曹雪蓮,趙玉星,郭俊霞,張 靜,陳 文

(北京聯(lián)合大學生物化工學院食品科學系,北京 100023)

?；撬岷虵K506對HepG2細胞膽固醇水平的影響

曹雪蓮,趙玉星,郭俊霞,張 靜,陳 文*

(北京聯(lián)合大學生物化工學院食品科學系,北京 100023)

目的:以總膽固醇(Total cholesterol,TC)、游離膽固醇(Free cholesterol,FC)和膽固醇酯(Cholesterol ester,EC)為評價指標,探討?；撬釋K506誘導肝癌細胞HepG2細胞膽固醇水平代謝異常的影響。方法:首先建立損傷模型,加終濃度為1、5和10 μg/mL的FK506,分別在培養(yǎng)24、48 h后測定細胞存活率以及胞內(nèi)TC、FC和EC水平,確定FK506處理的終濃度;在此基礎上,再添加終濃度為0.1、1、10和20 mmol/L的?；撬?分別培養(yǎng)24、48 h,測定細胞內(nèi)TC、FC和EC水平。結(jié)果:培養(yǎng)24、48 h,5和10 μg/mL FK506處理都使細胞TC、FC水平明顯升高(p<0.05),EC水平?jīng)]有明顯變化,但10 μg/mL FK506作用48 h時,細胞存活率顯著下降到70%,因此確定FK506處理的終濃度為5 μg/mL。在FK506(5 μg/mL)預處理 6 h后,0.1、1、10和20 mmol/L的?；撬嶙饔?4、48 h都可顯著降低FK506誘導的細胞TC、FC水平升高(p<0.05),但作用24 h的效果優(yōu)于48 h,以20 mmol/L作用24 h降膽固醇效果最佳。結(jié)論:FK506通過增加FC誘導HepG2細胞膽固醇水平升高,而?；撬嵬ㄟ^降低FC改善了細胞高膽固醇水平。

牛磺酸,FK506,膽固醇,HepG2細胞

?；撬?Taurine)又稱2-氨基乙磺酸,是一種含硫的非蛋白氨基酸,主要存在于哺乳動物的大腦、心肌、肝臟、肌肉、腎臟等組織中,并且具有多種生理功能[1-3]。多年來,大量動物實驗證明?；撬峥梢越档透吣懝檀佳Y大鼠、小鼠、豚鼠的血清膽固醇水平[4-7],臨床實驗也顯示?；撬崮苡行Ы档椭驹刚叩难蹇偰懝檀寂c動脈粥樣指數(shù),從而降低心腦血管疾病的風險[8-9]。

FK506通用名為他克莫司,屬于鈣調(diào)蛋白磷酸酶抑制劑,是器官移植領(lǐng)域廣泛應用的一種免疫抑制劑[10]。臨床應用表明其能延長肝腎移植患者的存活時間,藥效是環(huán)孢素A的10～100倍,但卻有誘發(fā)高脂血癥的副作用[11-12]。有實驗表明,腎移植后患者血脂異常發(fā)生率較普通人群增高60%～80%[13]。有文獻報道FK506可致肝臟損害、糖尿病等多種代謝紊亂[14-15]。而?；撬釓V泛存在于機體的組織器官中,具有護肝降脂作用[16],但目前未見有關(guān)于牛磺酸對FK506引起的膽固醇代謝紊亂影響的報道。

本實驗以HepG2細胞為實驗對象,利用不同濃度的FK506作用于HepG2細胞,探討了FK506對細胞膽固醇水平的影響;并在此基礎上初步探討了?；撬釋K506處理的HepG2細胞膽固醇水平的影響,為開發(fā)具有降膽固醇作用的特殊醫(yī)學用途的食品提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

