錢 江,梁金強(qiáng),邱玉文,王園園,付新錄,宋 瑩,林 約,黃芝瑛,*

(1.中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,廣東廣州 510006;2.無(wú)限極(中國(guó))有限公司,廣東江門 510065)

黃芪和麥冬復(fù)合多糖對(duì)TNBS誘導(dǎo)結(jié)腸炎大鼠的改善作用研究

錢 江1,梁金強(qiáng)1,邱玉文1,王園園2,付新錄1,宋 瑩1,林 約1,黃芝瑛1,*

(1.中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,廣東廣州 510006;2.無(wú)限極(中國(guó))有限公司,廣東江門 510065)

目的:探討黃芪和麥冬復(fù)合多糖對(duì)TNBS(三硝基苯磺酸)誘導(dǎo)的大鼠潰瘍性結(jié)腸炎的改善作用及其可能機(jī)制。方法:將40只SPF級(jí)SD大鼠按體重隨機(jī)分為四組,分別為空白對(duì)照組、TNBS模型組、柳氮磺吡啶對(duì)照組、黃芪和麥冬復(fù)合多糖組?？瞻讓?duì)照組不造模,其余三組用TNBS溶液灌腸制作潰瘍性結(jié)腸炎模型后,空白對(duì)照組給予0.9%氯化鈉溶液,柳氮磺吡啶對(duì)照組給予柳氮磺吡啶混懸液(150 mg/kg),黃芩和麥冬復(fù)方多糖組給予復(fù)合多糖(300 mg/kg),連續(xù)給藥14 d。給藥后評(píng)估大鼠體重增長(zhǎng)情況、大鼠疾病活動(dòng)指數(shù)(DAI);計(jì)算脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù),觀察結(jié)腸大體和組織學(xué)損傷情況;測(cè)定血清細(xì)胞因子TNF-α、IL-2、IL-6、IL-10含量。結(jié)果:與空白對(duì)照組比較,TNBS模型組動(dòng)物體重、胸腺重量均明顯減少(p<0.05),DAI、脾臟重量、結(jié)腸大體和組織學(xué)損傷評(píng)分均顯著升高(p<0.05),血清TNF-α、IL-2、IL-6水平明顯升高(p<0.05),IL-10水平明顯下降(p<0.05)。與TNBS模型組比較,柳氮磺吡啶對(duì)照組、黃芩和麥冬復(fù)合多糖治療組體重、胸腺重量均明顯增加,DAI、脾臟重量、結(jié)腸大體和組織學(xué)損傷評(píng)分均顯著降低,血清TNF-α、IL-2、IL-6水平明顯下降(p<0.05),IL-10水平明顯升高(p<0.05)。結(jié)論:黃芪與麥冬復(fù)合多糖對(duì)TNBS誘導(dǎo)的大鼠結(jié)腸炎具有一定的改善作用,這可能與抑制促炎性因子(TNF-α、IL-2、IL-6)和刺激抗炎性因子(IL-10)的釋放有關(guān)。

黃芪和麥冬復(fù)合多糖,結(jié)腸炎,TNBS

潰瘍性結(jié)腸炎(UC)是一種常見(jiàn)的慢性腸道疾病,其病因不明、反復(fù)發(fā)作、病程遷延難愈[1]。主要臨床表現(xiàn)為腹痛、腹瀉、黏液膿血便、里急后重等,國(guó)內(nèi)外流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示,潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病率呈現(xiàn)明顯的增高趨勢(shì),被世界衛(wèi)生組織列為現(xiàn)代難治病之一[2]。臨床治療潰瘍性結(jié)腸炎多以氨基水楊酸類藥物、腎上腺糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑等為主,但因其副作用較多,患者依從性較差,限制了此類治療方法的長(zhǎng)期使用[3]。黃芪和麥冬作為我國(guó)傳統(tǒng)中藥之一,自古以來(lái)藥食兼用,其治療和保健作用已被我國(guó)兩千多年的臨床經(jīng)驗(yàn)所證實(shí)[4]。作為黃芪和麥冬的主要有效成分之一,黃芪多糖和麥冬多糖增加機(jī)體免疫功能、抗炎、抗病毒、抗衰老等諸多作用已得到證實(shí)[5],而其對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎是否具有治療作用尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。三硝基苯磺酸(TNBS)誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎癥狀和組織學(xué)改變與人類UC類似,是評(píng)估藥物對(duì)UC的治療作用的經(jīng)典模型。因此本實(shí)驗(yàn)將黃芪多糖和麥冬多糖按一定比例組合制成復(fù)方多糖,用于三硝基苯磺酸(TNBS)誘導(dǎo)的大鼠潰瘍性結(jié)腸炎的治療,探討其治療作用及其可能機(jī)制。

