郭躍平，石夢(mèng)迪，徐廣偉，韋何雯，董曉尉

（金華市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，浙江金華321000）

HPLC法測(cè)定乳飲料中紐甜含量的研究

郭躍平，石夢(mèng)迪，徐廣偉，韋何雯，董曉尉

（金華市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，浙江金華321000）

建立快速、準(zhǔn)確測(cè)定乳飲料中紐甜含量的高效液相色譜檢測(cè)方法。樣品以20%乙腈水溶液為提取液，硫酸鋅和亞鐵氰化鉀為沉淀劑進(jìn)行前處理，采用ZORBAXSB-C18（250mm×4.6mm，5μm）色譜柱，200 nm檢測(cè)波長(zhǎng)，磷酸氫二銨（0.020mol/L，pH 3.5～4）：乙腈=（70∶30）為流動(dòng)相進(jìn)行等度洗脫分離。紐甜在0.2μg/m L～50.0μg/mL范圍內(nèi)線性良好，在0.8mg/kg～5.0mg/kg加標(biāo)范圍內(nèi)，回收率為90.1%～96.1%，RSD值為1.7%～2.1%，最低定量限為0.30mg/kg。

高效液相色譜法；乳飲料；紐甜

紐甜是一種新型功能性甜味劑，系阿斯巴甜的衍生物[1]，甜度約為蔗糖的8 000倍～13 000倍[2]，蔗糖的40倍以上，是一種強(qiáng)力甜味劑，甜味純正，甜味協(xié)和，穩(wěn)定性好，價(jià)格低廉，紐甜作為甜味調(diào)節(jié)劑廣泛應(yīng)用于乳飲料、糕點(diǎn)、調(diào)味品等各類食品中。研究表明，過(guò)量食用甜味劑會(huì)對(duì)人體健康造成危害，因此國(guó)家食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)也對(duì)其作出了嚴(yán)格規(guī)定[3]。

當(dāng)前食品中紐甜的檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法、高液液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法等分析方法[4-5]。目前國(guó)標(biāo)方法[6]通過(guò)提取、固相萃取等前處理過(guò)程對(duì)樣品進(jìn)行凈化，再利用高效液相色譜進(jìn)行梯度洗脫，能夠獲得較好的分離度，但由于過(guò)程復(fù)雜、操作繁瑣，并且儀器分析時(shí)間長(zhǎng)，不利于日常檢測(cè)。乳飲料中含有較多的蛋白質(zhì)等大分子成分，如前處理過(guò)程去除不充分，不但會(huì)影響色譜分離度，而且極易堵塞色譜柱，縮短色譜柱的壽命。本試驗(yàn)參考相關(guān)研究[7-10]，在樣品前處理過(guò)程中加入硫酸鋅和亞鐵氰化鉀作為沉淀劑，有效地去除了樣品中蛋白等雜質(zhì)，并建立了一種采用等度洗脫的高效液相色譜法測(cè)定乳飲料中的紐甜含量，該法操作簡(jiǎn)單、快速、重復(fù)性好、回收率高。

1材料與方法

1.1樣品

從超市中購(gòu)買不同廠家的乳飲料樣品，共計(jì)樣品數(shù)量20份。

1.2主要試劑

紐甜標(biāo)準(zhǔn)品（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98.0%）、甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）：購(gòu)自上海安譜科學(xué)儀器有限公司；磷酸氫二銨（分析純）、硫酸鋅（分析純）、亞鐵氰化鉀（分析純）：購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.3主要儀器與設(shè)備

1200高效液相色譜儀：美國(guó)Agilent公司；KH-600DB型超聲波清洗器：昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；Direct-Q5UV超純水機(jī)：美國(guó)密理博公司。

1.4方法

1.4.1色譜條件

檢測(cè)波長(zhǎng)：200 nm；色譜柱：Agilent ZORBAX SBC18（250mm×4.6mm，5μm）；流速：1.0mL/min；進(jìn)樣量：50μL；柱溫：30℃；流動(dòng)相為A（0.020mol/L磷酸氫二銨，pH 3.5～4）：B（乙腈）=（70∶30）。

1.4.2樣品前處理方法

稱取10 g乳飲料樣品（精確至0.001 g）于100mL容量瓶中，加入5mL硫酸鋅溶液（240 g/L）和5mL亞鐵氰化鉀溶液（106 g/L），再加入20%乙腈水溶液并定容至刻度，充分混勻，振蕩3min，放入超聲波清洗器中超聲40min，后經(jīng)濾紙過(guò)濾，濾液再經(jīng)0.45μm濾膜過(guò)濾，供高效液相色譜檢測(cè)。