HepG2細胞 中國協(xié)和醫(yī)科大學基礎醫(yī)學研究所細胞中心;DMEM培養(yǎng)基 美國HyClone公司;胎牛血清(FBS) 美國Gibco公司;膽固醇(純度≥99%)、?；撬?純度>99%)、FK506水合物(純度≥98%)、膽固醇氧化酶、辣根過氧化物酶、膽固醇酯水解酶、水合牛膽酸鈉、4-氨基安替比林、四甲基偶氮噻唑藍(MTT) 美國Sigma公司;二甲基亞砜(DMSO)、二喹啉甲酸(BCA)試劑盒 北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司。

uQuant Bio-Tek酶標儀 美國Bio-Tek公司。

1.2 FK506濃度對HepG2細胞存活率和膽固醇代謝的影響

HepG2細胞于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中,37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)。以2×104～4×104/孔接種于96孔板中,分別加入終濃度為1、5和10 μg/mL的FK506溶液,培養(yǎng)24 h或48 h,棄舊培養(yǎng)液,加入MTT濃度為0.5 mg/mL的DMEM培養(yǎng)基(200 μL/孔),繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄上清液,每孔加入200 μL DMSO,搖床輕微振蕩10 min,紫色結(jié)晶完全溶解后,酶標儀562 nm讀取吸光度值,以正常對照為100%,計算細胞存活率。

以1×105～2×105個/孔接種于六孔板中,分別加入終濃度為1、5和10 μg/mL FK506培養(yǎng)24、48 h,測定細胞膽固醇。

1.3 ?；撬釋K506誘導HepG2細胞膽固醇水平代謝異常的影響

以1×105～2×105個/孔接種于六孔板中,根據(jù)FK506和?；撬釋毎婊盥视绊懙慕Y(jié)果,確定實驗中FK506和?；撬岬臐舛?將細胞分為正常對照組(N)和FK506處理組(FK),在FK506處理6 h后,分別加入0.1、1、10和20 mmol/L?；撬釣榕；撬峤M(T),繼續(xù)培養(yǎng)24 h或48 h,測定細胞內(nèi)膽固醇。

1.4 細胞內(nèi)膽固醇水平測定

細胞每孔加入1 mL正己烷-異丙醇(2∶1,V/V)冰上慢搖60 min以提取細胞內(nèi)脂類物質(zhì);4 ℃、10000 r/min離心10 min,上清液通氮氣40 min除去有機溶劑;以含10% TritonX-100異丙醇130 μL振蕩溶解上述脂類提取物。按照表1配制總膽固醇(Total cholesterol,TC)和游離膽固醇(Free cholesterol,FC)測定工作液。取50 μL脂類提取物,分別加入TC和FC測定工作液,37 ℃水浴30 min,用酶標儀于500 nm波長處測定吸光度[17-18],繪制標準曲線,計算TC、FC含量,膽固醇酯(Cholesterol ester,EC)=TC-FC。

細胞提取脂類物質(zhì)后加入裂解液冰上提取細胞內(nèi)總蛋白,采用BCA試劑盒測定蛋白質(zhì)含量。

膽固醇相對含量(μg/mg·pro)=膽固醇/總蛋白質(zhì)。

表1 膽固醇測定工作液配制成分

1.5 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)以平均值±標準差(X±S)表示,經(jīng)SPSS統(tǒng)計軟件進行ANOVA方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 FK506對HepG2細胞存活率的影響

由圖1可知,處理時間為24 h時,三個劑量FK506組與對照組相比,細胞活力均無顯著性差異(p>0.05)。處理時間為48 h 時,細胞活力與FK506濃度呈負相關(guān)關(guān)系,且10 μg/mL FK506使細胞存活率顯著下降(p<0.05)。以上結(jié)果表明,隨著濃度以及作用時間的增加,FK506對細胞活力的抑制程度增加。

圖1 FK506作用24 h和48 h對HepG2細胞活力的影響Fig.1 Effect of FK506 on the viability of HepG2 cells for 24 h and 48 h注:N正常對照組;FK1、FK5、FK10的終濃度為1、5和10 μg/mL。*:與正常對照組相比,p<0.05，圖2、圖3同。

2.2 FK506對HepG2細胞膽固醇水平的影響

由圖2可知,加入HepG2細胞培養(yǎng)24 h,1 μg/mL FK506對細胞內(nèi)膽固醇(TC、FC和EC)水平無顯著影響(p>0.05);5 μg/mL和10 μg/mL FK506使胞內(nèi)TC水平分別升高了21.6%和25.0%(p<0.05),使胞內(nèi)FC水平分別顯著增加了28.1%和30.6%(p<0.05),但對細胞內(nèi)EC水平均無顯著影響。

圖2 FK506作用24 h對HepG2細胞膽固醇水平的影響Fig.2 Effect of FK506 on intracellular cholesterol levels after 24 h culture

