王繼勇，楊子陸，陳加立，江英杰

(武漢理工大學(xué) 化學(xué)化工與生命科學(xué)學(xué)院，武漢 430070)

一株產(chǎn)脲酶菌株的分離及其固化土壤中Cd2+的研究

王繼勇，楊子陸，陳加立，江英杰

(武漢理工大學(xué) 化學(xué)化工與生命科學(xué)學(xué)院，武漢 430070)

指出了微生物誘導(dǎo)碳酸鹽成礦(MICP)技術(shù)可有效修復(fù)鎘污染土壤.從土壤中分離出了一株高效產(chǎn)脲酶菌株，該菌株對10 mg Cd2+/kg模擬污染土壤的Cd2+固化率為67.7 %.X射線衍射(XRD)、能譜分析(EDS)、掃描電子顯微鏡(SEM) 和紅外光譜(IR)等分析顯示：產(chǎn)物為碳酸鎘和碳酸鈣，碳酸鹽結(jié)晶方式為晶格摻雜.

碳酸鹽礦化菌株；碳酸鎘

1 材料及方法

1.1 儀器和試劑

SM-IT300型掃描電子顯微鏡(日本電子株式會(huì)社)，Nicolet6-700型傅里葉變換紅外光譜儀(美國Thermo)，MD3X射線能譜儀(上海沃埃得)，A360型紫外-可見分光光度計(jì)(上海翱藝儀器)，PH10S-E筆式酸度計(jì)(上海精密儀器儀表)，GGX-100火焰原子吸收分光光度計(jì)(北京海光儀器).

將1 mg干燥樣品與100 mg KBr(光譜純)磨細(xì)混勻，壓制成片檢測.CdCl2·2.5H2O、KH2PO4、NaCl、苯酚紅(酚紅)、無水乙醇、蛋白胨、葡萄糖、尿素均為AR級，蛋白胨和酵母浸出粉BR級，試劑均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司.

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

采集武漢理工大學(xué)花木種植園深度5～20 cm處的土壤樣本，富集培養(yǎng)后從富集液中分離具有產(chǎn)脲酶能力的菌株，培養(yǎng)24 h后檢測菌濃度(OD600)和氨氮含量，選取產(chǎn)脲酶能力最強(qiáng)的菌株.

使用產(chǎn)脲酶菌株篩選分離培養(yǎng)基、生長培養(yǎng)基和LB培養(yǎng)基(配方略).取土壤試樣5 kg，去除大顆粒雜質(zhì)后自然風(fēng)干，向風(fēng)干后土壤中加入適量0.5 mo1/L的CdCl2溶液，使土壤中鎘含量為10 mg/kg.

1.3 菌株培養(yǎng)與檢測

將產(chǎn)脲酶菌株生長培養(yǎng)基在121℃滅菌30 min，從保存產(chǎn)脲酶菌株的LB斜面上挑取部分菌苔，接種到滅菌后的150 mL培養(yǎng)液中，置于150 r/min、37℃的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)72 h，測量培養(yǎng)液的OD600和pH值，采用二甲氨基苯甲醛顯色分光光度法檢測培養(yǎng)液中尿素含量[9].菌株產(chǎn)脲酶能力以培養(yǎng)液中氨氮含量計(jì)，氨氮含量檢測選用苯酚鈉-次氯酸鈉比色法[10,11].

稱取1 g土壤，加入10 mL去離子水，攪拌均勻后放置5 min，檢測浸提液的pH值.參照王瑞興等[12]的實(shí)驗(yàn)方法檢測土壤中Cd2+含量.

1.4 細(xì)菌誘導(dǎo)土壤中Cd2+礦化

在5 kg鎘含量為10 mg/kg的模擬污染土壤中，每天加入100 mL 5 mo1/L尿素溶液和100 mL 培養(yǎng)48 h的菌液，每12 h檢測1次土壤pH值和Cd2+含量，直至土壤的pH值穩(wěn)定.選取實(shí)驗(yàn)土壤中板結(jié)土壤顆粒于60℃干燥2 h后備用.

1.5 土壤中礦化產(chǎn)物的分析

使用SEM、XRD、IR、EDS等技術(shù)分析土壤中礦化產(chǎn)物.

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)脲酶菌株的生長特性及產(chǎn)酶活性

圖1 菌株UR-2的生長曲線及培養(yǎng)中各參數(shù)變化Fig.1 Growth curve and various parameter changes of UR-2 strain during cultivation

2.2 產(chǎn)脲酶菌株礦化土壤中Cd2+進(jìn)程

實(shí)驗(yàn)土壤pH值和Cd2+含量的變化見圖2.1 d后細(xì)菌適應(yīng)土壤環(huán)境并大量繁殖，開始水解尿素，土壤pH值在5 d 內(nèi)迅速從7.02增至8.35，隨著營養(yǎng)物質(zhì)的消耗，土壤pH值穩(wěn)定在約8.61(圖2a).土壤中Cd2+含量隨土壤pH值上升逐漸減小.0～1 d內(nèi)Cd2+含量基本無變化；1～5 d內(nèi)，由于尿素的快速水解和土壤pH值升高，Cd2+含量迅速下降并穩(wěn)定在3.23 mg/kg；10 d后Cd2+固化率為67.7%，說明UR-2對土壤Cd2+具有較強(qiáng)的固化能力(圖2b).許燕波等[8]的碳酸鹽礦化菌對污染土壤Cd去除率為51%，修復(fù)周期為7 d；王瑞興等[12]的碳酸鹽礦化菌A對土壤Cd去除率為75.5 %，修復(fù)周期為10 d；故菌株UR-2在鎘污染土壤治理中具有一定潛能.