表1 大鼠疾病活動(dòng)指數(shù)(DAI)

注:“-”表示糞便性狀和糞便隱血無(wú)1分和3分。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黃芪和麥冬復(fù)合多糖 無(wú)限極(中國(guó))有限公司,由黃芪多糖和麥冬多糖混勻而成,多糖含量:96.5%,批號(hào):20150731;柳氮磺吡啶腸溶片 上海福達(dá)制藥有限公司,批號(hào):20141013;SPF級(jí)SD大鼠 6～8周齡,雌雄各半,體重220～250 g,中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,動(dòng)物許可號(hào)SCXK(粵)2011-0029;SPF級(jí)小鼠大鼠維持配合飼料 廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,生產(chǎn)許可證:SCXK(粵)2013-0002;大鼠飼養(yǎng)環(huán)境 中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SYXK(粵)2011-0112];5% TNBS溶液、戊巴比妥鈉 Sigma;便隱血(OB)試劑盒 珠海倍索生物技術(shù)有限公司;Rat TNF CBA Flex Set、RAT IL-2、6、10 CBA Flex Set 美國(guó)BD公司;一次性使用肛門導(dǎo)管 揚(yáng)州市桂龍醫(yī)療器械有限公司。

TP1020脫水機(jī)、EG1160石蠟包埋機(jī)、RM2155切片機(jī)、DM5000B生物熒光顯微鏡 德國(guó)Leica公司;Multiskan Ascent多功能酶標(biāo)儀 美國(guó)Thermo公司;FACSCalibur流式細(xì)胞儀 美國(guó)BD公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組與干預(yù) 動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,40只SD大鼠按體重隨機(jī)分為四組:陰性對(duì)照組、TNBS模型組、柳氮磺吡啶陽(yáng)性對(duì)照組、黃芪和麥冬復(fù)合多糖治療組。分組后,動(dòng)物禁食不禁水24 h,除空白對(duì)照組外,其他組動(dòng)物用3%戊巴比妥鈉尾靜脈注射麻醉(30 mg/kg)。動(dòng)物麻醉后,用一次性肛門插管輕柔插入結(jié)腸約8 cm后注入TNBS造模藥液(30 mg/kg),大鼠提尾倒置60 s讓藥液充分停留結(jié)腸內(nèi)[6]。造模后,空白對(duì)照組灌胃給予0.9%氯化鈉溶液,柳氮磺吡啶對(duì)照組灌胃給予柳氮磺吡啶混懸液,劑量為150 mg/kg,黃芩和麥冬復(fù)合多糖組灌胃給予300 mg/kg復(fù)合多糖,動(dòng)物自由飲水和進(jìn)食,連續(xù)給藥14 d。

1.2.2 動(dòng)物觀察指標(biāo) 每日觀察大鼠的糞便性狀(糞便粘稠度、肛周污穢情況、糞便隱血)、進(jìn)食情況和精神行為狀態(tài)。動(dòng)物每周稱重兩次,按表1進(jìn)行評(píng)分后計(jì)算疾病活動(dòng)指數(shù)(DAI)[7-8],DAI=(體重下降分?jǐn)?shù)+糞便性狀分?jǐn)?shù)+糞便隱血分?jǐn)?shù))/3。

