石 磊, 牛亞慧, 蘭作平, 唐 倩, 曾 雪

(重慶醫(yī)藥高等專科學(xué)校，重慶 401331)

·制藥技術(shù)·

5-(4-氟苯基)-N-1-(3-羥基金剛烷基)-7-三氟甲基吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-酰胺的合成及其抗腫瘤活性

石 磊, 牛亞慧*, 蘭作平, 唐 倩, 曾 雪

(重慶醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，重慶 401331)

以乙氧基甲叉基氰乙酸乙酯和對氟苯乙酮為起始原料，設(shè)計并合成了新化合物5-(4-氟苯基)-N-1-(3-羥基金剛烷基)-7-三氟甲基吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-酰胺(7)，其結(jié)構(gòu)經(jīng)1H NMR， IR和HR-MS(ESI)表征。采用MTT法測定了其對人乳腺癌細(xì)胞(Bcap-37)、人宮頸癌細(xì)胞(HeLa229)、人肝癌細(xì)胞(QGY-7701)和人肺癌細(xì)胞(A549)體外抗腫瘤細(xì)胞的增殖活性。結(jié)果表明：7對受試細(xì)胞的抑制活性較好，其IC50值分別為23.9 μmol·L-1， 29.8 μmol·L-1， 31.4 μmol·L-1和21.7 μmol·L-1。

乙氧基甲叉基氰乙酸乙酯; 對氟苯乙酮; 吡唑并[1,5-a]嘧啶; 金剛烷; 合成; 抗腫瘤活性

吡唑并[1,5-a]嘧啶類化合物具有廣泛的生理和生物活性，據(jù)文獻(xiàn)報道，可用作抗血吸蟲藥、黃嘌呤氧化酶抑制劑和ALS酶合成抑制劑[1-2]，而不同取代基位置、不同活性基團(tuán)取代的吡唑并[1,5-a]嘧啶類化合物已被化學(xué)家關(guān)注已久[3]。大量研究表明，吡唑作為一類結(jié)構(gòu)特殊的氮雜環(huán)

Scheme 1

也具有多種藥理活性[4]，如抗腫瘤[5]、抗菌[6]和抗炎[7]等。近年來，上述兩類化合物受到了研究人員的廣泛關(guān)注和研究[8]。

美金剛胺是一種N-甲基-D-天冬氨酸鹽(NMDA)受體拮抗劑，用于阿爾茨海默病(AD)治療的代表藥物，已被FDA批準(zhǔn)上市，在美國一直用于重度AD及血管性癡呆的治療。已有研究表明，該類藥物還對神經(jīng)組織的腫瘤生長有抑制作用，如神經(jīng)細(xì)胞瘤和神經(jīng)膠質(zhì)瘤[9]。

抗代謝類抗腫瘤藥的設(shè)計與合成方法主要為：對核苷酸堿基部分進(jìn)行化學(xué)修飾或官能團(tuán)轉(zhuǎn)換[10]。以利用拼合原理將金剛烷胺和吡唑并[1,5-a]嘧啶的母核進(jìn)行連接，得到新型化合物，以期能夠具有兩個活性基團(tuán)的共同活性，為后續(xù)藥物開發(fā)提供新型先導(dǎo)化合物做出基礎(chǔ)貢獻(xiàn)，為新藥研究打下堅實基礎(chǔ)。

本文以乙氧基甲叉基氰乙酸乙酯(1)和對氟苯乙酮(3)為起始原料，制得中間體5-氨基-1H-吡唑-4-羧酸乙酯(2)和1-對氟苯基-4,4,4,-三氟丁二酮(4)；在乙酸回流條件下，2與4經(jīng)縮合反應(yīng)制得5-(4-氟苯基)-7-三氟甲基吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羧酸乙酯(5)； 5經(jīng)水解制得5-(4-氟苯基)-7-三氟甲基吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羧酸(6)[11]； 6與3-羥基金剛烷胺經(jīng)縮合反應(yīng)合成了新化合物5-(4-氟苯基)-N-1-(3-羥基金剛烷基)-7-三氟甲基吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-酰胺(7)，其結(jié)構(gòu)經(jīng)1H NMR， IR和HR-MS(ESI)表征。采用MTT法測定了化合物對人乳腺癌細(xì)胞(Bcap-37)、人宮頸癌細(xì)胞(HeLa229)、人肝癌細(xì)胞(QGY-7701)和人肺癌細(xì)胞(A549)體外抗腫瘤細(xì)胞的增殖活性。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