2結(jié)果與分析

2.1色譜條件的優(yōu)化

2.1.1檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

利用二極管陣列檢測(cè)器（DAD）對(duì)紐甜標(biāo)準(zhǔn)品溶液在波長(zhǎng)190 nm～400 nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，結(jié)果顯示，紐甜在的最大吸收值在195 nm～205 nm之間，因此本研究選擇200 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)，紐甜光譜掃描圖見圖1。

圖1 紐甜紫外可見分光光譜圖Fig.1 Absorption spectrum of neotame

2.1.2流動(dòng)相及洗脫條件的選擇

本文對(duì)不同的流動(dòng)相體系進(jìn)行了研究，乙腈-離子對(duì)試劑緩沖液（辛烷磺酸鈉）、甲醇-乙酸銨（0.020mol/L）、乙腈-磷酸氫二鈉（0.020mol/L）、乙腈-磷酸氫二銨（0.020mol/L），結(jié)果表明乙腈-磷酸氫二銨（0.020mol/L）具有較好的分離效果，能滿足檢測(cè)要求。

將乙腈與磷酸氫二銨（0.020mol/L）在不同體積比的條件下對(duì)紐甜標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行等度洗脫（檢測(cè)波長(zhǎng)200nm，柱溫箱30℃），紐甜在各自體系中的保留時(shí)間見表1。

表1 流動(dòng)相中乙腈與磷酸氫二銨不同比例下的紐甜保留時(shí)間Table1 Retention timeof neotame in them obilephasew ith different proportion of acetonitrileand diammonium hydrogen phosphate

從表1可以看出，乙腈與磷酸氫二銨（0.020mol/L）的體積比為10∶90時(shí)，紐甜標(biāo)準(zhǔn)品在80min內(nèi)都未出峰，體積比為20∶80時(shí)，紐甜的出峰時(shí)間為43.3min，效率比較低，當(dāng)體積比為30∶70、35∶65和40∶60時(shí)，出峰時(shí)間分別為10.4、6.8、4.6min。出峰時(shí)間過(guò)快，易造成分離度不好，影響紐甜的出峰，因此選擇乙腈與磷酸氫二銨（0.020mol/L）的體積比為30∶70。

2.1.3色譜條件的確定

通過(guò)試驗(yàn)，確定色譜條件：檢測(cè)波長(zhǎng)200 nm，進(jìn)樣體積50μL，柱溫30℃，流動(dòng)相為乙腈與磷酸氫二銨（0.020mol/L）（體積比為30∶70），流速1mL/min。在此色譜條件下，紐甜標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖如圖2。

圖2 紐甜標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖Fig.2 Chrom atogram of neotame standard solution

2.2樣品前處理方法的優(yōu)化

2.2.1沉淀劑的選擇

由于所檢測(cè)的樣品為乳飲料，樣品中含有較多的蛋白質(zhì)及其添加了穩(wěn)定劑，如果樣品處理過(guò)程中不加入沉淀劑，那么供液相測(cè)定的濾液中含有較多的雜質(zhì)，嚴(yán)重影響分離效果，以及會(huì)縮短色譜柱使用壽命，因此比較了硫酸鋅、亞鐵氰化鉀以及同時(shí)加入硫酸鋅和亞鐵氰化鐵作為沉淀劑去除雜質(zhì)的效果。試驗(yàn)表明，同時(shí)加入硫酸鋅和亞鐵氰化鉀，沉淀效果較好，而且沒有干擾峰，最終確定硫酸鋅和亞鐵氰化鉀作為沉淀劑。

2.2.2提取液的選擇及提取液中不同組分比例的確定

本研究對(duì)純水、30%甲醇水溶液、30%乙腈水溶液作為提取液進(jìn)行了比較，試驗(yàn)表明，純水作為提取液回收率不高，而30%甲醇水溶液和30%乙腈水溶液作為提取液均具有較高的回收率，這可能是因?yàn)榧~甜更易溶于甲醇和乙腈，同時(shí)甲醇和乙腈可作沉淀劑，能更好地去除樣品中的雜質(zhì)，由于乙腈是流動(dòng)相，把乙腈水溶液作為提取液，能獲得更好的色譜分離度，因此選擇乙腈水溶液作為提取液。