1.2.3 標(biāo)本取材 收集造模前1 d、造模后第3 d、動(dòng)物解剖前糞樣測(cè)定隱血。大鼠給藥結(jié)束后,禁食不禁水12 h,用3%戊巴比妥鈉尾靜脈注射麻醉(30 mg/kg),動(dòng)物麻醉后腹主動(dòng)脈采血5 mL,室溫靜置10 min后以3000 r/min離心,吸出血清后分裝,放置-80 ℃冰箱保存。采血結(jié)束后取胸腺及脾臟,稱重;取出距肛門1～8 cm處結(jié)腸段,肉眼觀察評(píng)分后沿腸系膜緣剪開(kāi)腸腔,將結(jié)腸組織固定于10%福爾馬林,常規(guī)石蠟制片,H-E染色,然后進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下:結(jié)腸輕度充血水腫記1分;結(jié)腸明顯水腫,腸粘膜粗糙呈顆粒狀記2分;結(jié)腸粘膜潰瘍形成,潰瘍最長(zhǎng)徑1 cm記3分;結(jié)腸粘膜潰瘍形成,潰瘍最長(zhǎng)徑介于1～2 cm之間記4分;結(jié)腸粘膜潰瘍形成,潰瘍最長(zhǎng)徑2 cm記5分;結(jié)腸全段的腸壁壞死或動(dòng)物死亡記6分。

1.2.4 血清中細(xì)胞因子水平檢測(cè) 用流式液相多重組蛋白定量技術(shù)測(cè)定血清中TNF-α、IL-2、IL-10等含量,通過(guò)血清與捕獲微球共孵育,FITC標(biāo)記后洗滌,流式細(xì)胞儀檢測(cè)后用CBA分析軟件批量數(shù)據(jù)分析;用ELISA法測(cè)定IL-6。具體步驟按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

表2 黃芪和麥冬復(fù)合多糖對(duì)TNBS誘導(dǎo)的大鼠結(jié)腸炎的治療作用(n=10)

注:*表示與空白對(duì)照組比較,p<0.05;#表示與TNBS模型組比較,p<0.05;表3、表4同。

表3 黃芪和麥冬復(fù)合多糖對(duì)TNBS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎大鼠胸腺和脾臟的影響(n=10)

2 結(jié)果與分析

表4 黃芪和麥冬復(fù)合多糖對(duì)TNBS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎大鼠血清中各細(xì)胞因子含量的影響(n=10,pg/mL)

評(píng)分)均較TNBS模型對(duì)照組顯著改善,表明黃芪和麥冬復(fù)合多糖對(duì)TNBS誘導(dǎo)的大鼠結(jié)腸炎具有明顯治療作用。

動(dòng)物胸腺、脾臟臟器重量及臟器系數(shù)結(jié)果表明,黃芪和麥冬復(fù)合多糖組動(dòng)物脾臟臟器重量及臟器系數(shù)小于TNBS模型組,胸腺臟器重量及臟器系數(shù)大于TNBS模型組。脾臟和胸腺是哺乳動(dòng)物重要的免疫器官,是T淋巴細(xì)胞與B淋巴細(xì)胞聚集的場(chǎng)所。這表明黃芪和麥冬復(fù)合多糖可通過(guò)保護(hù)TNBS造模大鼠的免疫器官,提高動(dòng)物免疫力進(jìn)而達(dá)到改善大鼠潰瘍性結(jié)腸炎的作用。