X24型數(shù)字顯微熔點儀；AVANCE-600型核磁共振儀(DMSO-d6為溶劑，TMS為內(nèi)標(biāo)); Spcetrum one型紅外光譜儀(KBr壓片)；MicroTMQ TOF型高分辨質(zhì)譜儀；Sheidon CO2型恒溫培養(yǎng)箱；SW-CJ-1D型超凈工作臺；BIO-RAD型酶標(biāo)儀。

Bcap-37， HeLa229， QGY-7701和A549， ATCC細(xì)胞庫；四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)，上海朝瑞生物科技有限公司；RPMI-1640培養(yǎng)基，北京賽因坦科技有限公司；胰蛋白酶，北京賽因坦科技有限公司；其余所用試劑均為化學(xué)純或分析純。

1.2 合成

(1) 2的合成

在反應(yīng)瓶中依次加入1 68.00 g(0.40 mol)和無水乙醇200 mL，攪拌使其溶解；緩慢滴加水合肼30.00 g(0.60 mol)，滴畢，緩慢升溫至80 ℃，反應(yīng)4 h。減壓蒸除乙醇，剩余物置冰箱靜置過夜，析出淡黃色固體，過濾，濾餅用少量冷乙醇洗滌，干燥得淡黃色固體2 41.68 g，收率66.78%。

(2) 4的合成

在反應(yīng)瓶依次加入甲苯100 mL，無水乙醇16.56 g(0.36 mol)和金屬鈉8.28 g(0.36 mol，切碎)，攪拌下于室溫反應(yīng)1 h(出現(xiàn)白色粉末，且無金屬鈉剩余)；冷卻，加入3 41.40 g(0.30 mol)和三氟乙酸乙酯51.12 g(0.36 mol)，于60 ℃反應(yīng)6 h。減壓蒸除甲苯，用乙酸乙酯(3×30 mL)萃取，萃取液依次用水洗滌、無水硫酸鈉干燥，減壓蒸除乙酸乙酯，置冰箱中靜置過夜，析出白色固體，過濾，干燥得白色固體4 51.245 g，收率73.00%。

(3) 5的合成[12]

在改良的反應(yīng)合成爐中依次加入2 15.50 g(0.10 mol), 4 23.40 g(0.10 mol)和冰乙酸50 mL，攪拌使其溶解；升溫至115 ℃，反應(yīng)2 h。冷卻至室溫，靜置過夜(析出黃綠色針尖狀固體)，過濾，固體用少量冷冰乙酸洗滌，干燥得黃綠色針尖狀固體5 27.05 g，收率76.63%;1H NMRδ： 1.36(t,J=7.2 Hz, 3H, CH3), 4.34(q,J=7.2 Hz, 2H, CH2), 7.45(d,J=8.4 Hz, 2H, PhH), 8.37(s, 1H, 6-H), 8.48(d,J=8.4 Hz, 2H, PhH), 8.75(s, 1H, 2-H)； IRν: 3 480, 3 265, 1 697, 1 634, 1 594, 1 570, 1 466, 1 397, 1 327, 1 198, 1 171, 1 027, 848, 778 cm-1; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C16H11N3O2F4{[M+Na]+}376.785 6, found 376.785 5。

(4) 6的合成

在反應(yīng)爐加入5 20.202 g(57 mmol)和NaOH 5.6 g(140 mmol)的乙醇(80 mL)溶液，攪拌使其溶解；緩慢升溫至65 ℃，反應(yīng)1 h。冷卻至室溫，反應(yīng)液倒入冰水混合物(300 mL)中，用鹽酸調(diào)至pH 2，攪拌15 min(析出乳白色固體)，過濾，濾餅用適量乙腈重結(jié)晶得乳白色固體6 8.748 g，收率47.03%；1H NMRδ：7.26(d,J=8.4 Hz, 2H, PhH)， 8.32(s, 1H, 6-H)， 8.52(d,J=8.4 Hz, 2H, PhH)，8.84(s, 1H, 2-H)， 10.85(s, H, OH)； IRν： 3 435, 1 697, 1 633, 1 595, 1 567, 1 466, 1 398, 1 384, 1 328, 1 256, 1 198, 1 170, 1 158, 938, 846, 778 cm-1; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C14H7N3O2F4{[M+Na]+}348.462 1, found 348.462 2。

