郭建軍，周藝，孫海燕，王婉瑩，許利嘉

（1.安順學(xué)院農(nóng)學(xué)院，貴州安順561000；2.貴州大學(xué)藥學(xué)院，貴州貴陽550000；3.中國科學(xué)院深圳先進技術(shù)研究院，深圳518055；4.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所，北京100193）

響應(yīng)面法優(yōu)化朵貝茶抗氧化活性的沖泡工藝

郭建軍1，周藝2，孫海燕3，王婉瑩4，許利嘉4

（1.安順學(xué)院農(nóng)學(xué)院，貴州安順561000；2.貴州大學(xué)藥學(xué)院，貴州貴陽550000；3.中國科學(xué)院深圳先進技術(shù)研究院，深圳518055；4.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所，北京100193）

以安順朵貝茶為原料，采用DPPH自由基清除率為評價指標，對沖泡溫度、沖泡次數(shù)、沖泡時間、料液比、水質(zhì)和沖泡方法進行研究，采用響應(yīng)曲面分析法優(yōu)化朵貝茶的沖泡工藝。結(jié)果表明，朵貝茶的料液比為1∶48（g/mL），單次沖泡時間為3.8min，沖泡溫度為80℃時，茶湯的DPPH自由基清除活性最高。

朵貝茶；抗氧化；沖泡工藝；響應(yīng)面

自1956年自由基衰老學(xué)說創(chuàng)立以來[1]，針對自由基的生命科學(xué)研究日益深入，許多疾病如神經(jīng)疾病、癌癥、免疫紊亂、心血管疾病及內(nèi)臟器官的損傷或老化，都與自由基導(dǎo)致的細胞損傷有關(guān)[2]。因此，抗氧化劑的開發(fā)已成為人們關(guān)注的熱點。

茶葉是山茶科植物，具有良好的抗氧化活性?；瘜W(xué)研究表明茶葉中富含茶多酚、茶多糖、茶氨酸等活性成分，藥理研究顯示茶葉具有抗腫瘤、抗菌、抗病毒、改善心血管疾病和抗衰老等多種功效[3-4]。茶多酚作為茶葉中的主要活性物質(zhì)，可減輕機體氧化水平，增加抗氧化物酶的活力，其抗氧化活性遠優(yōu)于VC[5-7]。此外，茶葉中的茶多糖、微量元素和維生素類也可增加茶葉的抗氧化活性[8-9]。

朵貝茶（DuobeiTea）是貴州的歷史名茶，產(chǎn)于安順市普定縣化處鎮(zhèn)境內(nèi)1300米的高山上，自明初洪武年間便作為貢品供奉皇室[10]。貴州省茶葉科學(xué)研究所研究結(jié)果表明，朵貝茶富含茶多酚、黃酮、氨基酸等多種化學(xué)物質(zhì)。但朵貝茶的抗氧化活性和沖泡工藝研究未見報道。本試驗以朵貝茶為原料，通過單因素和響應(yīng)面法研究其最佳沖泡條件，采用DPPH法評價茶葉的抗氧化活性，為科學(xué)指導(dǎo)朵貝茶的開發(fā)利用提供理論參考。

1材料與方法

1.1材料與儀器

朵貝茶：一芽一葉，2015年3月產(chǎn)，貴州普定；DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼）：美國Sigma-Aldrich公司；XPE-205型電子分析天平：美國METTLER TOLEDO；MQX200R2全波長酶標儀：美國Bio Tek。

1.2試驗方法

1.2.1清除DPPH自由基能力的測定

DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼）分子結(jié)構(gòu)中的苯環(huán)大π鍵以及多個-NO2吸電子基團，使夾在中間的氮自由基能穩(wěn)定存在，這種穩(wěn)定的DPPH自由基被清除的能力，為評價抗氧化活性提供了一個簡單、可靠的方法。目前在評價生物樣品、食品以及植物提取物等的體外抗氧化活性方面得到了廣泛的應(yīng)用。根據(jù)MiliauskasG[11]等的DPPH分析法，本文對DPPH自由基清除試驗進行了改進。取朵貝茶茶湯和DPPH無水乙醇溶液（2×10-4mol/L）各2mL混合，進行30min暗室反應(yīng)。在517 nm最大波長處，用無水乙醇調(diào)零，測吸光度A0；DPPH醇溶液混合液和無水乙醇各2mL，測吸光度A2；無水乙醇混合液和樣液各2mL，測吸光度A1。