免疫調(diào)節(jié)的異常在潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病過(guò)程中起核心作用。CD4+/CD8+比例升高,導(dǎo)致免疫調(diào)節(jié)異常(包括T細(xì)胞、細(xì)胞因子及其他細(xì)胞受體異常),進(jìn)一步導(dǎo)致炎癥細(xì)胞和炎癥介質(zhì)異常,從而造成腸黏膜組織損傷[9]。同樣,CD4+、CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞異?；罨部蓪?dǎo)致促炎性細(xì)胞因子如TNF-α、IL-2、IL-6等的持續(xù)釋放,抗炎性因子如IL-4、IL-10、IL-23等的異常降低,引起體內(nèi)免疫反應(yīng)過(guò)強(qiáng)[10]。通過(guò)測(cè)定動(dòng)物血清中TNF-α、IL-2、IL-6、IL-10的含量發(fā)現(xiàn),相比于TNBS模型對(duì)照組,黃芪和麥冬復(fù)合多糖動(dòng)物血清促炎性因子TNF-α、IL-2、IL-6水平降低,抗炎性因子IL-10水平升高。這些研究結(jié)果表明,黃芪和麥冬復(fù)合多糖可通過(guò)降低由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的促炎性因子如TNF-α、IL-2、IL-6水平,從而使得中性粒細(xì)胞無(wú)法向炎癥部位聚集[11];另一方面,黃芪和麥冬復(fù)合多糖可通過(guò)提高T細(xì)胞來(lái)源的抑炎性因子如IL-10水平,進(jìn)而刺激炎性細(xì)胞離開(kāi)病變部位,并引起抗感染免疫應(yīng)答,進(jìn)而達(dá)到治療潰瘍性結(jié)腸炎的作用。

綜上所述,黃芪與麥冬復(fù)合多糖對(duì)TNBS誘導(dǎo)的大鼠結(jié)腸炎具有一定的改善作用,其改善作用的發(fā)

揮可能與抑制促炎性因子和刺激抗炎性因子釋放有關(guān),但其深層機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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2.1 黃芪和麥冬復(fù)合多糖對(duì)TNBS誘導(dǎo)的大鼠結(jié)腸炎的治療作用

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,模型對(duì)照組動(dòng)物死亡3只,其他各組均無(wú)大鼠死亡。動(dòng)物造模后24 h,動(dòng)物出現(xiàn)稀便、肛周污穢嚴(yán)重、精神狀態(tài)不佳、皮毛粗糙、攝食量明顯減少及體重減輕等癥狀。由表2、圖1可知,TNBS模型組動(dòng)物解剖時(shí)可見(jiàn)結(jié)腸腫大,腸壁與腸系膜粘連,病理檢查時(shí)動(dòng)物結(jié)腸損傷處及結(jié)腸正常損傷交接處均可見(jiàn)黏膜缺失,中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)、壞死,嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn),隱窩腺擴(kuò)張;黏膜下層大量纖維組織增生、水腫,中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn);漿膜層增生、水腫、巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)等改變,而空白對(duì)照組動(dòng)物結(jié)腸解剖時(shí)和病理學(xué)檢查均未見(jiàn)病理改變,表明造模成功。黃芪和麥冬復(fù)合多糖和柳氮磺吡啶治療后,動(dòng)物攝食量增加,稀便血便減少,體重與TNBS模型組比較明顯增加,炎細(xì)胞浸潤(rùn)、增生、水腫等炎癥反應(yīng)均明顯減輕,結(jié)腸大體和組織病理學(xué)改變較TNBS模型組明顯減輕,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。

圖1 各組大鼠結(jié)腸組織HE染色圖(200×)Fig.1 HE dyeing figure of colon tissue(200×)注:A:空白對(duì)照組結(jié)腸黏膜層、黏膜下層、漿膜層形態(tài)完整,腺體排列整齊;B:TNBS模型對(duì)照組黏膜缺失,中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)、壞死,大量纖維組織增生；柳氮磺吡啶對(duì)照組(C)和黃芪和麥冬復(fù)合多糖組(D)炎細(xì)胞浸潤(rùn)、增生、水腫等炎癥反應(yīng)減輕。

2.2 黃芪和麥冬復(fù)合多糖對(duì)TNBS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎大鼠的胸腺和脾臟指數(shù)的影響

由表3可知,與空白對(duì)照組比較,TNBS模型組動(dòng)物胸腺臟器重量及胸腺指數(shù)均小于空白對(duì)照組,脾臟重量及脾臟指數(shù)均大于空白對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。相比于TNBS模型組,柳氮磺吡啶對(duì)照組、黃芪和麥冬復(fù)合多糖組動(dòng)物胸腺臟器重量及胸腺指數(shù)均大于模型對(duì)照組,脾臟重量及脾臟指數(shù)均小于模型對(duì)照組。這表明黃芪和麥冬復(fù)合多糖可通過(guò)保護(hù)TNBS造模大鼠的胸腺和脾臟進(jìn)而達(dá)到改善大鼠潰瘍性結(jié)腸炎的作用。