(5) 7的合成

在反應(yīng)瓶中依次加入6 1.000 g(3.08 mmol), 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(EDCI)1.182 g(6.18 mmol), 4-二甲氨基吡啶(DMAP)0.385 g(3.08 mmol), 1-羥基苯并三唑(HOBT)0.415 g(3.08 mmol)和3-羥基金剛烷胺0.835 g(5.00 mmol)，封閉，抽真空，通氮氣，反復(fù)三次，氮氣保護(hù)下，依次加入干燥無水THF 10 mL和無水DMF 30 mL，升溫至40 ℃，反應(yīng)1 h。用乙酸乙酯(3×30 mL)萃取，萃取液依次用水洗滌、無水硫酸鈉干燥，減壓蒸除溶劑，殘余物用少量乙酸乙酯/正己烷混合液洗滌,干燥得淡黃色固體7 1.162 g，收率79.47%;1H NMRδ: 1.64(m, 12H, adamantine-CH2), 2.49(s, 2H, adamantine-CH), 4.61(s, 1H, adamantine-OH), 7.48(d,J=8.4 Hz, 2H, PhH), 7.87(s, 1H, 6-H), 8.32(s, 1H, 2-H), 8.39(d,J=8.4 Hz, 2H, PhH), 8.63(s, 1H, NH)； IRν： 3 446, 3 341, 2 924, 2 856, 1 654, 1 600, 1 571, 1 551, 1 515, 1 402, 1 332, 1 286, 835, 774 cm-1； HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C24H22N4O2F4{[M+Na]+}497.283 4, found 497.283 3。

1.3 抗腫瘤活性測定

取選定的處于對數(shù)生長期的腫瘤細(xì)胞株，加入胰酶消化后，用含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基配制為每個細(xì)胞懸液(4 000個/mL)并接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100 μL。置于37 ℃， 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。化合物用DMSO溶解，并且用培養(yǎng)液稀釋成不同濃度(40.00 μmol·L-1, 20.00 μmol·L-1, 10.00 μmol·L-1, 5.00 μmol·L-1, 2.50 μmol·L-1)，在培養(yǎng)板中加入上述溶液作為實驗組。每組都各設(shè)3個平行孔，同時用順鉑作為對照組。相同條件下培養(yǎng)24 h，每孔中加入MTT(5 mg·mL-1MTT的磷酸鹽緩沖液)10 μL，繼續(xù)保溫4 h，吸去各孔內(nèi)上清液，每孔加入DMSO 150 μL。振蕩15 min，使得形成澄清溶液，用酶標(biāo)儀測定波長490 nm處的OD值[13]，實驗重復(fù)3次，用軟件spss21.0計算化合物的IC50值。

2 結(jié)果與討論

2.1 2的合成條件優(yōu)化

為了獲得2的最佳合成條件，對反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，分別考察了反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間對2收率的影響。

(1) 反應(yīng)溫度

1 0.40 mol，其余反應(yīng)條件同1.2(1)，考察反應(yīng)溫度對收率的影響，結(jié)果見表1。由表1可知，隨著反應(yīng)溫度升高，收率逐漸提高，溫度80 ℃，收率為66.78%,繼續(xù)提高反應(yīng)溫度，收率增加的幅度較小，而且雜質(zhì)比較多，粗產(chǎn)物經(jīng)結(jié)晶后所得產(chǎn)物較少，且純度降低。故反應(yīng)溫度為80 ℃較佳。

(2) 反應(yīng)時間

反應(yīng)溫度為80 ℃，其余反應(yīng)條件同2.1(1)，考察反應(yīng)時間對收率的影響，結(jié)果見表2。由表2可知，反應(yīng)初始階段速度較慢，當(dāng)反應(yīng)進(jìn)行到4 h后已基本完成，收率66.78%,繼續(xù)延長反應(yīng)時間，收率略有增加，但反應(yīng)液顏色明顯加深，說明有雜質(zhì)產(chǎn)生；同時增加了反應(yīng)成本，故反應(yīng)時間控制在4 h較適宜。

表1 反應(yīng)溫度對收率的影響

表2 反應(yīng)時間對收率的影響

2.2 7的合成條件優(yōu)化

本文還對7的反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，分別考察了溶劑用量和原料配比[r=n(6)∶n(3-羥基金剛烷胺)]對其收率的影響。

(1) 溶劑用量

在反應(yīng)中，為了降低成本，減少對操作者和環(huán)境的危害，用THF和DMF作為溶劑。保持其他條件相同，考察THF和DMF用量對產(chǎn)品收率的影響，結(jié)果見表3。由表3可以看出，DMF有利于反應(yīng)物的溶解，并且有利于形成溶液，加速反應(yīng)的進(jìn)行，使得反應(yīng)的產(chǎn)率提高，最終確定THF/DMF(V/V=1/3)為反應(yīng)溶劑。

