伊娟娟,王振宇,*,周麗萍,王 化,李景彤,曲 航

(1.哈爾濱工業(yè)大學化工學院,黑龍江哈爾濱 150090;2.黑龍江省科學院自然與生態(tài)研究所,黑龍江哈爾濱 150040)

紅松松塔多酚對S180荷瘤小鼠抗腫瘤及免疫活性

伊娟娟1,王振宇1,*,周麗萍2,王 化2,李景彤1,曲 航1

(1.哈爾濱工業(yè)大學化工學院,黑龍江哈爾濱 150090;2.黑龍江省科學院自然與生態(tài)研究所,黑龍江哈爾濱 150040)

目的:研究紅松松塔多酚40%乙醇洗脫物PPP-40對S180荷瘤小鼠體內(nèi)抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)作用。方法:首先建立S180 實體瘤模型,連續(xù)灌胃PPP-40為10 d。然后,對小鼠抑瘤率、腫瘤細胞周期、脾臟指數(shù)及脾淋巴細胞增殖能力進行分析。結果:實驗表明PPP-40中劑量(150 mg/kg)能夠顯著抑制腫瘤細胞生長(抑瘤率:48.29%,p<0.01),促進腫瘤細胞周期阻滯在G0/G1和G2/M;且能顯著提高小鼠脾臟指數(shù)(3.29±0.26,p<0.01)及脾淋巴細胞增殖能力(p<0.01)。結論:這些結果表明PPP-40是一種天然抗腫瘤藥劑,對S180荷瘤小鼠具有顯著的抗腫瘤作用(p<0.01),其抗腫瘤機制和腫瘤細胞周期阻斷及小鼠免疫活性的提高有關。

紅松松塔多酚,S180小鼠模型,抗腫瘤,免疫活性

癌癥已經(jīng)成為當下人類健康的巨大威脅,據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計,癌癥的發(fā)病率逐年增加,預計到2025年,每年會產(chǎn)生2000萬的新增癌癥病例[1-3]。因此,尋找惡性腫瘤有效的防治方法迫在眉睫。多酚化合物因天然存在于多種植物中,資源廣泛,生理功能強大,而深受國內(nèi)外學者的廣泛關注。流行病學調(diào)查顯示,膳食多酚的攝入量與癌癥發(fā)病率密切相關[4]。

大量研究證實植物多酚具有很強的抗腫瘤效應,并且對正常細胞不會造成損傷,具有開發(fā)應用前景[5-9]。癌癥的發(fā)生往往與機體免疫能力下降相關,且腫瘤細胞還分泌一些抑制免疫細胞發(fā)揮功能的抑制因子,使免疫細胞處于腫瘤微環(huán)境中,不能發(fā)揮正常免疫反應。研究表明植物多酚類物質(zhì)能夠改善 S180 荷瘤鼠的免疫活性,調(diào)節(jié)小鼠免疫指數(shù)直接降低腫瘤活性,達到抑制腫瘤生長的作用[10]。

紅松(Pinuskoraiensis),亦稱果松、海松,在我國主要分布在長白山和小興安嶺一帶。國外關于松科植物多酚化合物研究最多的是法國海岸松松皮萃取物,商品名稱為碧落芷(Pycnogenol),是國際公認優(yōu)良的營養(yǎng)和功能添加劑。國外還幾乎沒有見到關于紅松松塔活性成分的研究報告。國內(nèi)關于紅松松塔的研究主要集中于松塔多酚化合物提取工藝的優(yōu)化[11]、多酚化合物的純化[12]、體外抗氧化[13]、體外抗腫瘤[14]、體外免疫調(diào)節(jié)[15]及體內(nèi)抗輻射的研究[16]。關于紅松松塔多酚化合物體內(nèi)抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)作用的研究還很少報道,是一個巨大的研究空白區(qū),非常具有研究意義。

