張建寧

·述評·

顱腦創(chuàng)傷后循環(huán)血中腦源性微粒的研究

張建寧

張建寧，男，主任醫(yī)師、教授，天津醫(yī)科大學總醫(yī)院院長、天津市神經(jīng)病學研究所所長。生于1961年，于1992年獲天津醫(yī)科大學神經(jīng)外科學醫(yī)學博士學位；2002年赴美國Baylor醫(yī)學院研修博士后；我國神經(jīng)外科知名專家，國務院特殊津貼獲得者、衛(wèi)生部突出貢獻專家和天津市131第一層次人才。擔任第五屆亞洲神經(jīng)外科學會副主席、中華醫(yī)學會神經(jīng)外科分會副主任委員、中華醫(yī)學會神經(jīng)外科分會脊髓脊椎專業(yè)學組副組長、中國醫(yī)師協(xié)會神經(jīng)外科分會創(chuàng)傷專家委員會委員、天津醫(yī)學會神經(jīng)外科學會主任委員、天津市神經(jīng)科學學會理事。發(fā)表學術(shù)論文240多篇，其中SCI文章35篇；主編主譯專著各1部，副主編專著3部，參編專著6部，承擔國際合作基金、國家自然基金重大項目以及國家科技部（973課題）子項目和省部級重點基金項目10余項，擁有國家級發(fā)明專利；曾獲天津市科技進步一等獎、二等獎、三等獎、四等獎共計9項。

顱腦創(chuàng)傷； 腦源性微粒； 免疫反應； 凝血機制

自從CT發(fā)明以來，腦外傷救治已取得了非常大的突破和進展，但進入21世紀以后，走向了平臺期。目前比較多的討論和研究集中在手術(shù)去大骨瓣是否有效、顱壓監(jiān)護是否有用、神經(jīng)營養(yǎng)藥是否有用等，然而并沒有得出一致的結(jié)論。我認為，在腦外傷領(lǐng)域如果還要取得突破性進展，進一步降低死亡率，就必須重視基礎(chǔ)研究。從臨床提出問題，以基礎(chǔ)研究為平臺，突破基礎(chǔ)理論和機理上的瓶頸，創(chuàng)新治療思路，找出治療辦法。近期我們對腦創(chuàng)傷后的腦源性微粒（brain-derived microparticles，BDMP）進行了研究，取得了令人振奮的效果，將來有可能產(chǎn)生一些突破?，F(xiàn)報道如下。

一、血中的微觀世界

事實上，我們的血液中并不那么“干凈”。除了人們所熟知的紅細胞、白細胞和血小板之外，還包含許多更小的有形成分，其構(gòu)成復雜、種類繁多，人們按其直徑大小分為以下3類進行研究：凋亡小體直徑約1～5μm，與血小板大小一致；再小一級是微粒（microparticles，MPs），直徑約0.1～1μm，與細菌大小一致；最小的是外泌體，直徑約30～100 nm，與病毒大小一致。它們都具有極其重要的生物學功能。例如血液中單獨存在的裸露mRNA會很快被酶切而失去生物活性，但是如果有MPs或者外泌體，就會成為一個很好的載體并作為相應的歸巢定位去發(fā)揮它的生物功能。

這些成分是如何產(chǎn)生的呢？有些是由凋亡產(chǎn)生，例如創(chuàng)傷可以導致細胞凋亡，產(chǎn)生凋亡小體；有些是在細胞受到刺激以后釋放的，如MPs；還有一些是細胞主動分泌的，如外泌體[1]。

二、BDMP：MP的新成員

研究提示，神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞損傷后可以釋放MPs。因為線粒體在細胞生物學功能上有很重要的作用，且線粒體標記具有特異性，所以我們將線粒體微粒（mitochondria microparticles，mtMPs）作為觀察對象。研究發(fā)現(xiàn)，無論是神經(jīng)元還是膠質(zhì)細胞，在損傷以后都可以釋放出mtMPs。通過流式細胞術(shù)可以在細胞培養(yǎng)的上清液中檢測到 mtMPs的釋放。mtMPs中含有線粒體的DNA，還可以檢測到一些mRNA及相應的酶。這些測定結(jié)果為研究mtMPs的生物學功能打開了遐想的空間。

