楊國曦， 朱慶生， 楊重飛

(第四軍醫(yī)大學附屬西京醫(yī)院骨一科， 陜西 西安 710032)

Mac-1在破骨細胞分化中的作用*

楊國曦， 朱慶生△， 楊重飛△

(第四軍醫(yī)大學附屬西京醫(yī)院骨一科， 陜西 西安 710032)

目的： 探究巨噬細胞分化抗原1(Mac-1)分子在核因子κB受體活化因子配體(RANKL)誘導的破骨細胞分化中作用的分子機制。方法: 取4周齡C57BL/6J小鼠脾細胞，用RANKL及巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)誘導，同時用抗CD11b及抗CD18的特異性抗體進行處理，1周后對細胞核和細胞骨架進行染色；用抗CD11b抗體、干擾CD11b基因的慢病毒及其對照空載病毒處理RANKL誘導的破骨細胞，1周后對細胞進行免疫熒光染色；取4周齡C57BL/6J小鼠脾細胞用RANKL及M-CSF誘導，同時用抗CD11b抗體、干擾CD11b的慢病毒及其對照空載病毒分別進行處理，1周后提取總蛋白進行Western blot檢測。結果: CD11b抗體組和雙抗體組的多核細胞形成率低于對照組和CD18抗體組，雙抗體組和CD11b抗體組之間多核細胞形成率的差異不具有統(tǒng)計學顯著性；免疫熒光雙標結果顯示病毒組的CD11b、Syk及NFATc1表達強度均低于對照病毒組，CD11b抗體組的CD11b、Syk及NFATc1表達強度均低于對照組；Western blot結果顯示，CD11b抗體組的CD11b、Syk、NFATc1、c-Fos及 p-ERK/ERK水平均低于對照組，病毒組的CD11b、Syk、NFATc1、c-Fos及p-ERK/ERK水平均低于對照病毒組。結論: Mac-1分子中CD11b亞基對破骨細胞分化具有促進作用。該分子通過激活下游Syk通路，上調c-Fos，增加ERK活性，最終上調NFATc1而促進破骨細胞的分化。

巨噬細胞分化抗原1； 破骨細胞； 慢病毒

破骨細胞由多個破骨前體細胞融合而成，是人體內(nèi)唯一具有骨吸收功能的細胞。破骨前體細胞分布于外周循環(huán)和骨髓內(nèi)[1-2]，因此，破骨前體細胞的遷徙對破骨細胞的融合和到達骨表面尤為重要。當破骨前體細胞分化至抗酒石酸磷酸酶陽性時，破骨前體細胞開始融合并最終形成成熟破骨細胞[3]。

作為黏附分子家族中的重要成員之一，整合素對破骨前體細胞的遷徙和分化具有非常重要的作用。整合素由α、β亞基以非共價結合的方式形成，其中，白細胞功能相關抗原1(leukocyte function-associated antigen-1，LFA-1/CD11a/CD18)和巨噬細胞分化抗原1(macrophage differentiation antigen-1，Mac-1/CD11b/CD18)主要表達在破骨前體細胞表面，并且在破骨細胞分化過程中扮演重要角色[4]。細胞間黏附分子1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1/CD54)參與破骨細胞的遷徙和分化過程，且LFA-1和Mac-1均為ICAM-1的受體[5]， LFA-1與ICAM-1的相互作用在破骨細胞分化過程中是必需的[6]，而作為與LFA-1僅有一個亞基之差的Mac-1在破骨細胞分化中的作用研究尚少。

本研究將以原代破骨前體細胞為研究對象，通過抗體封閉和基因沉默等方式，研究Mac-1分子在核因子κB受體活化因子配體(receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL)誘導的破骨細胞分化中的作用和初步分子機制。

材 料 和 方 法

1 動物

C57BL/6J小鼠選自第四軍醫(yī)大學實驗動物中心；CD11b基因敲除小鼠(品系: B6.129S4-Itgamtm1Myd/J)購自JAX。于第四軍醫(yī)大學實驗動物中心飼養(yǎng)繁殖。