分別將10%乙腈水溶液、20%乙腈水溶液、30%乙腈水溶液、40%乙腈水溶液、50%乙腈水溶液作為提取液進(jìn)行比較，試驗(yàn)表明20%～50%乙腈水溶液具有很高的回收率，10%乙腈水溶液回收率略低，從環(huán)境友好的角度考慮，最終選擇20%乙腈水溶液作為提取液。

2.3線性回歸方程、線性范圍和定量限

準(zhǔn)確稱取紐甜標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用20%乙腈水溶液配制成6種濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，6種濃度分別為0.2、0.5、1.0、10.0、20.0、50.0μg/mL，按1.4.1中色譜條件進(jìn)行分析，以質(zhì)量濃度作為橫坐標(biāo)，以峰面積作為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以陰性樣品中加入目標(biāo)化合物，采用1.4.2的前處理方法，1.4.1中色譜條件分析，以10倍信噪比（S/ N=10）確定定量限。紐甜的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)以及定量限如表2所示。

表2 線性范圍、回歸方程和定量限Table2 Regression equation，linear rangesand detection lim its

2.4檢測(cè)方法回收率和精密度

在陰性樣品中加入一定量的紐甜標(biāo)準(zhǔn)溶液，利用1.4.2的方法進(jìn)行前處理，利用1.4.1的色譜分析條件進(jìn)行儀器分析，考察方法的回收率和精密度，對(duì)不同的加標(biāo)量進(jìn)行平行試驗(yàn)，每組做6個(gè)平行。試驗(yàn)顯示，加標(biāo)范圍在0.80mg/kg～5.0mg/kg之間，紐甜的回收率為90.1%～96.1%，RSD值為1.7%～2.1%，結(jié)果如表3所示。

表3 方法回收率和精密度（n=6）Tab le3 Recovery and p recision（n=6）

2.5實(shí)際樣品檢測(cè)結(jié)果

采用該方法對(duì)市售的20份乳飲料產(chǎn)品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，有3份樣品有紐甜檢出，其中一份陽(yáng)性樣品的色譜圖見圖3。

圖3 陽(yáng)性樣品色譜圖Fig.3 Chromatogram of positive sample

3結(jié)論

本文建立了測(cè)定乳飲料中紐甜含量的高效液相色譜法。選擇磷酸氫二銨（0.020mol/L，pH 3.5～4）：乙腈=（70∶30）為流動(dòng)相，200 nm為波長(zhǎng)，獲得了較好的分離度和響應(yīng)值，樣品前處理過(guò)程中，以硫酸鋅和亞鐵氰化鉀為沉淀劑，以20%乙腈水溶液為提取液，雜質(zhì)去除效果好，并且回收率高。同時(shí)，該方法前處理簡(jiǎn)單快捷、精密度好、準(zhǔn)確度高，克服了國(guó)標(biāo)方法過(guò)程復(fù)雜、操作繁瑣和回收率不穩(wěn)定的劣勢(shì)，適合大批量樣品的測(cè)定，具有較強(qiáng)的實(shí)用價(jià)值。

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Determ ination of Neotame in M ilk Drinks by H igh Perform ance Liquid Chrom atography

GUOYue-ping，SHIMeng-di，XUGuang-wei，WEIHe-wen，DONGXiao-wei
（Institute for Food and Drug Controlof Jinhua City，Jinhua 321000，Zhejiang，China）

Toestablish an analysismethod for the determination ofneotame inmilk drinksby High Performance Liquid Chromatography（HPLC）.Sampleswereextracted by 20%acetonitrilewatersolution asextraction solution，zinc sulfate and potassium ferrocyanide asprecipitating agent，and the purified solutionswere analyzed by HPLC with a ZORBAX SB-C18 column（250 mm×4.6 mm，5μm）using diammonium hydrogen phosphate（0.02mol/L，pH 3.5-4）-acetonitrilesolution（70∶30）as themobile phase in equaldegree program，thedetectionwavelengthwas200 nm.The standard curvesofneotame in the rangeof0.2μg/mL-50.0μg/mL showed good linearity.The average recoveriesofneotamewas90.1%-96.1%in range of0.8mg/kg-5.0mg/kg addition，and the relative standard deviationwas1.7%-2.1%.The limitsofquantitation forneotamewas0.30mg/kg.

HPLC；milk drinks；neotame

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.05.039

2016-06-14

郭躍平（1984—），男（漢），工程師，碩士，研究方向：食品質(zhì)量與安全。