(2)r

進(jìn)一步考察r對收率的影響，結(jié)果見表4。由表4可知，增加3-羥基金剛烷胺的量，有利于收率提高，當(dāng)r達(dá)到1 ∶1.3時，收率最高(79.47%)，繼續(xù)增加3-羥基金剛烷胺用量，收率基本不變，還造成原料浪費，給后續(xù)處理工作帶來麻煩。因此r為1 ∶1.3較佳。

表3 溶劑用量對收率的影響

表4 r對收率的影響

2.3 抗腫瘤活性

化合物的抗腫瘤活性結(jié)果見表5。由表5可見，在體外活性試驗中，目標(biāo)產(chǎn)物7對腫瘤細(xì)胞Bcap-37， HeLa229， QGY-7701和A549均有一定的抑制作用，其IC50值分別為23.9 μmol·L-1， 29.8 μmol·L-1， 31.4 μmol·L-1和21.7 μmol·L-1。相比較之下，中間體5和6的抗腫瘤細(xì)胞生長的活性較低，但是可以作為先導(dǎo)化合物進(jìn)一步研究，開發(fā)出更多的活性化合物。

表5 化合物的抗腫瘤活性

利用經(jīng)過改進(jìn)的合成爐首次合成了結(jié)構(gòu)新穎的化合物5-(4-氟苯基)-N-1-(3-羥基金剛烷基)-7-三氟甲基吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-酰胺。該方法效率較高，產(chǎn)物純度較高，后處理簡單。該方法利用常見的化學(xué)試劑、原料和合成方法，將兩個活性基團(tuán)連接在一起，體外活性實驗中發(fā)現(xiàn)，目標(biāo)產(chǎn)物對腫瘤細(xì)胞的生長抑制活性很好，期望在后期的體內(nèi)活性實驗中，兩個活性單元會在體內(nèi)水解，分別發(fā)揮其藥理作用，為后續(xù)的深入研究提供理論基礎(chǔ)。另外所涉及的兩個中間體化合物也體現(xiàn)出一定的研究價值，因其可以與很多活性基團(tuán)進(jìn)行結(jié)合形成新的化合物，可能展現(xiàn)出較好的生物活性，將作為后期研究的重點。

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告 作 者

為適應(yīng)我國信息化建設(shè)需要,實現(xiàn)科技期刊編輯、出版、發(fā)行工作的電子化,推進(jìn)科技信息交流網(wǎng)絡(luò)化的進(jìn)程,擴大作者學(xué)術(shù)交流渠道,本刊已加入《中國學(xué)術(shù)期刊(光盤版)》和“中國期刊網(wǎng)”。并入網(wǎng)“萬方數(shù)據(jù)——數(shù)字化期刊群”和“書生數(shù)字期刊”。

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《合成化學(xué)》編輯部

Synthesis and Antitumar Activities of 5-(4-Fluorine phenyl)-N-1-(3-hydroxyl-adamantaneyl)- 7-trifluoromethyl-pyrazolo[1,5-a]pyrimidine-3-amide

SHI Lei, NIU Ya-hui*, LAN Zuo-ping, TANG Qian, ZENG Xue

(Chongqing Medical and Pharmaceutical College, Chongqing 401331, China)

The novel compound, 5-(4-fluorine phenyl)-7-trifluoromethyl-pyrazolo[1,5-a]pyrimidine, was designed and synthesized using ethyl (ethoxymethylene)cyanoacetate and 4′-fluoroacetophenone as the starting materials. The sturcture was characterized by1H NMR , IR and HR-MS(ESI). Theinvitroantitumar activities of 7 against human breast cancer cells(Bcap 37), human cervical cancer cells(HeLa229), human liver cancer cells (QGY-7701) and human lung cancer cells(A549) were investigated by MTT method. The results indicated that 7 showed good inhibition activities with IC50of 23.9 μmol·L-1, 29.8 μmol·L-1, 31.4 μmol·L-1and 21.7 μmol·L-1, respectively.

ethyl (ethoxymethylene)cyanoacetate; 4′-fluoroacetophenone; pyrazolo[1,5-a] pyrimidine; adamantane; synthesis; antitumar activity

2016-09-18；

2017-01-18

重慶醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校自然科學(xué)重點項目(ygz2015102)

石磊(1987-)，男，漢族，黑龍江哈爾濱人，碩士，講師，主要從事有機化學(xué)和藥物化學(xué)的研究。 E-mail: 383814843@qq.com

牛亞慧，講師， Tel. 023-61969052, E-mail: 48405489@qq.com

O626.4; R914.5

A

10.15952/j.cnki.cjsc.1005-1511.2017.04.16236