朱云輝 郭元新 杜傳來 丁志剛 葉 華

（安徽科技學院食品藥品學院，鳳陽 233100）

低氧聯(lián)合NaCl脅迫下外源Ca2+對發(fā)芽苦蕎γ-氨基丁酸富集的影響

朱云輝 郭元新 杜傳來 丁志剛 葉 華

（安徽科技學院食品藥品學院，鳳陽 233100）

采用在通氣的培養(yǎng)液中添加外源Ca2+培養(yǎng)的方式，研究了低氧聯(lián)合NaCl脅迫下外源Ca2+對發(fā)芽苦蕎GABA富集的影響。低氧聯(lián)合NaCl脅迫對苦蕎的芽長有抑制作用，GAD活力和GABA的含量隨著NaCl濃度的增大均呈先上升后下降的趨勢，在10 mmol／L NaCl溶液處理時均達到最高值，分別是單純低氧脅迫的1.65倍和1.10倍；在低氧聯(lián)合NaCl脅迫的基礎(chǔ)上添加低濃度的Ca2+可緩解NaCl脅迫對苦蕎芽長的抑制作用，添加3 mmol／L Ca2+處理可使GAD活力和GABA的富集量達到最大，分別為91.44 U／g FW和492.31 μg／g DW，分別是低氧聯(lián)合NaCl脅迫的1.12倍和1.16倍；低氧聯(lián)合NaCl脅迫下添加Ca2+螯合劑和通道阻斷劑后發(fā)芽苦蕎芽長顯著降低，GAD活力顯著下降，GABA富集量減少。外源Ca2+可降低低氧聯(lián)合NaCl脅迫對苦蕎芽長的抑制作用，并可通過提升GAD活力，增強發(fā)芽苦蕎GABA的富集。

低氧脅迫 NaCl脅迫 Ca2+處理 發(fā)芽苦蕎 GABA富集

芽類食品是東方人重要的蔬菜，已有2 000多年的歷史。近年來，豆芽、苜蓿芽等芽類食品作為一種異域的健康和時尚產(chǎn)品，風靡歐美市場［1-2］?？嗍w（Fagopyrum Tataricum）芽菜是中國特有的藥食兩用蔬菜，已有悠久的食用歷史卻一直沒有得到應(yīng)有的重視［3-5］?？嗍w麥屬蓼科作物，其豐富的蛋白質(zhì)、脂肪、維生素、礦物質(zhì)及多酚類物質(zhì)含量都普遍高于大米、小麥、玉米等大宗糧食作物［6］，特別是苦蕎中含有禾谷類糧食所沒有的盧丁等黃酮類物質(zhì)［7］苦蕎獨特的降血壓、降血脂和降血糖功能逐漸受到廣大消費者們的青睞。近年來的研究表明，通過控制種子的發(fā)芽條件，可以富集γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）等植物中原來含量低或不具有的功能性成分［8-10］。

GABA是一種四碳非蛋白質(zhì)氨基酸，廣泛存在于真核和原核生物中，具有降血壓、改善心腦機能及緩解疼痛和焦慮等作用，開發(fā)富含GABA的食品備受關(guān)注［11-12］。植物中GABA合成主要來自GABA支路中由谷氨酸脫羧酶（GAD，EC 4.1.1.15）催化的不可逆的α-谷氨酸脫羧反應(yīng)［13］。植物受到冷激、干旱、鹽脅迫和低氧等脅迫時會強烈刺激其GAD活性，使GABA大量積累［8，14-15］，其中低氧脅迫富集GABA最為快速有效［16-17］，近年來的研究還將低氧脅迫同NaCl脅迫結(jié)合起來，對GABA的富集起到了疊加效應(yīng)［9，18］。GAD是一種Ca2+／鈣調(diào)蛋白（CaM）依賴型的酶，具有一個鈣調(diào)蛋白結(jié)合區(qū)［19］，因此在培養(yǎng)過程中添加外源Ca2+可提高GAD活力，繼而富集GABA。韓永斌等［20］將糙米放入通氣的培養(yǎng)液中并向其加入一定濃度的Ca2+，發(fā)現(xiàn)GABA含量顯著增加。目前，研究者們對苦蕎發(fā)芽的研究多集中在黃酮類物質(zhì)上［21-22］，有關(guān)苦蕎富集GABA的報道較少，利用低氧聯(lián)合NaCl脅迫下添加Ca2+處理富集GABA的研究還鮮見報道。

