譚李梅，劉 慧，朱志媚，周 東，湯 甜，鄧子牛

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖南 長沙 410128；2.國家柑橘改良中心長沙分中心，湖南 長沙 410128）

檸檬自交后代抗柑橘潰瘍病的離體鑒定

譚李梅1,2，劉 慧1，朱志媚1,2，周 東1，湯 甜1，鄧子牛1,2

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖南 長沙 410128；2.國家柑橘改良中心長沙分中心，湖南 長沙 410128）

為鑒定檸檬自交后代對(duì)柑橘潰瘍病的抗性，以檸檬鮮葉為材料，通過注射法和針刺法接種不同濃度潰瘍病菌菌液，對(duì) 114 株檸檬自交后代群體進(jìn)行離體鑒定，并以感病材料冰糖橙、抗病材料枸櫞 C-05 作為對(duì)照。結(jié)果表明：檸檬自交后代對(duì)潰瘍病抗性存在個(gè)體間差異；其中，注射接種法中表現(xiàn)為抗 104和 105CFU/mL 病原菌的植株有 24 株，針刺接種法中表現(xiàn)為抗 108CFU/mL 病原菌的植株有 11 株；其中，有 6 株檸檬自交后代在2種鑒定方法中均被認(rèn)定為抗病株。綜合2種鑒定方法，114 株檸檬自交后代中有 29 株對(duì)潰瘍病表現(xiàn)出抗 104CFU/mL 病原菌。

潰瘍?。粰幟首越缓蟠?；離體接種；抗性評(píng)價(jià)

柑橘潰瘍病是由柑橘黃單孢桿菌柑橘亞種（Xanthomonas citri subsp. citri） 引 起 的 一 種 細(xì) 菌 性 病害，對(duì)柑橘產(chǎn)業(yè)危害嚴(yán)重，世界許多國家將其列為重要檢疫性病害[1-2]。多數(shù)柑橘枝葉及果實(shí)感病后都會(huì)出現(xiàn)典型的火山口狀病斑，嚴(yán)重影響其樹勢和產(chǎn)量[3-4]。感病果實(shí)的外觀也會(huì)影響銷售，對(duì)產(chǎn)業(yè)發(fā)展產(chǎn)生不良影響。目前，主要還是采用化學(xué)藥劑來防治柑橘潰瘍病，根治起來較為困難。因此，選育抗病品種便成為解決這一問題的最有效途徑。由于對(duì)柑橘潰瘍病的抗性機(jī)理還不清晰，抗病品種的選育進(jìn)展緩慢，目前還未育成有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的抗病品種。

檸檬是重要的高酸類柑橘栽培種，其主要品種有尤力克、里斯本、費(fèi)米耐勞、菲諾等，均是柑橘潰瘍病的高感品種[5]。分子標(biāo)記研究結(jié)果表明，檸檬 [Citrus limon（L.）Burm. f.]是枸櫞和酸橙類的雜交種[6-7]；由于其親本之一的枸櫞已被鑒定為是柑橘潰瘍病的抗病種類[8]，含有對(duì)潰瘍病的抗性基因 ；所以檸檬對(duì)潰瘍病的感病性狀應(yīng)該來自于酸橙。由此推測，檸檬中控制柑橘潰瘍病抗性的基因應(yīng)該為雜合狀態(tài)，其自交后代有可能出現(xiàn)抗性分離。因此，研究擬利用感潰瘍病檸檬品種尤力克為材料，構(gòu)建自交群體，對(duì)其后代進(jìn)行潰瘍病的離體抗性鑒定，以期篩選出抗?jié)儾〉臋幟手仓辏⒊醪椒治銎淇共⌒誀畹倪z傳特征，為抗?jié)儾「涕俚倪x育打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為感潰瘍病檸檬品種尤力克。在尤力克成年樹開花前用防蟲網(wǎng)單株隔離，促使自花授粉，待果實(shí)成熟后，取出檸檬種子。在溫室播種獲得實(shí)生苗。研究鑒定的 114 株檸檬自交后代實(shí)生苗均保存在湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)國家柑橘改良中心長沙分中心的溫室內(nèi)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 潰瘍病菌準(zhǔn)備 取保存于 -80℃的潰瘍病菌液按“Z”字型劃線到 LB固體培養(yǎng)基，28℃活化培養(yǎng) 3 d。挑取單菌落于 20 mL LB 液體培養(yǎng)基中，在 28℃、200 r/min 的 搖 床 上 培 養(yǎng) 18 h。 取 活 化 菌 液 5 mL，7 500 r/min 離心 5 min，棄上清液，加入無菌水，重復(fù)此操作一次。在紫外分光光度計(jì)下用無菌水調(diào)節(jié)后測得 OD600為 0.6，再用無菌自來水重懸菌液濃度至108CFU/mL，并依次稀釋到 107、106、105、104、103、102和 10 CFU/mL 備用。