由圖3可知,FK506作用于HepG2細胞48 h,對細胞內(nèi)膽固醇的影響與作用24 h相似。5 μg/mL FK506使胞內(nèi)TC顯著增加21.7%(p<0.05),而10 μg/mL FK506可使胞內(nèi)TC和FC都明顯升高(18.7%和22.2%)(p<0.05)。在1～10 μg/mL范圍內(nèi),FK506對胞內(nèi)EC水平均無顯著影響。

圖3 FK506作用48 h對HepG2細胞膽固醇水平的影響Fig.3 Effect of FK506 on intracellular cholesterol levels after 48 h culture

綜合FK506作用時間和濃度對HepG2細胞存活率影響的考慮,確定后續(xù)實驗中FK506處理終濃度為5 μg/mL。

2.3 牛磺酸對FK506誘導HepG2細胞膽固醇代謝異常的影響

預實驗結(jié)果顯示,?；撬釂为氉饔?8 h,當終濃度達到20 mmol/L時,細胞的存活率約為88%,與對照組無顯著性差異(p>0.05),終濃度達到30 mmol/L時,細胞的存活率顯著降低至70%,故本實驗中將牛磺酸的最大濃度設為20 mmol/L。HepG2細胞加入5 μg/mL FK506預處理后,分別加入不同濃度?；撬?0.1、1、10和20 mmol/L)孵育24 h。由圖4可知,單獨添加5 μg/mL FK506可使細胞內(nèi)TC和FC含量顯著升高(p<0.05)。在此基礎上,?；撬?0.1、1、10和20 mmol/L)可顯著降低細胞TC水平(p<0.05),隨著牛磺酸濃度升高TC下降幅度增大,呈劑量依賴關(guān)系,10和20 mmol/L?；撬崾拱麅?nèi)TC減少達16.7%和22.7%。并且由圖可知牛磺酸主要是降低細胞內(nèi)FC水平,對EC水平無明顯影響。

圖4 ?；撬嶙饔?4 h對FK506誘導的HepG2細胞膽固醇水平的影響Fig.4 Effects of Taurine on abnormal cholesterol metabolism in HepG2 cells induced by tacrolimus for 24 h注:T0.1、1、10、20?；撬岱謩e為0.1、1、10和20 mmol/L。#:與正常對照比較差異顯著，p<0.05;*:與FK506處理組比較差異顯著,p<0.05；圖5同。

由圖5可知,處理時間為48 h時,5μg/mL FK506可使細胞內(nèi)TC顯著升高(p<0.05)。在此基礎上,0.1、1、10和20 mmol/L牛磺酸顯著降低細胞TC水平(p<0.05),降低幅度分別為10.9%、12.5%、12.4%、14.1%,且主要通過減少細胞內(nèi)FC而降低膽固醇水平。

圖5 ?；撬嶙饔?8 h對FK506誘導的HepG2細胞膽固醇水平的影響Fig.5 Effects of Taurine on abnormal cholesterol metabolism in HepG2 cells induced by tacrolimus for 48 h

3 討論

關(guān)于FK506對細胞存活率的影響,Francesca Capone等人[19]研究表明,處理48 h后,0.72 μmol/L FK506對HepG2細胞的致死率達到50%。Navarro-Villarán E等人[20]的體外實驗結(jié)果顯示,100 μmol/L FK506可誘導HepG2細胞凋亡。高金亭等人[21]報道,FK506在24 h內(nèi)對肝癌細胞無明顯作用,但在72 h隨劑量增加,可抑制細胞增殖。本實驗中,處理時間為24 h時,1 μg/mL FK506對細胞存活率無影響,而10 μg/mL使細胞存活率降至82%。當處理時間為48 h,1和5μg/mL FK506使細胞存活率降為89%和81%,10 μg/mL FK506則使細胞存活率下降顯著。提示隨著FK506作用時間和濃度的增加對細胞增殖的抑制明顯增強。

到目前為止,大量體內(nèi)和體外實驗都表明?；撬峋哂薪的懝檀嫉淖饔肹22],但未見有關(guān)于牛磺酸影響FK506引起的細胞膽固醇水平升高的報道。本實驗中,在FK506誘導的高膽固醇實驗模型基礎上,0.1、1、10和20 mmol/L?；撬崽幚?4 h和48 h均可顯著改善細胞TC水平的升高(p<0.05)。同時結(jié)果提示,細胞培養(yǎng)48 h后,?；撬峤的懝檀嫉淖饔门c培養(yǎng)24 h時相比有所減弱,10和20 mmol/L降膽固醇幅度分別從16.7%、22.7%下降到12.4%、14.1%,這可能與FK506作用時間長對細胞毒性增大有關(guān),因為MTT實驗結(jié)果顯示,5 μg/mL FK506處理24 h,細胞相對存活率為94%,而處理48 h,細胞的存活率下降為81%。