本試驗在低氧脅迫的基礎(chǔ)上，通過添加NaCl、Ca2+和Ca2+抑制劑處理，研究其對發(fā)芽苦蕎的生長、GAD活力和GABA富集的影響，并對相關(guān)作用機制做初步探討，旨在為富含GABA的苦蕎功能性芽菜食品的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

苦蕎（榆6-21）：2014年秋產(chǎn)自中國內(nèi)蒙古自治區(qū)烏蘭察布市，于-20℃貯藏于冰箱；GABA標品（＞99.9%）、對二甲氨基苯磺酰氯（DABS-CI，99%）：美國Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LHP-160型智能恒溫恒濕培養(yǎng)箱：上海三發(fā)科學儀器有限公司；Agilent 1200液相色譜儀：安捷倫公司；KDC-160HR高速冷凍離心機：合肥科大創(chuàng)新股份有限公司；真空冷凍干燥系統(tǒng)：美國Labconce公司；LZB-3型空氣流量計：江蘇余姚工業(yè)自動化儀表廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 苦蕎發(fā)芽試驗

正常發(fā)芽：取30 g苦蕎種子用去離子水浸泡清洗后，用1%的次氯酸鈉溶液消毒15 min，然后用去離子水沖洗至pH值中性，在去離子水中30℃浸泡4 h后，放入鋪有2層濾紙的φ9 cm培養(yǎng)皿中，在生化培養(yǎng)箱中30℃避光培養(yǎng)，培養(yǎng)期間每8 h左右噴去離子水1次，以保持發(fā)芽種子濕潤。

低氧脅迫發(fā)芽：將發(fā)芽2 d后的苦蕎放置于帶蓋的培養(yǎng)瓶（φ5 cm×18.5 cm）中，加入pH為4.2的10 mmol／L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液，培養(yǎng)液中通入速率為1.0 L／min的空氣，通氣量由空氣流量計控制，然后置于培養(yǎng)箱中于31.3℃下繼續(xù)培養(yǎng)2 d，培養(yǎng)期間，每隔24 h更換1次培養(yǎng)液。

培養(yǎng)結(jié)束后，將發(fā)芽種子用去離子水清洗并吸干表面水分，鮮樣用于測定樣品芽長和GAD活力，其余樣品用真空冷凍干燥后去殼，粉碎至過80目篩后用于測定GABA含量。

1.3.2 低氧聯(lián)合鹽脅迫發(fā)芽試驗設(shè)計

在低氧脅迫試驗中，分別向培養(yǎng)液中添加0、5、10、20、30和50 mmol／L的NaCl溶液，培養(yǎng)結(jié)束后測定發(fā)芽苦蕎芽長、GAD活力和GABA含量。

使用上一步驟中所得的最佳NaCl濃度，并在此基礎(chǔ)上向培養(yǎng)液中分別添加0、1、3、5、7和9 mmol／L Ca2+（以CaCl2代替）溶液，研究低氧聯(lián)合NaCl脅迫下Ca2+對發(fā)芽苦蕎芽長、GAD活力和GABA含量的影響。