計算公式為：DPPH清除率/%=[1－（A0－A1）/A2]×100

樣品DPPH自由基清除率為重復(fù)3次測定后的均值。在一定范圍內(nèi)可以用清除率的大小來表示樣品液抗氧化活性的能力[12]。

1.2.2單因素試驗

以朵貝茶為樣品，以日常沖泡條件為基礎(chǔ)，設(shè)置不同的沖泡溫度、料液比、沖泡時間、沖泡次數(shù)、沖泡水質(zhì)、沖泡器皿等試驗條件，采用DPPH自由基法考察不同試驗因素對朵貝茶茶湯抗氧化活性的影響。

1.2.2.1沖泡溫度

稱取1.0g的朵貝茶，加入50mL純凈水，按沖泡次數(shù)為1次，沖泡時間為4min，考察不同沖泡時間對朵貝茶抗氧化活性的影響。設(shè)置沖泡溫度為60、70、80、90、100℃，采用DPPH自由基清除率檢測朵貝茶茶湯的抗氧化活性。

1.2.2.2料液比

稱取1.0g的朵貝茶，加入純凈水，按沖泡次數(shù)為1次，沖泡時間為4min，沖泡溫度為80℃，考察不同料液比對朵貝茶抗氧化活性的影響。設(shè)置沖泡料液比為1∶40、1∶50、1∶60、1∶80、1∶100（g/mL），采用DPPH自由基清除率檢測朵貝茶茶湯的抗氧化活性。

1.2.2.3沖泡時間

稱取1.0 g的朵貝茶，加入50mL的純凈水，按沖泡次數(shù)為1次，沖泡溫度為80℃，考察不同沖泡時間對朵貝茶抗氧化活性的影響。設(shè)置沖泡時間為2、4、6、8、10min，采用DPPH自由基清除率檢測朵貝茶茶湯的抗氧化活性。

1.2.2.4沖泡次數(shù)

稱取1.0 g的朵貝茶，加入50mL的純凈水，按沖泡時間為4min，沖泡溫度為80℃，考察不同沖泡次數(shù)對朵貝茶抗氧化活性的影響。設(shè)置沖泡次數(shù)為1、2、3、4、5、6次，采用DPPH清除率檢測朵貝茶茶湯的抗氧化活性。

1.2.2.5水質(zhì)

稱取1.0 g的朵貝茶，加入50mL的水，按沖泡次數(shù)為1次，沖泡溫度為80℃，沖泡時間為4min，考察不同沖泡水質(zhì)對朵貝茶抗氧化活性的影響。設(shè)置沖泡水為自來水、娃哈哈礦泉水、純凈水和超純水，采用DPPH自由基清除率檢測朵貝茶茶湯的抗氧化活性。

1.2.2.6其它沖泡因素

稱取1.0 g的朵貝特級茶，下投法放入玻璃杯中，加入50mL、80℃的純凈水沖泡1次，沖泡時間為4min，考察不同沖泡方法對朵貝茶抗氧化活性的影響。分別設(shè)置沖泡方法為蓋瓷杯、上投法及朵貝普通級茶，采用DPPH自由基清除率檢測朵貝茶茶湯的抗氧化活性。

1.2.3響應(yīng)面分析試驗

采用Design Expert8.0，根據(jù)中心組合設(shè)計原理，基于單因素不變的條件下，選取朵貝茶的A沖泡時間（min）、B沖泡溫度（℃）和C料液比（g/mL）為自變量，響應(yīng)值為朵貝茶茶湯的DPPH自由基清除率（%）。應(yīng)用響應(yīng)面分析方法優(yōu)化朵貝茶抗氧化活性的沖泡工藝，響應(yīng)面分析試驗設(shè)計見表1。

表1 響應(yīng)面試驗設(shè)計表Tab le1 Factorsand levelsof responsesurfaceexperim ents

2結(jié)果與分析

2.1朵貝茶抗氧化活性單因素試驗

2.1.1沖泡溫度

溫度對DPPH自由基清除率的影響見圖1。

圖1 溫度對DPPH自由基清除率的影響Fig.1 Effectof temperatureon theDPPH inhibition

如圖1，朵貝茶茶湯DPPH自由基清除率隨溫度的升高而先增加后減少，80℃時達到最高值。分析原因可能是當(dāng)沖泡溫度為60℃時，較低的沖泡溫度影響了朵貝茶中有效成分的溶解，導(dǎo)致清除率較低；過高的沖泡溫度，使朵貝茶的熟化速度加快，窒塞了有效成分的溶解，導(dǎo)致茶湯清除率受影響；當(dāng)水溫達到100℃時，可能是加快了朵貝茶中有效成分的溶解，導(dǎo)致茶湯自由基清除率增大。而沖泡溫度過高，易導(dǎo)致有效成分發(fā)生變化。因此，選擇沖泡溫度70、80、90℃進行響應(yīng)面試驗。