膽固醇轉(zhuǎn)化成膽汁酸是機體膽固醇降解的一個重要途徑,是調(diào)節(jié)體內(nèi)膽固醇平衡的重要因素[7]。目前的研究顯示,牛磺酸主要是從提高血液循環(huán)中膽固醇的清除、促進肝臟膽固醇向膽汁酸的生物轉(zhuǎn)化、增加糞便膽汁酸的排出等多方面發(fā)揮降膽固醇的作用[22]。本實驗中初步明確了牛磺酸能夠降低FK506引起的HepG2細胞內(nèi)膽固醇水平的升高,但關(guān)于其發(fā)揮作用的途徑與機制有待于進行深入的研究。

4 結(jié)論

FK506可誘發(fā)HepG2細胞膽固醇代謝紊亂,并且主要是升高FC水平,對EC無顯著影響。而?；撬嵬ㄟ^降低細胞內(nèi)FC改善了細胞高膽固醇水平,以20 mmol/L作用24 h降膽固醇效果最佳。在今后的研究中,應重點探究?；撬岚l(fā)揮降膽固醇作用的分子機制。

[1]Bouckenooghe T,Remacle C,Reusens B. Is taurine a functional nutrient?[J]. Curr Opin Clin Nutr Metab Care,2006,9:728-733.

[2]Huxtable RJ. Physiological actions of taurine[J]. Physiol Rev,1992,72:101-163.

[3]Sturman JA. Taurine in development[J]. Physiol Rev,1993,73:119-147.

[4]Nishimura N,Umeda C,Oda H,et al. The effect of taurine on the cholesterol metabolism in rats fed diets supplemented with cholestyramine or high amounts of bile acid[J]. J Nutr Sci Vitaminol,2003,49:21-26.

[5]Chen W,Matuda K,Nishimura N,et al. The effect of taurine on cholesterol degradation in mice fed a high-cholesterol diet[J]. Life Sci,2004,74:1889-1998.

[6]Murakami S,Kondo Y,Toda Y,et al. Effect of taurine on cholesterol metabolism in hamsters:up-regulation of low density lipoprotein(LDL)receptor by taurine[J]. Life Sci,2002,70:2355-2366.

[7]Zhang M,Bi LF,Fang JH,et al. Beneficial effects of taurine on serum lipids in overweight or obese non-diabetic subjects[J]. Amino Acids,2004,26:267-271.

[8]Murakami S. Taurine and atherosclerosis[J]. Amino Acids,2014,46(1):73-80.

[9]Yamori Y,Taguchi T,Hamada A,et al. Taurine in health and diseases:consistent evidence from experimental and epidemiological studies[J]. J Biomed Sci,2010,17(Suppl 1):S6.

[10]Khanna AK. Mechanism of the combination immunosuppressive effects of rapamycin with either cyclosporine or tacrolimus[J]. Transplantation,2000,70(4):690-694.

[11]石炳毅,王振,鄭慧麗,等.腎移植受者遠期心腦血管疾病危險因素分析[J].中國醫(yī)學科學院學報,2009,31(3):284-287.

[12]Shirali AC,Bia MJ. Management of cardiovascular disease in renal transplant recipients[J].Clin J Am Soc Nephrol，2008,3(2):491-504.

[13]Shaheen FA,Basri N,Mohammed Z,et al. Experience of renal transplantation at the king fahd hospital,jeddah,saudi Arabia[J].Saudi J Kidney Dis Transpl，2005,16(4):562-572.

[14]馬嶸,胡翠華,劉桂芹,等. 多元分析模板圖在監(jiān)測肝移植受者FK506治療窗濃度中的應用[J]. 微循環(huán)學雜志,2010,20(3):41-43.

[15]Mesar I,Kes P,Hudolin T,et al. Rescue therapy with sirolimus in a renal transplant recipient with tacrolimus-induced hepatotoxicity[J]. Ren Fail,2013,35(10):1434-1435.