利用所得的最佳NaCl濃度和Ca2+溶液濃度，設(shè)計如下6個處理。正常發(fā)芽（對照）：在培養(yǎng)皿中正常發(fā)芽4 d；低氧脅迫；低氧脅迫+10 mmol／L的NaCl；低氧脅迫+10 mmol／L的NaCl+3 mmol／L Ca2+；低氧脅迫+10 mmol／L的NaCl+3 mmol／L的鈣離子螯合劑（EGTA）；低氧脅迫+10 mmol／L的NaCl+ 3 mmol／L鈣離子抑制劑（LaCl3），培養(yǎng)結(jié)束后測定發(fā)芽苦蕎芽長、GAD活力和GABA含量。

1.3.3 測定指標與方法

芽長：隨機選取30粒發(fā)芽苦蕎籽粒，用游標卡尺測定其芽長；GABA：采用高壓液相色譜HPLC，條件參照Bai等［23］的方法；GAD：參照Guo等［9］的方法。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

試驗設(shè)3次重復，結(jié)果以“ˉx±s”表示。方差分析采用SPSS（version 16.0，Inc.，Chicago，IL，USA）軟件，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著，不同小寫字母之間表示差異顯著（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 低氧脅迫下NaCl對發(fā)芽苦蕎芽長、GAD活力和GABA富集量的影響

由表1可知，低氧脅迫下，用NaCl處理發(fā)芽苦蕎，其芽長受到明顯的抑制，當NaCl濃度超過5 mmol／L時，芽長顯著下降（P＜0.05）。發(fā)芽苦蕎中GAD和GABA的含量隨著NaCl濃度的增大均呈先上升后下降的趨勢，并在10 mmol／L時達到最高值，分別為81.65 U／g FW和424.31 μg／g DW，分別是0 mmol／L的1.65倍和1.10倍。低氧聯(lián)合10 mol／L的NaCl脅迫較單純使用低氧脅迫相比可顯著提高GABA的富集量（P＜0.05）。

表1 NaCl對低氧脅迫下發(fā)芽苦蕎芽長、GAD活力和GABA富集量的影響

2.2 低氧聯(lián)合NaCl脅迫下Ca2+對發(fā)芽苦蕎芽長、GAD活力和GABA富集量的影響

在低氧脅迫聯(lián)合10 mmol／L的NaCl脅迫下，添加不同濃度的Ca2+，發(fā)芽苦蕎芽長、GAD活性和GABA含量均發(fā)生了顯著的變化（P＜0.05）（見表2）。隨著Ca2+濃度的提升，芽長不斷增長，在3 mmol／L時達到最大為34.37 mm，較0 mmol／L顯著提高（P＜0.05）；當Ca2+濃度超過3 mmol／L時，芽長極顯著下降（P＜0.01），苦蕎芽長受到明顯的抑制。GAD活力和GABA富集量隨著Ca2+濃度的增高均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在3 mmol／L Ca2+處理時達到最大，分別為91.44 U／g FW和492.31 μg／g DW，分別是0 mmol／L的1.14倍和1.16倍。適度濃度的Ca2+能夠緩解NaCl的抑制作用，促進GAD活力的提高，進而使GABA富集量增大。

表2 Ca2+處理對發(fā)芽苦蕎芽長、GAD活力和GABA富集量的影響

2.3 低氧聯(lián)合NaCl脅迫下添加EGTA和LaC13對發(fā)芽苦蕎芽長的影響

如圖1所示，低氧脅迫抑制了苦蕎的生長，其芽長為對照（正常培養(yǎng)）的77.24%，低氧脅迫下添加NaCl處理進一步抑制了苦蕎芽長，此條件下芽長較單純低氧脅迫減少了11.43%，在此條件下，添加適量的Ca2+處理使這種抑制作用得到緩解，與低氧聯(lián)合NaCl脅迫相比芽長顯著增加（P＜0.05），但低于對照。在低氧聯(lián)合NaCl脅迫基礎(chǔ)上分別添加Ca2+的螯合劑EGTA和通道阻斷劑LaC13處理后，芽長均顯著降低（P＜0.05），僅為24.30與25.33 mm，分別比低氧聯(lián)合NaCl脅迫處理下降了19.63%和16.21%，二者處理之間無顯著差異（P＜0.05）。