圖2 菌株UR-2固化進(jìn)程中土壤pH及其Cd2+含量變化Fig.2 Content changes of Cd2+ ion and pH changes during soil curing process by urease-producing bacteria UR-2

2.3 礦化產(chǎn)物XRD分析

2θ/(°)1) CdCO3;2) CdCO3/CaCO3;3) CaCO3

2.4 礦化產(chǎn)物SEM分析

a)×50,000倍礦化產(chǎn)物;b)×200,000礦化產(chǎn)物

2.5 礦化產(chǎn)物IR分析

礦化產(chǎn)物的紅外光譜分析(IR)譜圖見圖5.圖5中1639 cm-1處和1034 cm-1處分別為蛋白酰胺I帶和II帶的CO基振動(dòng)吸收峰，證明細(xì)菌細(xì)胞壁通過CO基團(tuán)吸附了Cd2+、Ca2+.797 cm-1處出現(xiàn)的雙峰吸收峰為Si—O—Si的振動(dòng)，是土壤石英的特征峰；537 cm-1處的吸收峰為Si—O—Al、Si—O—Mg的彎曲振動(dòng)[13]，顯示細(xì)菌吸附在了土壤顆粒中的SiO2上.721 cm-1處吸收峰為Cd—O和Ca—O振動(dòng)疊加，兩處為礦化產(chǎn)物的特征峰，1395 cm-1、860 cm-1處吸收峰為CaCO3和CdCO3晶體中C—O基團(tuán)的彎曲振動(dòng)，兩處吸收峰明顯，說明礦化產(chǎn)物中碳酸鹽含量較多，與XRD譜圖結(jié)果一致.

σ/cm-1

2.6 礦化產(chǎn)物EDS分析

分析圖4a細(xì)菌周圍礦化產(chǎn)物的EDS譜圖見圖6.由圖6可見，礦化產(chǎn)物中含有Cd、Ca、Al、Si、Fe、K等金屬元素.實(shí)驗(yàn)土壤為紅棕壤， Ca2+含量較少，F(xiàn)e3+含量較高；Fe含量為3.32%(以下均為原子百分比)，Ca為0.62%，驗(yàn)證了實(shí)驗(yàn)土壤的種類.同時(shí)，礦化產(chǎn)物中Ca含量為0.62%，Cd為3.94%，說明Cd含量高于Ca，除了土壤中Cd含量為10 mg/kg外，相比于離子半徑為9.9×10-9cm的Ca2+，離子半徑為9.7×10-7cm 的Cd2+與細(xì)菌的絡(luò)合強(qiáng)度更大，Cd2+在細(xì)菌細(xì)胞壁上的有效結(jié)合位點(diǎn)更多，因而礦化產(chǎn)物中Cd元素含量較高.

圖6 礦化產(chǎn)物的EDS圖譜Fig.6 The EDS patterns of mineralized products

Kumari等[14]提出：在產(chǎn)脲酶微生物作用下，鎘污染土壤過程中的Cd2+與Ca2+一般以晶格摻雜或單一相CdCO3沉積在單一相CdCO3表面的方式形成共沉淀.為確定CdCO3和CaCO3的結(jié)晶方式，使用X射線能譜儀元素分布(EDS-mapping)對礦化產(chǎn)物進(jìn)行分析，結(jié)果見圖7.由圖7可見，礦化產(chǎn)物中Cd、Ca元素互相摻雜，Cd2+與Ca2+以晶格摻雜的方式形成了共沉淀，由于CdCO3和CaCO3的結(jié)晶均以細(xì)菌細(xì)胞壁上的Cd2+、Ca2+吸附位點(diǎn)展開，但細(xì)菌對兩種金屬陽離子的吸附無選擇性，導(dǎo)致Cd2+、Ca2+的結(jié)晶位點(diǎn)相鄰、相對甚至重疊，形成的CdCO3和CaCO3晶體互相摻雜.

a) 電子圖像；b) EDS分層圖像；c) Ca Kα1；d) Cd Lα1

3 結(jié)論

(1)從湖北省紅棕壤中分離出一株高效產(chǎn)脲酶菌株UR-2，生長周期為64 h.該菌株生長過程中分泌的脲酶，對尿素水解率為95.4%，培養(yǎng)液pH達(dá)9.15.

(2)投加菌株UR-2可有效提高土壤pH，Cd2+的固化去除率為67.7%，該菌株在鎘污染土壤治理中具有一定的潛能.

(3)礦化產(chǎn)物主要為CdCO3和CaCO3，分布在細(xì)菌周圍，CdCO3和CaCO3為粒徑不均勻的橢球形顆粒，細(xì)菌細(xì)胞壁部分基團(tuán)絡(luò)合吸附了Ca2+、Cd2+.

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Isolation of A Urease-producing Bacterium and Its Curing Function of Cd2+in Soil

WangJiyong,YangZilu,ChenJiali,JiangYingjie

(School of Chemistry and Life Science,Wuhan University of Technology, Wuhan 430070)

Microbial induced carbonate mineralization (MICP) is an effective way to repair cadmium polluted soil.A highly efficient urease-producing bacterium was isolated from soil and the curing rate of 10 mg/kg soil Cd2+ion was determined as 67.7%.XRD, EDS, SEM and IR results showed that the sediments were cadmium carbonate and calcium carbonate, which were formed through lattice doping crystallization.

carbonate mineralization bacteria；cadmium carbonate

2016-12-03

王繼勇(1966-)，男，副教授，博士，研究方向：土壤重金屬污染復(fù)，E-mail：wangjiyong66@sina.com

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(46120511)

X131.3;S154.3

A

1672-4321(2017)01-0017-04