[16]Chen W,Guo JX,Chang P. The effect of taurine on cholesterol metabolism[J]. Mol Nutr Food Res,2012,56(6):681-690.

[17]Omodeo Salè F,Marchesini S,Fishman PH,et al. A sensitive enzymatic assay for determination of cholesterol in lipid extracts[J].Analytical Biochemistry,1984,142(2):347-350.

[18]陳昱楊. 炎癥干擾細胞內(nèi)膽固醇外排導致肝臟脂質(zhì)異常積聚的分子機制[D]. 重慶:重慶醫(yī)科大學,2011.

[19]Francesca C,Eliana G,Angela S. Synergistic Antitumor Effect of Doxorubicin and Tacrolimus(FK506)on Hepatocellular Carcinoma Cell Lines[J]. Scientific World Journal，2014,2014：ID450390.

[20]Navarro-Villarán E,Tinoco J,Jiménez G. Differential Antitumoral Properties and Renal-Associated Tissue Damage Induced by tacrolimus and Mammalian Target of Rapamycin Inhibitors in Hepatocarcinoma:InVitroandInVivoStudies[J]. PLoS One，2016,11(8):e0160979.

[20]Navarro-Villarán E,Tinoco J,Jiménez G. Differential Antitumoral Properties and Renal-Associated Tissue Damage Induced by Tacrolimus and Mammalian Target of Rapamycin Inhibitors in Hepatocarcinoma:InVitroandInVivoStudies[J]. PLoS One. 2016,11(8):e0160979.

[21]高金亭. 環(huán)孢素A或他克莫司聯(lián)合表阿霉素對肝癌細胞增殖凋亡的影響[D].杭州:浙江大學,2006.

[22]張珊,郭俊霞,陳文.?；撬嵊绊懩懝檀即x的研究進展[J].食品安全質(zhì)量檢測學報,2014,5(7):1986-1989.

Effect of Taurine and FK506 on cholesterol levels in HepG2 cells

CAO Xue-lian,ZHAO Yu-xing,GUO Jun-xia,ZHANG Jing,CHEN Wen*

(College of Biochemical Engineering,Beijing Union University,Beijing 100023,China)

Objective:The aim of present study was to investigate the effects of Taurine on abnormal cholesterol metabolism in HepG2 cells induced by tacrolimus with total cholesterol(TC),free cholesterol(FC)and cholesterol ester(EC)as the evaluation indexes. Methods:Cell survival rate and the levels of intracellular TC,FC,EC were detected after the cells were cultured for 24 and 48 h in DMEM supplemented with FK506 at final concentrations of 1,5,10 μg/mL,respectively. The concentration of FK506 was determined which was used to test cholesterol lowering effect of Taurine. Then,Taurine was added to the DMEM with final concentration of 0.1,1,10 and 20 mmol/L after the cells were cultured with FK506 for 6 h and the levels of intracellular TC,FC and EC were detected after the further incubation for 24 and 48 h. Results:The levels of intracellular TC and FC but not EC were significantly increased after the cells were cultured in the presence of 5 and 10 μg/mL FK506 for 24 h and 48 h(p<0.05),but 10 μg/mL FK506 for 48 h resulted in cell survival rate decreased to 70% significantly. Therefore,5 μg/mL FK506 was selected as the treatment dose in the following experiments. With the FK506(5 μg/mL)pretreatment for 6 h,Taurine(0.1,1,10 and 20 mmol/L)supplementation for 24 and 48 h could significantly reduced the evaluated TC,FC levels in cells induced by the FK506(p<0.05),and showing a superior effect at 24 h than at 48 h. 20 mmol/L Taurine showed the best cholesterol lowing effect after 24 h treatment.Conclusion:FK506 increased the cholesterol level of HepG2 cells by increasing FC,while Taurine reduced the high cholesterol level of cells by decreasing FC.

Taurine;FK506;cholesterol;HepG2 cells

2016-09-02

曹雪蓮(1990-),女,碩士研究生,研究方向:食品營養(yǎng)與功能,E-mail:594892979@qq.com。

*通訊作者:陳文(1966-),女,博士,教授,研究方向:食品營養(yǎng)與功能,E-mail:wlchenwen@buu.edu.cn。

北京市教委科技計劃面上項目(KM201511417014)；北京市自然科學基金資助項目(5142004)。。

TS201.4

A

1002-0306(2017)06-0350-04

10.13386/j.issn1002-0306.2017.06.058