喬 梁，周 盛，楊 軍，滕華建，蔣 青

石蠟包埋軟骨組織中DNA提取方法的改良

喬 梁1，周 盛1，楊 軍2，滕華建3，蔣 青1

軟骨；石蠟包埋；DNA

隨著基因遺傳學的發(fā)展，DNA檢測技術也日臻完善，而對某些特定疾病的基因分析能為探究疾病的發(fā)病機制以及遺傳概況提供可靠的方法學依據。各大醫(yī)院的病理科均存留著大量的組織蠟塊，從這些石蠟標本中提取DNA可以在短時間內獲得足夠的目標疾病DNA。目前已有多位學者對從石蠟包埋樣本中提取DNA的方法學進行了大量的探索和研究[1]，對于不同組織，提取DNA的難易程度會有很大不同：從細胞數量比較多的肺組織和腸組織中提取DNA已易做到，但對于軟骨組織，這一類密度很低而且細胞數目很少的組織中提取DNA仍存在一定困難。針對這一問題本文現探究從石蠟軟骨組織切片中提取DNA并用于基因檢測的方法。

1 材料與方法

1.1 材料 選取2012年～2015年南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院存檔的軟骨瘤和軟骨肉瘤福爾馬林固定后的石蠟組織包埋塊。軟骨瘤34例，其中男性18例，女性16例，年齡14～72歲，平均43.7歲。軟骨肉瘤31例，其中男性17例，女性14例，年齡22～79歲，平均44.0歲。所有患者均經經驗豐富的病理醫(yī)師明確診斷。標本來自股骨、脛骨、肋骨、骨盆等全身各處軟骨組織。

1.2 方法 對于每塊蠟塊均先切除表面兩層已污染和氧化的部分[2]，然后切取一張2 μm厚切片用于HE染色，最后根據標本的大小切取3～6張10 μm厚切片用于DNA提取。為了精確提取軟骨及軟骨腫瘤的組織，所有樣本的HE切片均經經驗豐富的病理醫(yī)師鏡下畫出軟骨及軟骨腫瘤部分，根據HE切片的畫取部分，選擇性地刮取切片樣本用于提取DNA。

1.3 DNA提取方法和試劑 參考袁亞婷等[3-6]總結的方法，選擇改良TES水浴脫蠟-酚氯仿法作為傳統的提取方法。該方法對肺組織和腸組織均能很好地提取出DNA，然而對于軟骨組織的DNA提取效果不佳，所提出的平均濃度僅有12 ng/μL。濃度太低難以達到后續(xù)的PCR及測序的要求。

本實驗采用Qiagen公司的QIAamp DNA FFPE Tissue Kit試劑盒提取法。方法如下：(1)將固定在載玻片上的切片標本分別浸入二甲苯缸脫蠟20 min，浸入乙醇缸洗二甲苯15 min。(2)將標本刮入EP管內，加入180 μL Buffer ATL和20 μL蛋白酶K，在56 ℃和90 ℃先后孵化1 h。(3)加入200 mL buffer AL和200 mL乙醇，震蕩混勻。(4)將全部的溶液轉移至純化柱內，8 000 r/min離心1 min，丟棄濾液。加入500 mL Buffer AW1，8 000 r/min離心1 min，丟棄濾液。加入500 mL Buffer AW2，8 000 r/min離心1 min，再次丟棄濾液。再次離心，甩干所有液體。(5)把純化柱放入新的EP管內，加入50 μL Buffer ATE。14 000 r/min離心1 min所得即為DNA。

本實驗采用此試劑盒所提取的DNA濃度遠遠高于一些傳統方法提取的濃度，且提取時間也大為縮短。但由于一些組織存放時間太久或者細胞含量太少所提取濃度也偏低，為了提高提取濃度，本文總結了兩種對試劑盒提取改良方法。方法一：在實驗開始的時候對于同一樣本做2份，最后在步驟(4)加入純化柱時把2份同一樣本的濾液合在一個純化柱里離心，可以達到提高濃度的效果。方法二：直接將石蠟樣本切蠟卷放在EP管里，脫蠟再提取DNA。即更改步驟(1)為：加入1 mL二甲苯在裝有樣本的EP管內，蓋上蓋子充分震蕩10 s，14 000 r/min離心2 min，棄上清。加入1 mL乙醇(96%～100%)，充分震蕩10 s，14 000 r/min離心2 min，棄上清。打開EP管蓋，室溫下靜置10 min至乙醇完全揮發(fā)。

2 結果

2.1 提取結果 1例軟骨瘤樣本因經過脫鈣處理后DNA濃度太低無法進行下一步實驗，剩余33例軟骨瘤樣本DNA平均OD260/280=1.848，平均濃度為64.504 ng/μL(圖1)。31例軟骨肉瘤樣本DNA平均OD260/280=1.868，平均濃度為63.644 ng/μL(圖2)。本實驗發(fā)現DNA提取的濃度結果受軟骨石蠟標本的保存時間、標本組織的大小以及軟骨細胞的影響。