作為神經(jīng)外科學者，我們的研究集中在對顱腦創(chuàng)傷后BDMP的觀察。我們團隊在國際上首先報道在腦組織和循環(huán)血液中可以觀察到BDMP。在透射電鏡下，可觀察到BDMP具有膜結(jié)構(gòu)、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等；通過流式細胞技術(shù)，可觀察到BDMP中含有豐富的磷脂以及一些腦組織特異性的蛋白，且都具有相應的生物學功能。磷鎢酸負染色之后，發(fā)現(xiàn)其表面的磷脂膜中存在膜蛋白。

我們還研究了BDMP的生物學功能。把BDMP注入小鼠體內(nèi)后，會導致小鼠死亡，逐漸降低劑量之后，可以摸索出一個劑量非常微小的半數(shù)致死量。然后對BDMP表面進行處理，在不破壞BDMP整體結(jié)構(gòu)的情況下用酶將其表面的蛋白消化掉，再次注入小鼠體內(nèi)后則不會出現(xiàn)小鼠死亡。研究還發(fā)現(xiàn)，將同樣濃度的BDMP打碎成為磷脂和蛋白質(zhì)后注入小鼠體內(nèi)，小鼠也未出現(xiàn)死亡。這些現(xiàn)象說明，BDMP有賴于其結(jié)構(gòu)的完整性和表面的膜蛋白去發(fā)揮作用。

我們發(fā)現(xiàn)，BDMP可激活血腦屏障上的某些細胞，使細胞之間的縫隙連接開放，血腦屏障打開。我們最近觀察了周細胞，發(fā)現(xiàn)受BDMP刺激以后，原本扁平狀態(tài)的周細胞會揪起來，高度增加，縫隙開放。說明BDMP很有可能在創(chuàng)傷后的腦水腫中具有很重要的作用[2]。

三、顱腦創(chuàng)傷后BDMP的作用機制

（一）腦內(nèi)作用

中樞神經(jīng)系統(tǒng)在受到外傷后，不論是神經(jīng)元還是膠質(zhì)細胞受損，都可以釋放出BDMPs。BDMPs首先在腦內(nèi)局部起作用，其作用可能有兩個方面：（1）保護作用。有一些主動分泌的外泌體，可以促進軸索和神經(jīng)元的修復；（2）損傷作用。有些MP被釋放后，其生物學功能會激活，對神經(jīng)細胞產(chǎn)生一定的損傷。

而且，BDMP還可以刺激周細胞和內(nèi)皮細胞，促使血腦屏障打開從而進入循環(huán)血。在循環(huán)血中能夠激活血小板、刺激白細胞并產(chǎn)生相關(guān)反應。這些反應對腦外傷后的病理生理機制產(chǎn)生極其重要的作用。

（二）MP與凝血功能障礙的關(guān)系

腦外傷后患者常合并凝血功能障礙，其可導致或加重腦外傷后腦水腫、顱內(nèi)出血、腦梗塞等一系列繼發(fā)性腦損害。而且創(chuàng)傷后出現(xiàn)不能控制的自發(fā)性出血，也是導致創(chuàng)傷患者死亡的一個主要原因，占創(chuàng)傷患者人數(shù)的30%～40%[3-5]。文獻報道腦外傷的凝血障礙發(fā)生率為10%～87.5%不等[6]。周良輔教授報道有超過50%的重型腦創(chuàng)傷患者會伴發(fā)凝血功能障礙。凝血功能障礙的發(fā)生與損傷嚴重程度相關(guān)，它還是腦創(chuàng)傷后死亡的一個獨立影響因素。

凝血功能障礙的發(fā)生與MP是否有關(guān)系呢？研究發(fā)現(xiàn)BDMP可與血小板結(jié)合，在熒光顯微鏡下首先表現(xiàn)為膜與膜可以碰到一起；其次發(fā)現(xiàn)兩者可以融合，一些是MP完整地被血小板吞噬，另一些是融合后將內(nèi)容物釋放到血小板里。流式細胞術(shù)也證實了上述改變，這種改變會導致血小板被激活。實驗顯示，BDMP的促凝活性強度和組織因子一樣。