圖1 不同脅迫方式對發(fā)芽苦蕎芽長的影響

2.4 低氧聯(lián)合NaCl脅迫下添加EGTA和LaC13對發(fā)芽苦蕎GAD活力的影響

如圖2所示，低氧脅迫下發(fā)芽苦蕎GAD的活力較對照顯著提升（P＜0.05），低氧聯(lián)合NaCl脅迫處理后，GAD活力極顯著提升（P＜0.01）。繼續(xù)添加Ca2+處理，GAD活力大幅提升，可達91.44 U／g，較低氧聯(lián)合NaCl脅迫提高了11.98%；而添加EGTA或LaC13處理后，GAD活力均會受到顯著地抑制（P＜0.05），僅分別為64.34和61.78 U／g FW，較低氧聯(lián)合NaCl脅迫處理分別下降了21.20%和24.34%，說明Ca2+對GAD活力具有激活作用。

圖2 不同脅迫方式對發(fā)芽苦蕎GAD活力的影響

2.5 低氧聯(lián)合NaCl脅迫下添加EGTA和LaC13對發(fā)芽苦蕎GABA富集量的影響

不同脅迫處理對發(fā)芽苦蕎GABA富集量的影響如圖3所示。正常發(fā)芽4 d（對照）時苦蕎GABA含量為187.39 μg／g DW，低氧脅迫后GABA含量較對照提升了1.05倍，為384.74 μg／g DW，繼續(xù)聯(lián)合NaCl處理，GABA含量增至424.31 μg／g DW，比低氧脅迫提升了10.29%，在此基礎(chǔ)上，添加3 mmol／L的Ca2+后，GABA富集量可繼續(xù)提升，達到492.32 μg／g DW，分別是低氧聯(lián)合NaCl脅迫和對照的1.16和2.63倍。在低氧聯(lián)合NaCl脅迫條件下，分別添加EGTA和LaC13處理均會顯著降低GABA的富集量（P＜0.05），僅分別為405.97和400.90 μg／g DW，二者處理間差異不顯著（P＜0.05）。

圖3 不同脅迫方式對發(fā)芽苦蕎GABA富集量的影響

3 討論

植物在NaCl脅迫下的生長受到抑制［24］。NaCl脅迫損害植物細胞正常的代謝過程，最終導致植物生長不良［25］，NaCl脅迫下大豆芽長較正常培養(yǎng)降低了12.28%～34.21%［26］，發(fā)芽苦蕎在低氧脅迫下添加NaCl后，其芽長明顯下降。有研究報道，Ca2+能在一定程度上緩解這種脅迫作用，低濃度的Ca2+可增強淀粉酶活力［27］，對糙米［27］NaCl脅迫下的大豆［28］和黃瓜種子［29］的萌發(fā)有促進作用，但高濃度的Ca2+則會出現(xiàn)抑制作用［29］。NaCl脅迫下，Ca2+通過增強信號轉(zhuǎn)換和能量傳輸途徑、促進蛋白質(zhì)的生物合成、抑制蛋白質(zhì)水解、對貯藏蛋白重新分配、調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工、激活并增強抗氧化酶的活性、積累次生代謝和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)以及其他的適應(yīng)性反應(yīng)等方式來提高植物的耐鹽性［28］。本研究在低氧聯(lián)合NaCl脅迫的基礎(chǔ)上添加3 mmol／L的Ca2+處理后，苦蕎芽長顯著大于單純的低氧聯(lián)合NaCl脅迫，而用5 mmol／L及以上的Ca2+處理則使芽長顯著下降，表明較低濃度的Ca2+可改善低氧聯(lián)合NaCl脅迫對苦蕎生長的抑制，有促進苦蕎生長的作用。