圖1 軟骨瘤DNA提取結果分布左下角DNA極低的個例即是脫鈣處理的樣本

圖2 軟骨肉瘤DNA提取結果分布

2.2 PCR測序結果 本次提取的DNA主要用來檢測LKB1基因在這些軟骨瘤及軟骨肉瘤樣本中是否有突變[7-8]。64例樣本均完成基因檢測，但未檢測出任何突變結果(圖3)。

圖3 軟骨組織石蠟標本提取DNA的測序圖截取部分

12例樣本選用常規(guī)試劑盒法提取，平均濃度為35.325 ng/μL，其中8例樣本由于濃度過低無法后續(xù)實驗，再次換用改良的提取方法。對于標本體積較大而腫瘤組織部分較少者選擇改良方法一，刮取2份樣本，最后再放在同一純化柱里離心，共27例，平均濃度82.435 ng/μL。對于樣本體積較小而腫瘤組織比例較大者選擇改良方法二，直接切成蠟卷放入EP管里進行脫蠟提取，共33例，平均濃度為66.815 ng/μL。從濃度上看改良方法一的提取濃度高于改良方法二，但由于兩種方法所選擇的樣本不同，所以并不能認為改良方法一優(yōu)于改良方法二。

3 討論

每個醫(yī)院的病理科均存有大量的石蠟標本，對于基因遺傳學的研究來說這些標本均是極其容易獲取的巨大財富。因此能夠熟練成功地從石蠟標本中提取DNA并用于基因檢測對基因遺傳學的研究十分重要。

但是由于組織的特異性，不同組織的石蠟標本提取DNA的難易程度也有很大不同。從腸或肺組織中提取DNA可以很容易獲取高濃度的DNA。但是對于骨和軟骨這樣的組織成分比較多，細胞成分卻很少的特殊組織，從石蠟包埋的樣本中提取DNA存在著一定難度。有學者總結了從骨組織中提取DNA的方法[9-11]。對于軟骨組織，采用蛋白酶K-Chelex100法用于大塊軟骨組織提取的DNA能得到比較滿意的結果[12-13]，但是用于石蠟包埋軟骨組織中提取DNA難度卻很大。對于新鮮且組織量較大的石蠟包埋軟骨組織，采用QIAamp DNA FFPE Tissue Kit試劑盒能獲取較好的DNA。

對于試劑盒常規(guī)使用仍不能夠提取足夠濃度DNA的情況，作者總結了兩種改良方法。方法一：由于試劑與EP管容積的限制，每次使用樣本數量有限制，為了提高產量，實驗在開始的時候對于同一樣本做2份，即同一標本選擇6～12張切片，平均分在2個EP管內，同時進行前3個步驟。在步驟(4)加入純化柱時再合在一個純化柱里可以達到提高濃度的效果。方法二：直接切3～6張蠟卷放在EP管里脫蠟再提取，這樣既可增加軟骨組織的量又能避免脫蠟引起的損失。該方法也能較好地提高提取DNA的濃度，缺點是無法對照HE切片精確選擇軟骨部分。

不過該試劑盒及改良方法對于脫鈣的軟骨樣本提取仍存在著很大的困難，常用的脫鈣方法主要是強酸脫鈣和EDTA脫鈣兩種。強酸脫鈣效率高但是會嚴重破壞DNA的結構，導致DNA提取結果濃度很低而且碎片化很嚴重，很難用于下一步的PCR和基因測序。EDTA脫鈣一般不會破壞組織的DNA，但是缺點是耗時太長。而病理科為了提高效率基本使用強酸脫鈣，所以病理科脫鈣的樣本往往不能挑選使用。

本實驗第一次探討了能否從石蠟包埋的軟骨組織中提取DNA進行基因檢測以及如何提高DNA的提取濃度。本實驗除1例脫鈣標本由于提取濃度過低DNA片段太小以外，其余的64例樣本均成功提取了DNA并順利地進行了PCR和基因測序。該方法可以為軟骨腫瘤相關基因學研究，快速提取到大量的DNA進行基因檢測提供一些指導意義。

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時間：2017-2-27 10:14

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170227.1015.056.html

國家自然科學基金(81420108021)

1南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院運動醫(yī)學與成人重建外科、2病理科，南京 2100083南京大學模式動物研究所骨與關節(jié)疾病遺傳研究實驗室，南京 210061

喬 梁，男，碩士研究生，醫(yī)師。Tel: (025)83106666-61031，E-mail: smartmedq@163.com 蔣 青，男，博士，主任醫(yī)師，通訊作者。E-mail: jiangqing112@hotmail.com

R-331

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1001-7399(2017)02-0215-03

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.02.025

接受日期：2016-09-18