2.1.2料液比

料液比對DPPH自由基清除率的影響見圖2。

圖2 料液比對DPPH自由基清除率的影響Fig.2 Effectof solid-liquid ratio on the DPPH inhibition

如圖2，朵貝茶茶湯DPPH自由基清除率隨料液比的升高而先增加后減少，料液比1∶50（g/mL）時達到最大值。當(dāng)料液比為1∶40（g/mL）時，可能因溶劑量過少，抗氧化有效成分溶出量較少。而料液比超過1∶50（g/mL）后，溶劑量增加，茶湯中有效成分濃度降低，導(dǎo)致DPPH自由基清除率降低。因此，選擇沖泡溫度1∶40、1∶50、1∶60（g/mL）進行響應(yīng)面試驗。

2.1.3沖泡時間

沖泡時間對DPPH自由基清除率的影響見圖3。

如圖3，朵貝茶中有效成分的DPPH自由基清除率總體先增大后減小，在4min時為最大值。在0至4min時，隨著沖泡時間增加，朵貝茶茶湯中的有效成分逐漸增多。4min以后，部分有效物質(zhì)被氧化，導(dǎo)致朵貝茶茶湯DPPH自由基清除率降低。8min時DPPH自由基清除率稍有上升可能是因為有其他物質(zhì)溶出。因此，選擇沖泡時間6、4、2min進行響應(yīng)面試驗。

圖3 沖泡時間對DPPH自由基清除率的影響Fig.3 Effectof tim eon the DPPH inhibition

2.1.4沖泡次數(shù)

沖泡次數(shù)對DPPH自由基清除率的影響見圖4。

如圖4，隨著沖泡次數(shù)的增加，朵貝茶茶湯DPPH自由基清除率隨之降低，前2次沖泡的茶湯DPPH自由基清除率明顯高于后幾次。表明第1次沖泡后茶葉中還有較多的抗氧化活性成分未浸出，沖泡第2次時抗氧化活性成分溶出雖有降低但仍在大量浸出，而沖泡至3次～6次時抗氧化活性成分溶出明顯減少，尤其是沖泡次數(shù)超過4次，茶湯口感明顯變差[13]?？紤]茶質(zhì)和湯色，沖泡次數(shù)選擇1次～3次較好。

2.1.5水質(zhì)

水質(zhì)對DPPH自由基清除率的影響見圖5。

圖5 水質(zhì)對DPPH自由基清除率的影響Fig.5 Effectofwater on theDPPH inhibition

如圖5，超純水和純凈水沖泡的抗氧化活性大于自來水和礦泉水。分析原因可能是自來水含無機鹽和多種微量元素與茶湯中的有效成分結(jié)合，導(dǎo)致DPPH自由基清除率減小?？紤]到日常生活的應(yīng)用性，因此，選擇純凈水為沖泡水質(zhì)。

2.1.6其它沖泡因素

其他因素對DPPH自由基清除率的影響見圖6。

圖6 其他因素對DPPH自由基清除率的影響Fig.6 Effectof other factorson theDPPH inhibition

如圖6，選用蓋瓷杯沖泡的茶湯抗氧化活性高于玻璃杯沖泡，朵貝特級茶沖泡的茶湯抗氧化活性高于朵貝普通級茶。另外，茶葉采用下投法的茶湯抗氧化活性高于上投法。故在日常生活中，沖泡器皿建議選擇蓋瓷杯及采用下投法沖泡優(yōu)質(zhì)朵貝茶。

2.2響應(yīng)面分析及驗證

2.2.1響應(yīng)面試驗結(jié)果與分析

綜合以上試驗結(jié)果，選擇朵貝茶的A沖泡時間（min）、B沖泡溫度（℃）和C料液比（g/mL）為自變量，依據(jù)Box-Behnken設(shè)計原理，設(shè)計17個試驗點，響應(yīng)值為朵貝茶的DPPH自由基清除率（%），結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

表2 響應(yīng)面設(shè)計與結(jié)果Table2 Resultsof response surfaceexperiments

表3 響應(yīng)面方程的方差分析Table3 Analysis resultsof regression and variance

續(xù)表3響應(yīng)面方程的方差分析Continue table3 Analysis resultsof regression and variance

通過響應(yīng)面軟件，得到回歸方程為：朵貝茶DPPH自由基清除率/%=+72.6-0.94×C+0.53×A×B+ 1.80×A×C-0.65×B×C-1.83×A2-2.14×B2-3.01×C2。