組織因子等因素通過內(nèi)源性機制可導致血小板激活，血小板的激活分為兩個階段。首先血小板活化，然后通過血小板上的蛋白結(jié)構(gòu)來抓取周圍的紅細胞等，從而形成血塊、血栓。但研究發(fā)現(xiàn)，雖然BDMP可以激活血小板，但卻只激活第一階段，即被BDMP激活后的血小板處于一種高能狀態(tài)，卻并不直接將紅細胞等聚合在一起形成血塊。此時如果出現(xiàn)其他繼發(fā)性損害，如手術(shù)時間過長或肺部感染，就很可能會馬上出現(xiàn)大量的微血栓及彌散性血管內(nèi)凝血。手術(shù)過程中，我們不難發(fā)現(xiàn)有些重傷患者的血液和正常血液是完全不一樣的，表現(xiàn)為血液流出后基本不會凝固，這很可能就是BDMP的作用。因為它會消耗大量的纖維蛋白原，使血小板處于高水平激活狀態(tài)，一旦出現(xiàn)繼發(fā)性損害，就會形成微血栓。

腦外傷以后，血液中有內(nèi)皮細胞、血小板、白細胞等來源的MP，BDMP只占了一部分。相比MP的總量來講，BDMP的數(shù)量很小，但它的作用卻可能很大。經(jīng)血液測定，神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白陽性的MP在外傷后3 h出現(xiàn)高峰，神經(jīng)元特異性烯醇化酶陽性的MP則在外傷1 h后即出現(xiàn)高峰。BDMP可以導致凝血時間的改變，將BDMP去除之后，其上清液就不會引起這樣的改變。

循環(huán)血中BDMP含量改變的結(jié)果是什么呢？隨著凝血機制被激活，體內(nèi)纖維蛋白原會被大量消耗形成纖維蛋白，覆蓋在血小板的表面，再結(jié)合紅細胞等形成血栓。所以外傷后，血中的纖維蛋白原一般是呈降低狀態(tài)的，凝血時間是延長的。這就是MP的作用之一。當這一過程完成后，纖維蛋白會沉積到肺、腎臟、心肌等部位，其具體代謝途徑我們以后還會深入研究。

總結(jié)以上，我們的研究可以證實以下幾點：（1）外傷后損傷的神經(jīng)細胞可產(chǎn)生BDMP；（2）BDMP在體外和體內(nèi)均具有高度的促凝活性；（3）創(chuàng)傷后的BDMP可以穿透血腦屏障進入循環(huán)血中，導致血小板激活等系列變化；（4）BDMP與TBI后凝血功能障礙的發(fā)生和發(fā)展關(guān)系密切。

（三）顱腦損傷后的免疫反應

以前中樞神經(jīng)系統(tǒng)一直被認為是免疫豁免器官，但現(xiàn)在則認為，中樞神經(jīng)系統(tǒng)也并非排除在免疫調(diào)控作用之外。已有研究發(fā)現(xiàn)在顱內(nèi)矢狀竇附近存在淋巴管結(jié)構(gòu)。顱腦創(chuàng)傷后免疫炎癥反應通過引起的血腦屏障破壞可致大量腦組織碎片及細胞顆粒釋放入血，同時外周循環(huán)系統(tǒng)免疫炎性細胞亦可浸潤腦組織引起局部免疫反應，直接損傷神經(jīng)元細胞，導致繼發(fā)性損傷。

顱腦損傷既可以使血腦屏障發(fā)生改變，又使單核-巨噬細胞及小膠質(zhì)細胞的“清道夫”作用泛化，減弱其識別“自我”的能力，導致?lián)p傷區(qū)腦組織產(chǎn)生相應的病理變化。

顱腦損傷后免疫炎癥反應貫穿繼發(fā)性腦損傷的全過程，由MP介導的免疫炎癥反應機制逐漸受到廣泛關(guān)注，并被證實與多種免疫炎性疾病發(fā)生有關(guān)。

重型顱腦損傷患者外周血和腦脊液中不僅血小板來源的MP顯著增高，且內(nèi)皮細胞和白細胞來源的MP數(shù)量也顯著增高。MP本身可以攜帶多種促炎物質(zhì)，當MP被免疫細胞吞噬或與免疫細胞結(jié)合時，則會改變靶細胞的生物活性。這些改變很可能為我們進一步研究顱腦創(chuàng)傷打開一個新的窗口。

因心磷脂只存在于線粒體中，我們以心磷脂抗體為標記進行研究，通過檢測心磷脂陽性的微粒，可以發(fā)現(xiàn)小鼠顱腦創(chuàng)傷后會有心磷脂抗體的產(chǎn)生，且具有其特異性及其相應的功能[7]。