1.2.2 接種濃度的篩選 用最感病的冰糖橙和抗病的枸櫞 C-05 剛達(dá)到最大葉面積、未革質(zhì)化的黃綠色健康新葉進(jìn)行所有潰瘍病菌濃度的離體注射接種，以注射清水為對(duì)照，觀察冰糖橙和枸櫞 C-05 接種不同濃度菌液后的癥狀，最終選擇4個(gè)適宜濃度的潰瘍病菌液用于檸檬自交后代的抗性鑒定。

1.2.3 注射接種 選取剛達(dá)到最大葉面積、未革質(zhì)化的黃綠色健康新葉進(jìn)行離體注射接種，在同一葉片上分別接種不同濃度的潰瘍病菌液，以清水為對(duì)照。接種后的葉片置于干凈培養(yǎng)盒的濕潤濾紙上，封上保鮮膜，在 28℃恒溫光照條件下保濕培養(yǎng)，觀察葉片癥狀。每個(gè)處理重復(fù)3次，分別記錄每個(gè)濃度條件下，檸檬自交后代對(duì)潰瘍病的表現(xiàn)癥狀，出現(xiàn)明顯病斑（水漬狀、黃色暈圈、愈傷狀突起、病菌擴(kuò)張）則為感病，出現(xiàn)壞死斑點(diǎn)（褐色壞死、病菌不擴(kuò)張）則為抗病。以最為感病的冰糖橙和抗病的枸櫞 C-05 植株相同發(fā)育階段的葉片為對(duì)照。

1.2.4 針刺接種 從 70 株檸檬自交后代中選取剛達(dá)到最大葉面積、未革質(zhì)化的黃綠色健康新葉進(jìn)行離體針刺接種，用注射器針尖在葉面輕輕扎兩組小孔，每組 4 個(gè)，用被 108CFU/mL 潰瘍病菌菌液充分浸泡的帶菌小濾紙片覆蓋在針刺孔上，放置于干凈培養(yǎng)盒的濕潤濾紙上，封上保鮮膜，在 28℃恒溫光照條件下進(jìn)行保濕培養(yǎng)，觀察葉片癥狀。以最感病的冰糖橙和抗病的枸櫞 C-05 為對(duì)照。每個(gè)處理重復(fù) 3 次試驗(yàn)，分別記錄每組中明顯病斑數(shù)（愈傷狀突起）。發(fā)病率＝病斑數(shù)/總的針刺點(diǎn)數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 接種濃度的篩選

從圖1 中可以看出，冰糖橙注射 103CFU/mL 潰瘍病菌菌液后，出現(xiàn)零散愈傷狀突起癥狀 ；注射 104CFU/mL 菌液后，愈傷狀突起增加 ；注射 105CFU/mL菌液后，愈傷狀突起變?yōu)楹＞d狀，葉片開始潰?。蛔⑸?106CFU/mL 菌液后，葉片潰敗，病斑擴(kuò)張 ；注射更高的濃度的潰瘍病菌菌液后，葉片短時(shí)間內(nèi)潰爛，無法進(jìn)行觀察 ；注射清水后不發(fā)病。枸櫞 C-05 注射103CFU/mL 潰瘍病菌菌液后，出現(xiàn)壞死斑點(diǎn) ；注射104CFU/mL 菌 液后，出現(xiàn)壞死斑塊 ；注射 105CFU/ mL 菌液后，壞死斑塊不擴(kuò)張 ；注射 106CFU/mL 菌液后，病斑褐化壞死；注射清水后不發(fā)病。這說明選用 103、104、105和 106CFU/mL 的潰瘍病菌濃度對(duì)檸檬自交后代注射接種能看到從輕微發(fā)病到嚴(yán)重發(fā)病的癥狀范圍。因此，試驗(yàn)確定如圖2所示進(jìn)行注射接種。