2.2.2響應(yīng)曲面優(yōu)化和驗證

根據(jù)回歸方程得出各因素（A、B、C）所構(gòu)成三維空間的響應(yīng)曲面分析圖。由圖7～圖9結(jié)果可知，料液比對DPPH自由基清除率的線性效應(yīng)極顯著，比較各因子間交互作用，沖泡時間與沖泡溫度、沖泡溫度與料液比交互作用均顯著，沖泡時間、料液比對DPPH自由基清除率的曲面效應(yīng)極顯著。此時，該方程P＜0.000 1，極顯著，其校正決定系數(shù)R2Adj=0.975 4，相關(guān)系數(shù)R2=0.989 2，說明該模型與試驗擬合度較好，應(yīng)用此響應(yīng)曲面法優(yōu)化朵貝茶抗氧化的沖泡工藝是可行的。

圖7 料液比和溫度交互作用的響應(yīng)面圖Fig.7 Response surfaceof solid-liquid and temperature

圖8 料液比和時間交互作用的響應(yīng)面圖Fig.8 Responsesurfaceof solid-liquid and time

圖9 時間和溫度交互作用的響應(yīng)面圖Fig.9 Response surfaceof tim eand tem perature

通過響應(yīng)面法優(yōu)化朵貝茶沖泡條件為：料液比1∶48.09（g/mL），溫度80.37℃，時間3.79min，此時朵貝茶的DPPH自由基清除率為72.69%?？紤]到日常情況，朵貝茶的沖泡工藝優(yōu)化為：料液比1∶48（g/mL），溫度80℃，時間3.8min，在此優(yōu)化條件下重復(fù)試驗，最終得出朵貝茶的DPPH自由基清除率試驗值為72.63%，接近響應(yīng)曲面回歸方程值72.69%。

3結(jié)論

本文以抗氧化活性為評價指標，分別探討了茶葉等級、水質(zhì)、沖泡器皿、投放方法、單次沖泡時間、沖泡溫度、料液比、沖泡次數(shù)等8個因素對朵貝茶DPPH自由基清除率的影響。采用中心組合試驗設(shè)計進行響應(yīng)面分析，研究沖泡時間、沖泡溫度和料液比對朵貝茶抗氧化活性的影響，最終確定最佳沖泡條件為：時間3.8min，溫度80℃，料液比1∶48（g/mL），此時朵貝茶的抗氧化活性達到最高，DPPH自由基的清除率達72.63%。朵貝茶是貴州歷史名茶、國家地理標志保護產(chǎn)品、安順市地方特色產(chǎn)品，對于朵貝茶資源的開發(fā)，可變資源優(yōu)勢為經(jīng)濟優(yōu)勢，推動地方經(jīng)濟發(fā)展。

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Optim ization of Brew ing Conditions for the Antioxidant Activity of Duobei Tea by Response Surface M ethod

GUO Jian-jun1，ZHOUYi2，SUNHai-yan3，WANGWan-ying4，XU Li-jia4
（1.CollegeofAgriculture，Anshun University，Anshun 561000，Guizhou，China；2.Schoolof Pharmaceutical Sciences，Guizhou University，Guiyang550000，Guizhou，China；3.Shenzhen InstitutesofAdvanced Technology，Chinese Academy of Sciences，Shenzhen 518055，China；4.Institute ofMedicinalPlant Development，Chinese Academy ofMedicalSciences，Beijing100193，China）

DuobeiTeawasused asmaterial to study ofbrewing temperature，brewing time，material liquid ratio andwaterquality by using DPPH free radicalscavenging rate.And through the response surface analysis to optimize brewing conditionsof Duobei Tea.Our result indicated that the bestbrewing conditionswerematerial liquid ratio 1∶48（g/mL），brewing time 3.8min and brewing temperature 80℃.At this time the tea ofDPPH free radicalscavenging ratewas thehighestavailable.The studieshad shown that the tea had good antioxidantactivity under the optimalprocess conditions.DuobeiTeawith good antioxidantactivity had the potential to be developed as a natural antioxidant.For scientifically drinking and utilizing of Duobei Tea provides valuable references.

DuobeiTea；antioxidantacitivity；dailybrewing tea；responsesurfaceanalysis

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.05.023

2016-10-26

貴州省科技合作計劃（黔科合LH字[2015]7693號）；貴州省教育廳青年科技人才成長項目（黔教合KY字[2016]277）

郭建軍（1986—），男（漢），講師，碩士，研究方向：應(yīng)用生物化學(xué)與天然產(chǎn)物研究。