李毓新

脊髓損傷大鼠遠(yuǎn)端神經(jīng)元及骨骼肌變化的實(shí)驗(yàn)研究

李毓新

目的 探討脊髓損傷大鼠遠(yuǎn)端神經(jīng)元及骨骼肌變化情況，以期為臨床上治療提供有效依據(jù)。方法 選取30只大鼠為研究對(duì)象，每組10只，分別為對(duì)照組、 手術(shù)組和脊髓損傷組。對(duì)照組為正常大鼠，手術(shù)組行椎板切除術(shù)，脊髓損傷組行胸10完全脊髓損傷。在制成模型后1周、2周、4周、12周、24周觀察大鼠坐骨神經(jīng)-運(yùn)動(dòng)終板-內(nèi)側(cè)腓腸肌形態(tài)變化情況。結(jié)果 脊髓損傷電鏡下坐骨神經(jīng)術(shù)后12周有髓神經(jīng)纖維髓鞘崩解，崩解髓鞘板層清晰，術(shù)后24周有髓神經(jīng)纖維髓鞘已模糊、碎裂髓鞘增多，薄髓和無(wú)髓神經(jīng)纖維12周后增多；腓腸肌光鏡下術(shù)后12周局部肌細(xì)胞邊界清楚，多數(shù)模糊，肌細(xì)胞核相對(duì)聚集，結(jié)締組織增生明顯；術(shù)后24周肌細(xì)胞融合，細(xì)胞核密集，融合細(xì)胞間見(jiàn)有空隙，結(jié)締組織增生明顯；電鏡下運(yùn)動(dòng)終板術(shù)后12周突觸皺褶和突觸前后膜不可辨，突觸結(jié)構(gòu)紊亂，肌纖維明暗帶清晰，z線不連續(xù)，高倍鏡下突觸皺褶未見(jiàn)，突觸前后膜不可辨，可見(jiàn)類圓形突觸小泡和細(xì)小顆粒，肌板結(jié)構(gòu)清晰。結(jié)論 大鼠脊髓損傷后在損傷平面以下周圍神經(jīng)、運(yùn)動(dòng)終板、骨骼肌在形態(tài)上會(huì)發(fā)生規(guī)律性變化，12周后顯著變化，24周后則毀損性改變。

脊髓損傷；遠(yuǎn)端神經(jīng)元；骨骼肌變化；大鼠

脊髓損傷是臨床上治療較為棘手疾病，治療目的是恢復(fù)損傷平面以下運(yùn)動(dòng)和排泄功能。但這依賴于脊髓傳導(dǎo)性、腦和周圍神經(jīng)肌肉保持良好功能，三者只有統(tǒng)一協(xié)調(diào)才能恢復(fù)滿意。若遠(yuǎn)端神經(jīng)或肌肉不可逆損傷則脊髓傳導(dǎo)恢復(fù)幾乎不可能。有研究稱，切斷胸12脊髓制造完全性截癱動(dòng)物模型，在傷后3周、6周切除下肢全部神經(jīng)干，病理檢查發(fā)現(xiàn)神經(jīng)纖維、髓鞘等無(wú)明顯變化[1]。也有研究認(rèn)為，在大鼠胸10完全脊髓橫斷損傷后，光鏡和電鏡觀察腓總神經(jīng)形態(tài)學(xué)變化，發(fā)現(xiàn)脊髓損傷后腓總神經(jīng)髓鞘和軸索會(huì)出現(xiàn)明顯退變，且退變隨時(shí)間推移而逐漸加重，會(huì)出現(xiàn)軸索發(fā)芽現(xiàn)象[2]。故大鼠完全橫斷脊髓損傷后會(huì)造成損傷平面以下周圍神經(jīng)發(fā)生跨神經(jīng)元變性。本研究觀察脊髓損傷后損傷平面以下神經(jīng)、肌肉、運(yùn)動(dòng)終板在自然病程中形態(tài)學(xué)變化，為脊髓損傷臨床診治提供有效時(shí)間窗。