以抗腦抗體為例，我們對小鼠創(chuàng)傷性腦損傷后抗腦自身抗體進行檢測。通過ELISA法檢測，發(fā)現(xiàn)小鼠傷后14 d血漿中抗腦抗體的含量在逐漸增高，說明其在繼發(fā)性損傷當中，免疫炎癥反應是參與作用的。

顱腦損傷后損傷的神經(jīng)元及膠質(zhì)細胞碎片以BDMP形式釋放并進入外周血。除細胞膜MP外，細胞器也可以從損傷的細胞中釋放出來。在顱腦損傷的急性期外周血中可檢測到完整或部分破壞的腦源性mtMP，其占BDMP的比例超過50%。有理由認為BDMP是導致顱腦損傷后免疫炎癥反應異常和凝血功能障礙發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

四、顱腦創(chuàng)傷后BDMP研究的展望

顱腦損傷后損傷的神經(jīng)細胞可產(chǎn)生BDMP，其具有高度的促凝活性及潛在的促炎活性，導致?lián)p傷后凝血功能障礙。BDMP是介導免疫炎癥反應異常和凝血功能障礙這兩個相互重疊的病例變化的重要介質(zhì)之一，TBI后免疫炎癥反應異常和凝血功能障礙關(guān)系密切，它們是TBI患者預后不良及致殘的重要原因之一。

MP在人體內(nèi)的清除半衰期為5 h，但其清除機制仍不清楚。MP可能成為揭示TBI發(fā)生發(fā)展機制、探索TBI治療的新靶標。

我們做了一些研究，發(fā)現(xiàn)一種蛋白可以在體外阻斷MP的作用，注入體內(nèi)后，觀察到外傷后腦水腫出現(xiàn)減少。將該蛋白注入小鼠體內(nèi)后，再注入致死量的MP后發(fā)現(xiàn)，小鼠卻并未出現(xiàn)死亡。通過對該現(xiàn)象的深入研究，將來是否可以開發(fā)出一種新型早期干預治療的手段？另外，外傷后局部高濃度的BDMP也有可能是把雙刃劍。在其引起血腦屏障損傷的同時，如果通過更加精細深入的劃分，發(fā)現(xiàn)比外泌體更小的成分，或許可以促進外傷后半暗帶區(qū)神經(jīng)組織的修復以及神經(jīng)損傷區(qū)血管單元的再建立。研究提示，顱腦創(chuàng)傷后血液中的許多MP會聚集到外傷損傷區(qū)，其進一步發(fā)生機制如何，信號傳導通路是怎樣的，是否可通過基因修飾或MP干預來阻斷或增強其相關(guān)變化？這將很有可能為顱腦創(chuàng)傷治療開辟一條新途徑。

[1]Beyer C,Pisetsky DS.The role of microparticles in the pathogenesis of rheumatic diseases[J].Nat Rev Rheumatol,2010, 6(1):21-29.

[2]Zhao Z,Wang M,Tian Y,et al.Cardiolipin-mediated procoagulant activity of mitochondria contributes to traumatic brain injury-associated coagulopathy in mice[J].Blood,2016,127 (22):2763-2772.

[3]Hulka F,Mullins RJ,Frank EH.Blunt brain injury activates the coagulation process[J].Arch Surg,1996,131(9):923-927.

[4]Hoots WK.Experience with antithrombin concentrates in neurotrauma patients[J].Semin Thromb Hemost.1997,Suppl 1: 3-16.

[5]Cap AP,Spinella PC.Severity of head injury is associated with increased risk of coagulopathy in combat casualties[J].JTrauma, 2011,71(Suppl):S 78-81.

[6]Tian Y,Salsbery B,Wang M,et al.Brain-derived microparticles induce systemic coagulation in amurinemodel of traumatic brain injury[J].Blood,2015,125(13):2151-2159.

[7]Singh SB,OrnatowskiW,Vergne I,et al.Human IRGM regulates autophagy and cell-autonomous immunity functions through mitochondria[J].Nat Cell Biol,2010,12(12):1154-1165.（收稿日期：2017-01-23）

（本文編輯：張麗）

張建寧.顱腦創(chuàng)傷后循環(huán)血中腦源性微粒的研究[J/CD].中華神經(jīng)創(chuàng)傷外科電子雜志,2017,3(2):065-067.

10.3877/cma.j.issn.2095-9141.2017.02.001

300052天津，天津醫(yī)科大學總醫(yī)院神經(jīng)外科

張建寧，Email：jianningzhang@hotmail.com