2 主要試劑和儀器

CD11b單克隆抗體和CD18單克隆抗體(Abcam)；RANKL和巨噬細胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor, M-CSF)購自Sigma；羅丹明標記的鬼筆環(huán)肽(Cytoskeleton)；4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(4’,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)購自CST；沉默Itgam(編碼CD11b的基因)的慢病毒及其對照空載病毒(GeneCopoeia)。

熒光顯微鏡(Zeiss)；電子顯微鏡(Olympus)。

3 主要方法

3.1 肌動蛋白染色實驗 取4周齡C57BL/6J雌性小鼠，取脾，研磨后利用70 μm細胞濾器過濾，取細胞濾液用α-MEM培養(yǎng)基及RANKL(100 μg/L)、M-CSF(10 μg/L)培育，同時于培養(yǎng)基中加入CD11b抗體和CD18抗體。對照組不加入抗體；CD11b抗體組加入5 μg/L CD11b抗體；CD18抗體組加入5 μg/L CD18抗體；雙抗體組同時加入CD11b及CD18抗體。隔天換液并重新加入抗體，1周后，用羅丹明標記的鬼筆環(huán)肽染細胞肌動蛋白，DAPI染細胞核，在熒光顯微鏡下觀察并拍照。

3.2 免疫熒光染色 在48孔板中利用RANKL和M-CSF誘導破骨細胞，以轉染系數(shù)為10(每個細胞轉染10個病毒顆粒)在病毒組加入沉默CD11b基因的慢病毒，對照病毒組加入對照空載病毒進行轉染，CD11b抗體組加入CD11b抗體(5 μg/L)，對照組除加入RANKL(100 μg/L)和M-CSF(10 μg/L)外不做其他處理。培養(yǎng)1周后，吸出培養(yǎng)基，用Triton做透化處理，并分別孵育Ⅰ抗和Ⅱ抗，并用熒光顯微鏡拍照。

3.3 Western blot實驗 提取各組破骨細胞細胞總蛋白。定量、電泳、轉膜并封閉，分別孵育兔抗小鼠Ⅰ抗(1∶1 000)及羊抗兔Ⅱ抗(1∶5 000)后，ECL 發(fā)光液化學發(fā)光，顯影。采用Quantity One 軟件進行掃描定量，計算各條帶灰度值，并分別除以內(nèi)參照β-actin灰度值。

4 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 14.0 軟件處理，計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較用Bonferroni校正的t檢驗。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 肌動蛋白染色結果

CD11b抗體組和雙抗體組可見許多較小細胞團塊，肌動蛋白呈綠色，細胞核呈藍色，細胞分化不良，呈小圓球形，細胞核分散，未見多核融合現(xiàn)象；CD18抗體組和對照組可見較多大細胞，細胞分化良好，有較多圓盤狀細胞團落，細胞核集中，多核融合現(xiàn)象突出。

CD11b抗體組和雙抗體組多核細胞形成率低于對照組及CD18抗體組(P<0.05)；雙抗體組的多核細胞形成率與CD11b抗體組比較差異無統(tǒng)計學顯著性，見圖1。

2 免疫熒光染色結果

CD11b(紅色)染色結果顯示：CD11b抗體組可見細胞表面附近零星分布紅色熒光，提示CD11b分子被抗體封閉；對照組可見較多紅色熒光分布于細胞表面附近；病毒感染組細胞表面附近基本未見紅色熒光；對照病毒組可見細胞表面附近有較多紅色熒光。

Figure 1.The fluorescence staining of osteoclast actin (×200) and the number of multinuclear cells. Mean±SD. n=3. #P<0.05 vs control.