1 材料與方法

1.1 一般材料 選取30只大鼠，分為對(duì)照組、手術(shù)組和脊髓損傷組，每組10只。近交系，均為雄性，體重(200±10)g，由北京試驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 動(dòng)物模型制備 大鼠術(shù)前禁食12 h，稱體重后采取10%水合氯醛(3～4)mL/kg腹腔內(nèi)注射麻醉，俯臥在手術(shù)臺(tái)上，備皮消毒后以胸10棘突為中心行背側(cè)正中切口，長(zhǎng)約3 cm，緊貼棘突骨面縱向分離椎旁肌肉和軟組織，顯露出胸9～11椎板和棘突，咬除胸9～11棘突和移除胸10椎板，顯露胸10水平脊髓，并用剪刀迅速橫斷胸10脊髓，在脊髓斷端頭側(cè)切除2 mm脊髓組織，移除后在脊髓端置入明膠海綿。逐層縫合，在試驗(yàn)期間人工排尿2～3次每日，直至恢復(fù)正常排尿?yàn)橹?。手術(shù)組則僅行棘突和椎板切除，不損傷脊髓。

1.3 取材 以體積分?jǐn)?shù)10%水合氯醛麻醉后從左心室插管后剪開(kāi)右心耳，灌注生理鹽水沖洗待液體清亮后用40 g/L多聚圈經(jīng)心臟緩慢灌注，結(jié)束后取右側(cè)坐骨神經(jīng)1 cm，腓腸肌肌腹中部神經(jīng)入肌處取0.8 cm肌肉和小腿內(nèi)側(cè)腓腸肌肌腹1 cm，固定12 h后進(jìn)行處理，石蠟打包后將內(nèi)側(cè)腓腸肌標(biāo)本進(jìn)行連續(xù)橫向切片，厚度為10 μm，進(jìn)行蘇木精-伊紅染色，將坐骨神經(jīng)和運(yùn)動(dòng)終板行半薄切片后在光鏡下進(jìn)行定位，超薄切片后行電子染色進(jìn)行透視電鏡觀察。觀察電鏡下坐骨神經(jīng)和內(nèi)側(cè)腓腸肌運(yùn)動(dòng)終板情況，光鏡下觀察內(nèi)側(cè)腓腸肌情況。

2 結(jié) 果

2.1 電鏡下脊髓損傷觀察結(jié)果 對(duì)照組有髓神經(jīng)纖維、無(wú)髓神經(jīng)纖維一直存在，髓鞘外形正常。手術(shù)組有髓神經(jīng)纖維外形正常。脊髓損傷則出現(xiàn)規(guī)律性變化，表現(xiàn)為術(shù)后2周有髓神經(jīng)纖維髓鞘正常，術(shù)后4周有髓神經(jīng)纖維崩解、板層分離，有髓神經(jīng)纖維和無(wú)髓神經(jīng)纖維。術(shù)后12周有髓神經(jīng)纖維崩解增多、碎裂、崩解髓鞘板層清晰，新生神經(jīng)纖維髓鞘細(xì)壁薄，無(wú)髓神經(jīng)纖維增多，術(shù)后12周有髓神經(jīng)纖維髓鞘崩解，崩解髓鞘板層清晰，術(shù)后24周有髓神經(jīng)纖維髓鞘已模糊、碎裂髓鞘增多，薄髓和無(wú)髓神經(jīng)纖維12周后增多。 詳見(jiàn)圖1。

注：A和B為術(shù)后2周表現(xiàn)，C和D為脊髓損傷術(shù)后4周表現(xiàn)，E和F為脊髓損傷后12周變化；G和H為脊髓損傷24周所見(jiàn)。

圖1 電鏡下脊髓損傷觀察結(jié)果

2.2 腓腸肌光鏡下觀察結(jié)果 對(duì)照組細(xì)胞肌束膜和肌內(nèi)膜邊界清楚，肌細(xì)胞核位于肌膜下方。手術(shù)組術(shù)后2周肌細(xì)胞肌束和肌內(nèi)膜邊界清楚，脊髓損傷術(shù)后2周肌細(xì)胞結(jié)細(xì)胞略縮小，術(shù)后4周肌細(xì)胞截面積縮小，局部肌細(xì)胞破壞明顯，術(shù)后12周局部肌細(xì)胞邊界清楚，多數(shù)模糊，肌細(xì)胞核相對(duì)聚集，結(jié)締組織增生明顯；術(shù)后24周肌細(xì)胞融合，細(xì)胞核密集，融合細(xì)胞間見(jiàn)有空隙，結(jié)締組織增生明顯。詳見(jiàn)圖2。