2.3 黃芪和麥冬復(fù)合多糖對(duì)TNBS誘導(dǎo)結(jié)腸炎大鼠血清細(xì)胞因子的影響

由表4可知,與空白對(duì)照組比較,TNBS模型組動(dòng)物血清TNF-α、IL-2、IL-6水平明顯升高,IL-10水平明顯降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05);與TNBS模型組比較,柳氮磺吡啶對(duì)照組、黃芪和麥冬復(fù)合多糖組動(dòng)物血清TNF-α、IL-2、IL-6水平明顯降低,IL-10水平明顯升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。以上結(jié)果表明黃芪和麥冬復(fù)合多糖可通過(guò)調(diào)控大鼠血清中細(xì)胞因子的水平而達(dá)到改善大鼠結(jié)腸炎的目的。

3 討論與結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,黃芪和麥冬復(fù)合多糖口服給藥14 d治療后,動(dòng)物腸炎癥狀和體征均明顯好轉(zhuǎn),各項(xiàng)炎癥指標(biāo)(動(dòng)物體重變化、DAI、結(jié)腸大體和組織學(xué)

The ameliorative effects of astragalus and ophiopogon japonicus polysaccharides on TNBS induced colitis rats

QIAN Jiang1,LIANG Jin-qiang1,QIU Yu-wen1,WANG Yuan-yuan2,FU Xin-lu1,SONG Ying1,LIN Yue1,HUANG Zhi-ying1,*

(1.Laboratory Animal Center of Sun Yat-Sen University,Guangzhou 510006,China;2.Infinitus(China),Jiangmen 510065,China)

Objective:To investigate the ameliorative effect of astragalus and ophiopogon japonicus polysaccharides compound on TNBS(2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid)induced colitis. Methods:Forty SPF sprague-dawley rats were randomly assigned into four groups according to the weight,which were negative control group,TNBS model group,sulphasalazine control group,astragalus and ophiopogon japonicus polysaccharides group. In addition to the blank control group,colitis of rats was induced by rectal instillation of TNBS.When the colitis model on rats was established,blank control group was given intragastrically with 0.9% saline,sulphasalazine control group was given intragastrically with sulfasalazine suspension(150 mg/kg),astragalus and ophiopogon japonicus polysaccharides group was given polysaccharide(300 mg/kg)for 14 days.After 14 days of drug delivery,body weight and disease activity index(DAI)were evaluated,weighing the spleen and thymus organ,conducting the gross and histopathological examination on colon,detecting the serum TNF-α,IL-2,IL-6,IL-10. Results:Compared with the blank control group,body weight,thymus weight of the TNBS model group animals were significantly reduced(p<0.05).DAI,spleen weight,gross anatomy and tissue injury score of colon were significantly increased(p<0.05). TNF-α,IL-2,IL-6 levels of serum were significantly increased(p<0.05),IL-10 levels of serum was significantly decreased(p<0.05).On rats treated with the sulfasalazine,astragalus and ophiopogon japonicus polysaccharides,all the above mentioned indexes were significantly improved(p<0.05). Conclusion:Astragalus and ophiopogon japonicus polysaccharides has therapeutic effect on TNBS induced colitis of rats,and its therapeutic mechanism may be related to suppress the inflammatory cytokines(TNF-a,IL-2,IL-6)release and promote IL-10 release.

astragalus and ophiopogon japonicus polysaccharides;colitis;TNBS

2016-06-13

錢江(1987-)，男，碩士，研究方向：藥物藥理及毒理學(xué)，E-mail:qjmoto@126.com。

*通訊作者:黃芝瑛(1965-)，男，碩士，教授，研究方向：藥物毒理學(xué)，E-mail:hzhiying@mail.sysu.edu.cn。

TS201.1

A

1002-0306(2017)06-0354-04

10.13386/j.issn1002-0306.2017.06.059