2.2 注射接種鑒定結(jié)果

圖1 冰糖橙與枸櫞 C-05 接種不同濃度潰瘍病菌菌液后的癥狀表現(xiàn)（圖中上排為糖橙，下排為枸櫞 C-05）

圖2 注射接種濃度

試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，各處理葉片離體注射潰瘍病菌后，第4天便有部分葉片出現(xiàn)水漬狀斑點(diǎn)癥狀，隨后陸續(xù)有新病斑出現(xiàn)，且病斑不斷擴(kuò)大 ；接種 7 d 后，不再有新的病斑出現(xiàn) ；接種 10 d 后，所有葉片的病癥不再擴(kuò)大。因此，選用注射接種 10 d 后葉片的癥狀表現(xiàn)對(duì)各處理植株進(jìn)行抗病性的最后評(píng)價(jià)。從表1中可以看出，在離體注射接種的 114 株檸檬自交后代實(shí)生苗中，當(dāng)注 射的菌 液 濃度 為 103CFU/mL 時(shí)， 有 55 株出現(xiàn)病癥，屬于感病植株；有59株沒有表現(xiàn)癥狀，屬于抗病單株，占鑒定總數(shù)的 51.75% ；當(dāng)菌液濃度為 104CFU/mL 時(shí)，有 24 株沒有表現(xiàn)癥狀，屬于抗病單株，占鑒定總數(shù)的 21.05% ；當(dāng)菌液濃度為 105CFU/mL 時(shí)，有7株沒有表現(xiàn)癥狀，屬于抗病單株，占鑒定總數(shù)的6.14% ；當(dāng) 菌 液 濃 度 為 106CFU/mL 時(shí)， 所 有 檸 檬 自交后代實(shí)生苗均出現(xiàn)病癥。7 株抗 105CFU/mL 潰瘍病菌的植株分別為 NMZJ-47、NMZJ-80、NMZJ-144、NMZJ-202、NMZJ-343、NMZJ-383 和 NMZJ-39， 可以初步認(rèn)定這7株檸檬為抗?jié)儾沃?。部分檸檬自交后代注射潰瘍病?10 d 后的癥狀如圖3 所示。

表1 114 株檸檬自交后代注射接種鑒定結(jié)果

2.3 針刺接種鑒定結(jié)果

如圖4 所示，冰糖橙在 108CFU/mL 潰瘍病菌濃度下，所有針刺口出現(xiàn)愈傷狀突起，發(fā)病率為 100 %；枸櫞 C-05 在 108CFU/mL 潰瘍病菌濃度下，針刺口出現(xiàn)壞死狀斑點(diǎn)，發(fā)病率為0。

由表2可知，鑒定的70株檸檬自交后代實(shí)生苗中，在 108CFU/mL 潰瘍病菌濃度下，其中有 40 株發(fā)病率在 80%～100% 之間，有 16 株發(fā)病率在 60%～80%之間，有 3 株發(fā)病率在 40%～60% 之間，有 11 株發(fā)病率在 0%～40% 之間。由此可知，發(fā)病率在 40%～100 %之間的植株對(duì)潰瘍病表現(xiàn)為感病，植株數(shù)量為59株，占 鑒 定 總 數(shù) 的 84.28 % ；發(fā) 病 率 在 0%～40% 之 間 的植株對(duì)潰瘍病具有抗病性，植株數(shù)量為11株，占鑒定 總數(shù)的 15.71 %。這 11 株 抗病植株 分別為 NMZJ-47、NMZJ-80、NMZJ-100、NMZJ-144、NMZJ-160、NMZJ-172、NMZJ-222、NMZJ-343、NMZJ-383、NMZJ-39 和 NMZJ-191。 其 中，NMZJ-191 針 刺 接 種后的癥狀如圖4所示。

表2 70 株檸檬自交后代針刺涂菌接種鑒定結(jié)果

2.4 2 種鑒定結(jié)果的比較

圖3 部分檸檬自交后代注射接種 10 d 后的癥狀（121 為感病植株，386 可抗 103CFU/mL 的潰瘍病菌菌液，471 和 716 均可抗 104CFU/mL 的潰瘍病菌菌液）

圖4 針刺接種 108CFU/mL 潰瘍病菌后各品種的癥狀表現(xiàn)（從左至右依次為冰糖橙 BTC、檸檬自交 126 號(hào)、檸檬自交 191 號(hào)和枸櫞 C-05）