因此,本文通過建立S180荷瘤小鼠腫瘤模型,研究紅松松塔多酚提取物對荷瘤小鼠體重、抑瘤率、腫瘤細胞周期、小鼠脾臟指數(shù)及脾淋巴細胞增殖能力等指標的影響，旨在為紅松松塔的綜合利用提供科學依據(jù)及實踐指導。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅松松塔鱗片(PineconesofPinuskoraiensis) 來自伊春林業(yè)局,經(jīng)哈爾濱工業(yè)大學化工學院王振宇教授鑒定;雄性健康昆明小鼠 購自哈爾濱黑龍江中醫(yī)藥大學,體重 22～25 g,動物生產(chǎn)許可證號碼SYXK(黑)2013-012;S180細胞 購自上海中科院細胞庫,細胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中,于37 ℃ 5% CO2條件下培養(yǎng);RPMI 1640培養(yǎng)基 美國Hyclone公司;胎牛血清 杭州四季青生物工程材料有限公司;二甲基亞砜(DMSO) Sigma公司;MTT Amresco公司;紅細胞裂解液 碧云天生物技術研究所。

CJ-25分析天平 上海精天電子儀器廠;CLASS100 CO2恒溫培養(yǎng)箱 Thermo電子公司;HT-2酶標儀 Biocell公司;XSZ-H光學顯微鏡 南京冀飛科技有限公司;FACSCalibur流式細胞儀 美國BD公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 紅松松塔多酚的提取與純化 選取紅松球果鱗片5 kg,50 ℃烘箱干燥12～24 h,每2 h測一下質(zhì)量,質(zhì)量不變，表明到達干燥終點。然后經(jīng)高速萬能粉碎機粉碎(24000 r/min)15 min 后過30目篩子。按料液比1∶20加60%乙醇(V/V)超聲輔助提取1 h,重復2次,合并濾液,4000 r/min下離心10 min,合并上清液后真空旋轉蒸發(fā)儀50 ℃條件下濃縮濾液,定容體積至原體積20%后測定多酚的濃度。

對上述制備的紅松松塔多酚粗提物進行一、二級純化。一級純化采用AB-8大孔樹脂結合響應面法進行純化[12]。二級純化采用D101大孔樹脂結合不同乙醇濃度(20%、40% 及60%)梯度洗脫法進行純化,獲得二級分離物PPP-40,其純度為57.25%,主要組成為兒茶素和花旗松素[14]。

1.2.2 荷瘤小鼠模型的建立 無菌條件下,將培養(yǎng)狀態(tài)良好的S180腫瘤細胞收集并使用生理鹽水最終調(diào)整細胞濃度為5.0×106cells/mL,選取健康昆明小鼠無菌環(huán)境下快速接種上述S180細胞懸液0.2 mL。飼養(yǎng)7 d后,無菌條件下提取S180荷瘤小鼠的腹水,調(diào)整腹水濃度,無菌環(huán)境下注射于健康小鼠腹腔內(nèi),繼續(xù)飼養(yǎng)一周,腹水傳代3～4次后建模。

1.2.3 實驗分組及灌胃方法 將實驗小鼠分為5組,每組12只,分別為空白組、模型組和PPP-40低、中、高劑量處理組。模型組和空白組給予和給藥處理組相同量的生理鹽水,對照組腹腔注射環(huán)磷酰胺(20 mg/kg·d),PPP-40低、中、高劑量組灌胃劑量分別為50、150和300 mg/kg·d,連續(xù)給藥10 d,于第11 d處死取血及脾臟。

1.2.4 荷瘤鼠脾臟指數(shù)的測定 小鼠處死后,取其相應脾臟,生理鹽水沖洗,濾紙除去水后,于分析天平中快速稱得脾臟質(zhì)量,記錄數(shù)據(jù),并按下列公式計算脾臟指數(shù):

式(1)

式中:I-脾臟指數(shù),m-脾臟質(zhì)量(mg),M-鼠體質(zhì)量(g)。

1.2.5 PPP-40對S180實體瘤的抑制率 小鼠腫瘤組織瘤體質(zhì)量稱量后,計算抑瘤率S:

S(%)=(A0-A1)/A0×100

式(2)