注：A為對(duì)照組肌細(xì)胞，B為手術(shù)組術(shù)后2周肌細(xì)胞，C，D，E，F(xiàn)為脊髓損傷術(shù)后2周、4周、12周、24周肌細(xì)胞截面積和組織變化，脊髓損傷術(shù)后24周肌細(xì)胞融合，細(xì)胞核密集，融合細(xì)胞間間隙不一，結(jié)締組織增生明顯。

圖2 腓腸肌光鏡下觀察結(jié)果

2.3 電鏡下運(yùn)動(dòng)終板觀察結(jié)果 脊髓損傷術(shù)后4周突觸皺褶結(jié)構(gòu)清晰，突觸內(nèi)可見(jiàn)細(xì)顆粒狀物質(zhì)，高倍鏡下觀察可見(jiàn)突觸前后膜清晰，突觸間隙、皺褶清晰，各個(gè)結(jié)構(gòu)內(nèi)見(jiàn)細(xì)小顆粒，術(shù)后12周突觸皺褶和前后膜清晰，突觸內(nèi)可見(jiàn)細(xì)小顆粒，肌纖維明暗可見(jiàn)，z線不連續(xù)。高倍鏡下突觸皺褶清晰，突觸前后膜層次分明，結(jié)構(gòu)內(nèi)可見(jiàn)細(xì)小顆粒，肌板清晰；術(shù)后12周突觸皺褶和突觸前后膜不可辨，突觸結(jié)構(gòu)紊亂，肌纖維明暗帶清晰，z線不連續(xù)，高倍鏡下突觸皺褶未見(jiàn)，突觸前后膜不可辨，可見(jiàn)類圓形突觸小泡和細(xì)小顆粒，肌板結(jié)構(gòu)清晰。詳見(jiàn)圖3。

注：A為術(shù)后4周橫截面(1萬(wàn)倍)，B為術(shù)后4周橫截面(4萬(wàn)倍)，C為術(shù)后12周縱切面(4萬(wàn)倍)，D為術(shù)后12周縱切面(4萬(wàn)倍)，E為術(shù)后12周縱切面(5千倍)，F(xiàn)為術(shù)后12周縱切面(4萬(wàn)倍)，術(shù)后12周突觸皺褶和突觸前后可辨，可見(jiàn)細(xì)小顆粒，肌纖維明、暗帶清晰，z線不連續(xù)，同時(shí)突觸皺褶隱約可見(jiàn)突觸內(nèi)顆粒，突觸前結(jié)構(gòu)紊亂，肌纖維清晰，z線不連續(xù)。

圖3 電鏡下運(yùn)動(dòng)終板觀察結(jié)果

3 討 論

大鼠脊髓橫斷性損傷4周后坐骨神經(jīng)出現(xiàn)有髓神經(jīng)纖維髓鞘退變，且會(huì)隨著時(shí)間推移而變化，12周后髓鞘出現(xiàn)崩解碎解現(xiàn)象，伴隨有新生薄髓和大量無(wú)髓神經(jīng)纖維，24周后最明顯，髓鞘破裂最明顯，髓鞘結(jié)構(gòu)層模糊不清。這和手術(shù)、正常大鼠比較有明顯不同，這可推測(cè)出脊髓損傷后遠(yuǎn)端神經(jīng)元發(fā)出軸突構(gòu)成周圍神經(jīng)發(fā)生退變，且會(huì)隨著時(shí)間進(jìn)行性加重。結(jié)合相關(guān)報(bào)道[3]，是因?yàn)榇嬖诳缟窠?jīng)元變性。脊髓損傷后發(fā)生跨神經(jīng)元變性時(shí)間窗為20周左右。另外，動(dòng)物模型不同如挫傷模型、壓迫模型、缺血損傷模型、橫斷模型，同一實(shí)驗(yàn)動(dòng)物不同脊髓損傷模型對(duì)損傷結(jié)構(gòu)和運(yùn)動(dòng)功能影響不同[4-5]。