植物中的GABA合成主要來自GABA支路中由GAD催化的不可逆的α-谷氨酸脫羧反應(yīng)，GAD是其限制酶，同時，該反應(yīng)需要H+的參與［13］。植物受到低氧和澇災(zāi)、機械刺激、冷害、熱激及鹽脅迫等脅迫時會使細胞中的H+和Ca2+濃度增加強烈刺激GAD，導致體內(nèi)GABA含量成倍增加［8，14-15］，其中低氧脅迫下富集GABA最為快速有效，將植物放置于由通氣的培養(yǎng)液形成的低氧環(huán)境中培養(yǎng)，不失為一種有效的低氧脅迫方法。Guo等［30］、Bai等［23］和Li等［31］分別將發(fā)芽大豆、粟谷和蠶豆置于通氣的培養(yǎng)液中低氧培養(yǎng)，GAD活力大幅提升，GABA富集量得到快速增加。將發(fā)芽苦蕎置于通氣速率為1.0 L／min的條件下進行低氧脅迫，較正常培養(yǎng)相比，GABA富集量得到顯著提升，與前述研究相一致。GAD是一種Ca2+／CaM依賴型酶，具有一個鈣調(diào)蛋白結(jié)合區(qū)，增加細胞內(nèi)Ca2+濃度，可促進CaM轉(zhuǎn)錄水平提高，CaM調(diào)控的一系列生理反應(yīng)隨之被激活，繼而提升GAD活性［19］。研究表明，NaCl脅迫可通過提高細胞內(nèi)Ca2+濃度來刺激GAD活性，從而增加GABA含量。陳惠等［32］發(fā)現(xiàn)0～40 mmol／L的NaCl處理提高了發(fā)芽蠶豆中GAD活性，進而使GABA的含量升高。NaCl脅迫誘導紫花苜蓿根中氨基酸和碳水化合物大量合成，GABA含量亦有所提升［33］。在一定范圍內(nèi)，NaCl脅迫下發(fā)芽大豆［34］和玉米幼苗中［35］GABA的富集量隨著脅迫強度的增大而提升。低氧脅迫引起GABA含量的提高被認為是由于H+濃度的增加繼而刺激GAD活性所導致［36］，本研究中，低氧聯(lián)合NaCl處理顯著提高了發(fā)芽苦蕎GAD活力，較單純低氧脅迫提高了65.30%，GABA富集量得到迅速提升。低氧聯(lián)合NaCl脅迫對GAD的提升和GABA的富集有疊加的效應(yīng)，比單純使用低氧和NaCl脅迫要高。

研究表明，添加外源Ca2+處理可促進發(fā)芽糙米［37］和蠶豆［38］的GAD活力，進而富集GABA。Guo等［9］在低氧脅迫下對發(fā)芽大豆分別使用Na+和Ca2+處理，誘導了GAD活力的提升，提升了GABA的含量。在NaCl脅迫的基礎(chǔ)上，若繼續(xù)添加Ca2+處理，可提升GABA的富集效果。Bai等［19］報道，NaCl和Ca2+聯(lián)合脅迫發(fā)芽粟谷可使其GAD活力提升，GABA富集量最高可較單純NaCl脅迫增加36.29%。Ca2+不僅可以激活GAD的活性，還能促進相關(guān)基因的表達［18］。Yin等［15］報道，外源Ca2+可顯著增強NaCl脅迫下發(fā)芽大豆GAD相關(guān)基因的表達，促進GAD活力的提升。本研究表明，低氧聯(lián)合NaCl脅迫下，添加一定濃度的Ca2+同樣可使GAD活力大幅提升，GABA的富集量達到最大，是低氧聯(lián)合NaCl脅迫的1.16倍，是對照的2.63倍。EGTA和LaC13分別是Ca2+的螯合劑和通道阻斷劑，前者通過對Ca2+進行螯合繼而消除Ca2+的生理作用，后者阻礙了質(zhì)膜上的鈣通道，且濃度較高時完全抑制Ca2+通過質(zhì)膜進入細胞以達到對植物細胞生長的負面作用［24］。采用EGTA和LaC13處理過的發(fā)芽粟谷［19］和發(fā)芽蠶豆［39］中芽長、GAD活力和GABA含量較對照顯著降低。本研究表明，低氧聯(lián)合NaCl脅迫處理下，3 mmol／L Ca2+處理可緩解NaCl脅迫對苦蕎芽長的抑制作用，同時提高了GAD的活性，進而使苦蕎芽中GABA的含量大幅度提升；而添加EGTA和LaC13可抑制Ca2+／CaM的形成，阻斷鈣信號的發(fā)生，從而降低GAD活力，使GABA的富集量下降。研究進一步證實了GAD是一種由Ca2+／CaM調(diào)節(jié)的酶，但低氧聯(lián)合NaCl脅迫下Ca2+與GAD活力及GABA的富集的作用機理有待深入研究。