式中：S-抑瘤率(%),A0-模型組瘤體質(zhì)量(g),A1-給藥組瘤體質(zhì)量(g)。

1.2.6 S180小鼠腫瘤細胞周期及DNA含量分析方法 細胞周期通常為細胞分裂產(chǎn)生新細胞的生長開始到下一次細胞分裂形成子細胞結束為止所經(jīng)歷的過程。主要包括DNA合成前期(G0/G1期)、DNA合成期(S期)和DNA合成后期(G2期)與DNA分裂期(M期)四個階段。正常的細胞都要經(jīng)歷這四個階段,周期循環(huán)是細胞正常生長和分化的必要保證。植物多酚抗腫瘤效應與其對腫瘤細胞周期干擾阻斷有著密切的關系。故本實驗采用流式細胞儀對小鼠腫瘤細胞周期及DNA含量進行考察。具體操作如下:將處死的小鼠快速剝離腫瘤組織后,瘤體立即在低溫無菌環(huán)境下進行處理,收集各組腫瘤組織中腫瘤細胞于無菌的比色管中,調(diào)整細胞到適宜濃度,70%無水乙醇4 ℃放置24 h后,加入PI避光染色30 min后檢測腫瘤細胞周期分布及DNA含量[17]。

1.2.7 S180小鼠脾淋巴細胞增殖能力測定 將用于脾淋巴細胞增殖實驗的小鼠處死后75%乙醇滅菌,用剪刀在無菌潔凈的環(huán)境下小心的取出小鼠的完整脾臟,用冰PBS漂洗去除血液及結締組織后,于滅過菌的200目篩網(wǎng)上剪碎成小塊后研磨,PBS沖洗篩網(wǎng)過濾下的液體于試管中,1000 r/min離心5～10 min加紅細胞裂解液,3～5 min 后,離心沉淀用PBS反復洗滌2次后,去除上清液,加入培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度呈脾淋巴細胞懸浮液。將收集到的每份脾淋巴細胞調(diào)整到適宜濃度后加入到96孔板中,常規(guī)操作鋪板每孔加入95 μL細胞懸液后,向每孔中加入5 μL濃度為150 μg/mL的ConA溶液,使其每孔內(nèi)終濃度為7.5 μg/mL,培養(yǎng)72 h后,按照MTT后續(xù)步驟于570 nm波長下測得吸光度值[18]。

1.3 統(tǒng)計學分析

實驗中測定結果均進行3次重復,實驗結果均以測定且對實驗數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計分析軟件SPSS(Version 18.0)進行ANOVA單因素方差分析,數(shù)據(jù)以平均值±標準差(X±S)表示,p<0.05有顯著性差異,p<0.01為極顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 PPP-40對S180小鼠外觀特征的影響

如表1所示,接種S180實體瘤細胞次日,小鼠外觀、飲食及活動均正常;給藥第3 d后,模型組小鼠生長狀態(tài)變差,逐漸出現(xiàn)精神萎靡,行動遲緩,毛發(fā)雜亂干澀等現(xiàn)象。不同給藥組的不同劑量對荷瘤小鼠外觀特征及飲食行動影響明顯,其中環(huán)磷酰胺及PPP-40中劑量組作用效果最突出,對小鼠整體改善效果接近正常組。

表3 PPP-40對S180小鼠腫瘤細胞周期的影響

表1 PPP-40對S180小鼠的外觀特征影響

2.2 PPP-40對S180實體瘤生長的抑制作用

根據(jù)瘤重計算PPP-40對其的抑制率如表2所示,結果表明3個劑量的PPP-40對S180實體瘤生長均具有顯著的抑制作用(p<0.05);PPP-40低、中、高處理組對實體瘤的抑制率分別為12.68%、48.29%和32.20%。環(huán)磷酰胺對S180實體瘤的抑制率59.02%,低、中、高劑量的PPP-40對S180實體瘤生長的抑制作用顯著低于環(huán)磷酰胺組(p<0.01)。以上結果表明,PPP-40對S180 實體瘤生長具有很好的抑制作用,進一步揭示了PPP-40在體內(nèi)具有顯著的抗腫瘤作用。

