zhuǎn)及體色影響的初步研究 [J]. 水產(chǎn)科技情報(bào)，2000，27（3）：99-137.

[9]劉阿朋，查金苗，王子健，等 . 17 α-甲基睪酮對(duì)稀有鮈鯽幼魚性腺發(fā)育與血清卵黃蛋白原水平的影響 [J]. 生態(tài)毒理學(xué)報(bào)，2006，1（3）：254-258

[10]李廣麗，劉曉春，林浩然 . 17 α- 甲基睪酮對(duì)赤點(diǎn)石斑魚性逆轉(zhuǎn)的影響 [J]. 水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2006，30（2）：145-150.

[11]全珊珊，吳新榮 . 斑馬魚，人類疾病研究的理想模式動(dòng)物 [J]. 生命的科學(xué)，2008，28（3）：260-263.

[12]馬陶武，王子健 . 環(huán)境內(nèi)分泌干擾物篩選和測(cè)試研究中的魚類試驗(yàn)動(dòng)物 [J]. 環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2005，25（2）：135-140.

[13]侯麗萍 . 造紙廢水致食蚊魚內(nèi)分泌干擾及生態(tài)毒理效應(yīng)的研究 [D].廣州 ：華南師范大學(xué)，2011.

[14]趙春剛，范 鵬，劉 奕，等 . 甲基睪酮對(duì)雌性斑馬魚性腺發(fā)育的抑制作用 [J]. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，41（12）：70-74.

[15]Kuo G M，Ting Y Y，Yeh S L. Induced sex reversal andspawning of blue spotted grouper，Epinephelus fario[J]. Aquaculture，1988，74 ：113-126.

[16]Glamuzina B，GlavióN，Skaramuca B，et al. Induced sexreversal of dusky grouper，Epinephelus marginatus（Lowe）[J]. Aquaculture Res，1998，29 ：563-567.

[17]范俊杰，徐少群，方展強(qiáng)，等 . 17 α-甲基睪酮對(duì)食蚊魚形態(tài)雄性化及目標(biāo)基因表達(dá)的影響 [J]. 水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2013，37（1）：9-15.

（責(zé)任編輯：成 平）

Endocrine Disruption of Methyltestosterone on Zebra Fish

HOU Li-ping，HE Jun-ju，F(xiàn)ENG Zi-yi，ZHENG Guo，LIANG Yi-cong，F(xiàn)ANG Shao-bin
（School of Life Science, Guangzhou University, Guangzhou 510006, PRC）

Methyltestosterone is widely present in papermaking wastewater drainage. In order to study endocrine disrupting effects it produces, this paper used zebra fi sh as model organism to conduct methyltestosterone zebra fi sh exposed to chronic toxicity experiments. The female Zebra fi sh were exposed to the water environment with 0, 10, 50, 100 and 150 μg/L methyl testosterone in 48 days and no MT group and 0.01% methanol group used as control group, to record their growth indicators changes and tissue damaged. The results showed that exposure to 150 μg/L MT Zebra fi sh all died. In other groups, with the growth of concentration, various indicators have been changed. MT has tiggered some symptoms to treated group zebra fi sh, such as oval cells degenerated; hepatocyte tumefaction, vacuolation and nuclear offseted. Besides that, in 50 and 100μg/L MT groups, fish fin filgaments showed uneven, some of them even broken or unrecognized.

Zebra fi sh; environmental hormone; methyl testosterone; toxicological effects

S917.4

A

1006-060X（2017）03-0070-04

DOI:10.16498/j.cnki.hnnykx.2017.003.020

2016-09-26

汕頭大學(xué)開放基金（GPKLMB201603）

侯麗萍（1977-），女，廣東樂昌縣人，講師，主要從事生態(tài)毒理學(xué)研究。