4 結(jié)論

低氧聯(lián)合NaCl脅迫對苦蕎的芽長有抑制作用，GAD活力和GABA的含量隨著NaCl濃度的增大均呈先上升后下降的趨勢，在10 mmol／L NaCl溶液處理時均達到最高值，分別是單純低氧脅迫的1.65和1.10倍；在低氧聯(lián)合NaCl脅迫的基礎(chǔ)上添加低濃度的Ca2+可緩解NaCl脅迫對苦蕎芽長的抑制作用，添加3 mmol／L Ca2+處理可使GAD活力和GABA的富集量達到最大，分別是低氧聯(lián)合NaCl脅迫的1.12倍（91.44 U／g FW）和1.16倍（492.32 μg／g DW）；低氧聯(lián)合NaCl脅迫下添加Ca2+的螯合劑或通道阻斷劑后，發(fā)芽苦蕎芽長顯著降低，GAD活力顯著下降，GABA富集量減少。

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Effect of Exogenous Ca2+on GABA Accumulation in Germinated Tartary Buckwheat Under Hypoxia-NaCl

Zhu Yunhui Guo Yuanxin Du Chuanlai Ding Zhigang Ye Hua
（College of Food and Drug，Anhui Science and Technology University，F(xiàn)engyang 233100）

The effect of exogenous Ca2+on GABA accumulation in germinated tartary buckwheat under hypoxia-NaCl stress was investigated by adding exogenous Ca2+to the aeration medium of the aeration medium.The tartary buckwheat sprouts length was restrained under hypoxia-NaCl stress in which GAD activity and GABA content rise at first and then drop with the increase of salt concentration.The maximum were reached at the 10 mmol／L salt solution，and were 1.65 times higher and 1.10 times higher than that under hypoxia stress alone respectively.On this basis，an addition of a low concentration of Ca2+in hypoxia-NaCl stress could alleviate salt stress inhibition of the tartary buckwheat sprouts length.The addition of 3 mmol／L Ca2+could make the GAD activity and GABA concentration reach the maximum，which were 91.44 U／g FW and 492.31 μg／g DW，1.12 times higher and 1.16 times higher than that under hypoxia-NaCl stress respectively.Under hypoxia-NaCl stress，the germinated tartary buckwheat sprouts length decreased obviously，GAD activity was significantly decreased and GABA concentration decreased after the addition of Ca2+chelating agent and channel blockers.Exogenous Ca2+could relieve the salt stress on the tartary buckwheat sprouts length inhibition and enhanced GABA accumulation in germinated tartary buckwheat through the improvement of GAD activity.

hypoxia stress，NaCl stress，Ca2+treatment，germinated tartary buckwheat，GABA accumulation

TS201.1

A

1003-0174（2017）01-0017-07

安徽省自然科學基金（1308085MC32）

2015-06-13

朱云輝，男，1991年出生，碩士，食品功能性成分的富集及品質(zhì)控制

郭元新，男，1970年出生，教授，農(nóng)產(chǎn)品加工及品質(zhì)控制