表2 PPP-40對S180實體瘤生長的抑制作用

注:*與模型組比較,p<0.05;**與模型組比較,p<0.01;#與陽性對照組比較,p<0.05;##與陽性對照組比較,p<0.01;表3、表4同。

2.3 PPP-40對S180小鼠腫瘤細胞周期分布的影響

由表3可知,模型組腫瘤組織中G0/G1期和S期細胞的比例分別為44.23%和53.79%。與模型組比較,環(huán)磷酰胺組S期腫瘤細胞顯著減少(p<0.01),大部分細胞處于G0/G1期(73.21%)。而PPP-40中劑量組顯著的影響了腫瘤細胞在G0/G1期的變化,相繼影響了S期到G2/M期的轉變,使腫瘤細胞更多的從S期轉變到G2/M期,細胞阻滯在G2/M期的比例增多;其細胞在G0/G1期、S期和G2/M期各周期所占的比例分別為56.97%、3.59%和39.44%。

實驗結果證明陽性對照環(huán)磷酰胺組能夠顯著誘導S180荷瘤小鼠腫瘤細胞停滯在G0/G1期,從而抑制腫瘤細胞DNA復制、轉錄和蛋白質(zhì)的合成,促進腫瘤細胞的凋亡。PPP-40高、低劑量組與模型組相比,各周期的細胞數(shù)量差異不顯著,而PPP-40中劑量組與模型組相比,使S期的細胞更多的進入到G2/M期,阻滯在G2期。研究表明,芒果苷可以時間和劑量依賴地抑制人骨髓性白血病細胞的增長,明顯改變蛋白激酶和細胞周期相關因子表達水平,是通過ATR-Chk1通路使腫瘤細胞停滯在G2/M期發(fā)揮抗白血病作用[19]。也有文獻報道肉桂的水提多酚混合物具有抗腫瘤活性,它們也是通過阻斷腫瘤細胞G2-M期而發(fā)揮抗腫瘤作用的[20]。

2.4 PPP-40對S180小鼠腫瘤細胞DNA含量的影響

用流式細胞儀檢測技術對細胞內(nèi)DNA含量進行檢測,結果如圖1所示。

圖1 PPP-40對S180小鼠腫瘤細胞DNA含量的影響Fig.1 Effect of PPP-40 on contents of tumor cells DNA in S180 mice注:PPP-40-H,PPP-40-M,PPP-40-L分別表示PPP-40高、中、低劑量組;注:##與模型組比較,p<0.01。

灌胃低、中、高劑量PPP-40的荷瘤鼠腫瘤組織DNA含量百分比分別為18.24%、33.97%、20.56%,而陽性對照組腫瘤組織DNA含量為36.50%。表明松多酚二級分離物PPP-40各劑量組均不同程度的對腫瘤細胞起到一定的凋亡促進作用。

2.5 PPP-40對S180小鼠脾臟指數(shù)的影響

由表4可知,與正常組相比,模型組小鼠的脾臟指數(shù)顯著降低(p<0.01),這表明腫瘤的發(fā)生導致脾臟細胞的損傷或凋亡。與模型組相比,PPP-40各劑量處理組對小鼠的脾臟指數(shù)均有顯著升高(p<0.01)。其中,中劑量處理組的改善效果優(yōu)于低、高劑量處理組。而陽性對照環(huán)磷酰胺組與模型組相比沒有顯著差異(p<0.05),其脾臟指數(shù)低于模型組,表明環(huán)磷酰胺沒有起到免疫修復作用,相反起到免疫抑制效果。

表4 PPP-40對S180小鼠脾臟指數(shù)的影響

2.6 PPP-40對S180小鼠脾淋巴細胞增殖的調(diào)節(jié)

由圖2可以看出,與正常組相比,模型小鼠的脾淋巴細胞增殖能力受到明顯的抑制(p<0.01);與模型組相比,PPP-40中劑量處理組促進脾淋巴細胞增殖作用極其顯著(p<0.01),優(yōu)于其它兩個劑量處理組。而陽性對照組環(huán)磷酰胺對脾淋巴細胞增殖與模型組相比沒有顯著差異,表明陽性對照組對荷瘤小鼠脾臟沒有修復作用,這與文獻報道的環(huán)磷酰胺免疫抑制功能相同。這種現(xiàn)象也說明了陽性對照試劑環(huán)磷酰胺對腫瘤的抑制途徑不是通過免疫調(diào)節(jié)通路。