對(duì)比 2 種鑒定方法，發(fā)現(xiàn)注射接種表現(xiàn)為抗 104和 105CFU/mL 病原菌的植株與針刺接種表現(xiàn)為發(fā)病率在 0%～40% 之間的植株在抗病性上的差異較小，在田間對(duì)潰瘍病均表現(xiàn)為抗病。由注射接種法鑒定的 7 株抗 潰瘍 病（105CFU/mL） 植株 分別 為 NMZJ-47、NMZJ-80、NMZJ-144、NMZJ-202、NMZJ-343、NMZJ-383 和 NMZJ-39 ；由 針 刺 接 種法 鑒定 的 11 株抗 潰 瘍 病 植 株 分 別 為 NMZJ-47、NMZJ-80、NMZJ-100、NMZJ-144、NMZJ-160、NMZJ-172、NMZJ-222、NMZJ-343、NMZJ-383、NMZJ-39 和 NMZJ-191。 其中，有6株檸檬自交后代在2種鑒定方法中均被認(rèn)定為抗病株。這表明這6株的抗?jié)儾⌒誀畋容^穩(wěn)定，分別為 NMZJ-47、NMZJ-80、NMZJ-144、NMZJ-343、NMZJ-383 和 NMZJ-39。

3 小結(jié)與討論

通過大量田間調(diào)查和長期的栽培觀察發(fā)現(xiàn)，不同柑橘品種對(duì)柑橘潰瘍病的敏感性差異明顯[9-10]。在自然條件下，柑橘植株對(duì)潰瘍病的敏感性程度受到病原菌濃度及致病力、氣候條件、植物生長發(fā)育階段和人為因素等的影響。而實(shí)驗(yàn)室離體接種鑒定能保證在病原菌濃度單因素變化條件下研究不同柑橘品種對(duì)潰瘍病的敏感性差異。離體葉接種法病癥表現(xiàn)較快，發(fā)病率較高，試驗(yàn)過程不受外來因素的影響，操作簡單，結(jié)果可靠，而且試驗(yàn)后菌源便于銷毀，可避免擴(kuò)散。劉利平[11]通過比較針刺接種的發(fā)病癥狀、發(fā)病率、針刺接種 7 d 的病斑大小以及注射接種的病斑數(shù)來判斷不同柑橘品種對(duì)潰瘍病的耐抗性關(guān)系。該研究是通過對(duì)比注射接種和針刺接種2種離體接種方法對(duì)檸檬自交后代鑒定結(jié)果進(jìn)行分析，注射接種法中表現(xiàn)為抗 104和 105CFU/mL 病原菌的植株有 24 株，針刺接種法中表現(xiàn)為抗 108CFU/mL 病原菌的植株有 11 株；其中，有6株檸檬自交后代在兩種鑒定方法中均被認(rèn)定為抗病株，這6株的抗病性屬于比較穩(wěn)定的。因此，綜合兩種鑒定方法，114 株檸檬自交后代對(duì)潰瘍病表現(xiàn)出不同程度的抗性，共有29株自交后代對(duì)潰瘍病表現(xiàn)出抗 104CFU/mL 病原菌。

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（責(zé)任編輯：成 平）

Vitro Identification of Lemon Self-crossed Seedlings for the Resistance to Citrus Canker Disease

TAN Li-mei1,2，LIU Hui1，ZHU Zhi-mei1,2，ZHOU Dong1，TANG Tian1，DENG Zi-niu1,2，
（1. Horticulture and Landscape College, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, PRC; 2. National Center for Citrus Improvement, Changsha 410128, PRC）

For identifying lemon auto-seedling’s resistance to citrus canker, taking fresh lemon leaves as materials, susceptible Bingtang orange and the resistant citron C-05 as contrast, the resistance of 114 lemon self-crossed-seedlings were identified in vitro leaves, by injecting and needle puncturing different concentration of citrus canker. The results showed that there are differences on the resistance to citrus canker between the individual of lemon selfed progenies, 24 of them are resistant to 104and 105CFU/mL citrus canker by injection and 11 of them are resistant to 108CFU/mL citrus canker by needle puncture. Meanwhile, 6 of them are resistant to citrus canker by two methods. In conclusion, 114 lemon auto-seedlings performed variously faced citrus canker, and 29 of them are resistant to 104CFU/mL citrus canker.

bacterial canker disease; lemon self-crossed-seedlings; vitro inoculation; resistance evaluation

S666.5

A

1006-060X（2017）03-0058-05

DOI:10.16498/j.cnki.hnnykx.2017.003.017

2016-12-14

國家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目 [（G）SCX1506]

譚李梅（1993-），女，湖南資興市人，碩士研究生，研究方向：果樹遺傳育種與生物技術(shù)。

并列第一作者：劉 慧

鄧子牛