在運(yùn)動(dòng)終板形態(tài)上，脊髓橫斷性損傷4周后內(nèi)側(cè)腓腸肌運(yùn)動(dòng)終板結(jié)構(gòu)完整，突觸皺褶清晰，12周退變和完整運(yùn)動(dòng)終板均存在，但24周后則無(wú)法找到運(yùn)動(dòng)終板，這說(shuō)明完全性脊髓損傷病程中，隨著觀察時(shí)間延長(zhǎng)，運(yùn)動(dòng)終板結(jié)構(gòu)會(huì)出現(xiàn)不可逆退變性變化；這和有些報(bào)道結(jié)果類似[6-7]，脊髓橫斷損傷后運(yùn)動(dòng)終板著色，數(shù)量上和正常無(wú)明顯變化，脊髓損傷4周后肌纖維運(yùn)動(dòng)終板出現(xiàn)退變，終板染色變淺，軸索終末減少，終板核減少，肌漿淡染，終板邊緣皺縮，中央出現(xiàn)空泡樣淡然區(qū)。脊髓損傷8周后運(yùn)動(dòng)終板會(huì)出現(xiàn)明顯退變，染色區(qū)空白。免疫組織化學(xué)技術(shù)證實(shí)橫斷性脊髓損傷大鼠后肢神經(jīng)肌肉接頭發(fā)生解剖學(xué)不穩(wěn)，突觸前后結(jié)構(gòu)減少和軸突終末芽生，神經(jīng)肌肉突觸出現(xiàn)選擇性分解[8-9]。

在腓腸肌形態(tài)變化上，結(jié)果顯示，脊髓損傷4周后腓腸肌肌細(xì)胞截面積縮小，且截面積和觀察時(shí)間呈負(fù)相關(guān)。12周肌細(xì)胞萎縮明顯，大量結(jié)締組織增生，24周后肌細(xì)胞大片融合，無(wú)法確認(rèn)肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)，且結(jié)締組織增生明顯，而手術(shù)組和正常組則無(wú)此變化。推測(cè)脊髓損傷后肌細(xì)胞會(huì)發(fā)生進(jìn)行性蛻變，肌細(xì)胞截面積縮小，后期表現(xiàn)為一些肌纖維形態(tài)結(jié)構(gòu)破壞和結(jié)締組織填充[10-11]。這和報(bào)道結(jié)果類似[12-13]，脊髓損傷后大鼠肌纖維數(shù)目減少[14]，肌纖維萎縮，表現(xiàn)為肌肉截面積縮小，肌肉質(zhì)量下降，肌間脂肪堆積。 大鼠比目魚(yú)肌和內(nèi)側(cè)腓腸肌在脊髓損傷后1周下降22%和27%[15]。脊髓損傷后3周下降15%和18%，脊髓損傷10周和脊髓損傷3周在肌肉濕重量上相近。

大鼠在完全性橫斷性脊髓損傷自然病程中損傷平面以下周圍神經(jīng)、運(yùn)動(dòng)終板和骨骼肌在形態(tài)上會(huì)發(fā)生規(guī)律性變化，12周會(huì)發(fā)生顯著改變，24周后則出現(xiàn)不可逆損傷。

本研究中存在缺陷有，未將神經(jīng)電生理學(xué)相關(guān)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)納入，這樣就不能從量化程度上反應(yīng)神經(jīng)肌肉運(yùn)動(dòng)功能變化情況。但大鼠脊髓損傷和人脊髓損傷在運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和骨骼肌上有一定相近性，對(duì)治療時(shí)間窗有一定的作用。

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(本文編輯王雅潔)

西安醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院(西安 710000)，E-mail：liyuxinyxtg@163.com

引用信息：李毓新.脊髓損傷大鼠遠(yuǎn)端神經(jīng)元及骨骼肌變化的實(shí)驗(yàn)研究[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2017，15(6)：686-688.

R285.5

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2017.06.013

1672-1349(2017)06-0686-04

2016-08-30)