圖2 PPP-40對S180小鼠脾淋巴細胞增殖的影響Fig.2 Effect of PPP-40 on proliferation of splenocytes in S180 mice注:*與正常組比較,p<0.05;**與正常組比較,p<0.01;#與模型組比較,p<0.05;##與模型組比較,##p<0.01。

3 討論與結論

本文在紅松松塔多酚PPP-40體外抗腫瘤研究的基礎上,通過在體內(nèi)建立S180荷瘤小鼠腫瘤模型,對PPP-40體內(nèi)抗腫瘤活性及免疫調(diào)節(jié)活性進行系統(tǒng)研究。通過對S180小鼠體內(nèi)抑瘤率及腫瘤細胞周期、腫瘤細胞DNA含量、脾臟指數(shù)以及脾淋巴細胞增殖等指標綜合分析,結果看出:PPP-40中劑量(150 mg/kg·d)處理組的抑瘤效果最明顯,抑瘤率為48.29%;且腫瘤細胞周期檢測也發(fā)現(xiàn) PPP-40中劑量(150 mg/kg·d)處理組將腫瘤細胞更多地阻滯在G0/G1期及G2/M期,表明松塔多酚PPP-40體內(nèi)抗腫瘤作用可能是通過抑制腫瘤細胞DNA復制、調(diào)節(jié)細胞周期阻滯來實現(xiàn)的。

腫瘤的發(fā)生與轉移與機體免疫系統(tǒng)功能抑制有著直接關系,如腫瘤微環(huán)境的影響使機體不能對腫瘤細胞產(chǎn)生正常的免疫應答而引起腫瘤的發(fā)展和惡化。脾臟是機體最大的外周免疫器官,是衡量機體免疫功能的重要指標。脾淋巴細胞分化的T、B淋巴細胞與機體的細胞免疫及體液免疫關系非常密切[21]。在本研究中PPP-40中劑量(150 mg/kg·d)處理組能夠顯著提高S180荷瘤小鼠的脾臟指數(shù)、脾淋巴細胞增殖能力,從而有效提高S180 荷瘤小鼠的免疫功能。這個結果與左麗麗等人的研究結果相一致[22]。

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Antitumor and immunomodulation activities of polyphenols from pinecone ofPinuskoraiensisin cancer-bearing S180 mice

YI Juan-juan1,WANG Zhen-yu1,*,ZHOU Li-ping2,WANG Hua2,LI Jing-tong1,QU Hang1

(1.School of Chemistry and Chemical Engineering,Harbin Institute of Technology,Harbin 150090,China;2.Institution of Natural Resources and Ecology of Heilongjiang Academy of Sciences,Harbin 150040,China)

Objective:The aim of this study was to investigate the antitumor and immunoregulatory activities of the 40% ethanol eluent of polyphenols from pinecone ofPinuskoraiensis(PPP-40)on S180 mice. Methods:Firstly,S180 solid tumor-bearing mice were given PPP-40 by oral for 10 days. Then,the tumor inhibition rate,cell cycle of tumor cells,spleen index and spleen lymphocytes proliferation ability were analyzed. Results:Pretreatment with PPP-40(150 mg/kg)could significantly inhibit of tumor growth(Inhibition rate:48.29%,p<0.01),promote tumor cells cycle arrest at G0/G1and G2/M,enhance spleen index(3.29±0.26,p<0.01)and accelerated the proliferation of splenocytes(p<0.01). Conclusion:These results suggested that PPP-40 was a natural antitumor agent and possesses strong antitumor effect in S180 mice(p<0.01). The antitumor effect may be related to the arrest of tumor cell cycle and the improvement of immunomodulatory activity.

polyphenols ofPinuskoraiensispinecone;S180 solid tumor;antitumor activity;immunomodulation activity

2016-08-29

伊娟娟(1988-),女,在讀博士,研究方向:天然產(chǎn)物提取與功能分析,E-mail:yijuanjuanmsn@126.com。

*通訊作者:王振宇(1957-),男,教授,主要從事活性成分的分離合成調(diào)控,新資源開發(fā)與利用方面的研究,E-mail:wangzhenyu13001@163.com。

TS201.2

A

1002-0306(2017)06-0345-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.06.057