脾酪氨酸激酶(spleen tyrosine kinase，Syk)染色結果顯示：CD11b抗體組可見綠色陽性熒光主要分布于細胞胞漿內(nèi)；對照組可見較多綠色熒光分布于包漿部位；病毒感染組可見胞內(nèi)分布較少綠色熒光；對照病毒組可見綠色熒光均勻分布于細胞內(nèi)。

活化T細胞核因子 1(nuclear factor of activated T-cells 1，NFATc1)染色結果顯示：CD11b抗體組可見細胞包漿部位少量綠色熒光；對照組可見較多綠色熒光分布于包漿內(nèi)部；病毒感染組胞漿部位基本未見綠色熒光；對照病毒組可見包漿內(nèi)較多綠色熒光，見圖2。

3 Western blot實驗結果

CD11b抗體組及慢病毒轉染組CD11b、Syk、p-ERK/ERK、c-Fos及NFATc1灰度值均下調。各組條帶曝光結果見圖3，灰度值分析見表1。

討 論

黏附分子是一類介導細胞與細胞、細胞與細胞外基質粘附的膜表面糖蛋白，參與細胞的黏附和分化過程，其表達的高低與包括炎癥在內(nèi)的病理過程密切相關。整合素是黏附分子家族的重要成員之一，是α、β2種亞基以非共價鍵結合構成的異二聚體[7]，參與細胞免疫應答及細胞黏附遷徙，在先天性免疫中至關重要，其缺失或封閉會嚴重阻礙免疫細胞向感染區(qū)域的遷徙滲透并導致病原體的大量繁殖[8]。整合素Mac-1由CD11b(αM)和CD18(β2)兩個亞基組成，除上述功能外，該分子在信號轉導[8]過程中同樣發(fā)揮重要作用[9-11]。

Figure 2.Immunofluorescence staining of the osteoclasts with different treatments (×200). Red: CD11b; green: Syk and NFATc1.

CD11b分子可以在RANKL誘導的破骨細胞分化中發(fā)揮促進作用。本研究用Western blot 實驗和免疫熒光染色結果表明，CD11b分子通過募集Syk分子，上調了其下游c-fos和ERK活性，最終上調起始破骨細胞分化的NFATc1轉錄因子，從而發(fā)揮促分化效應。Hayashi等[12]發(fā)現(xiàn)破骨細胞的形成率與細胞密度，而非細胞數(shù)量呈正相關，這是由于破骨前體細胞間融合需要Mac-1分子和ICAMs相互識別，這種識別使破骨前體細胞“意識”到其他前體細胞的存在，從而促進了細胞的遷移和融合，細胞密度越大，遷移距離越短，細胞融合率越高，在該研究中，經(jīng)CD11b抗體處理后，RANKL誘導下的RAW264.7細胞系破骨細胞形成率較對照組顯著下降；通過RNA干擾技術阻止RAW264.7細胞系表達CD11b后，RANKL誘導下的破骨細胞形成率較對照組降低，該研究結果在蛋白質和基因水平上說明了CD11b對破骨細胞的分化促進作用。

CD18分子在RANKL誘導的破骨細胞分化過程中不發(fā)揮促進效應。在肌動蛋白染色結果中，經(jīng)CD18抗體封閉，原代破骨細胞形成率與對照組無統(tǒng)計學差異，說明該分子在RANKL誘導的破骨細胞分化中不具備促進作用。CD11b的C-端凝集素結構域通過結合外源性受體，介導細胞的黏附及信號的胞外至胞內(nèi)傳導，證明了在Mac-1介導的細胞黏附和信號傳導中，CD11b亞基起到主導作用，而不是CD18[13-14]。

表1 Western blot實驗結果的半定量分析

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vscontrol virus group.

本實驗以Mac-1分子為研究對象，證明了Mac-1的CD11b亞基可以通過激活Syk通路促進RANKL誘導的破骨細胞分化，而另一亞基CD18不具備相同功能，該結論為臨床無菌性松動的治療提供了一定的理論依據(jù)。

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(責任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Role of Mac-1 in osteoclast differentiation

YANG Guo-xi, ZHU Qing-sheng, YANG Chong-fei

(TheFirstDepartmentofOrthopedics,XijingHospital,TheFourthMilitaryMedicalUniversity,Xi’an710032,China.E-mail:y384537310@126.com)

AIM: To investigate the function of macrophage differentiation antigen-1 (Mac-1) in receptor activator of nuclear factor-κB ligand (RANKL)-induced osteoclast differentiation and the mechanisms. METHODS: The spleen cells were isolated from 4-week-old C57BL/6J mice, and cultured with RANKL, macrophage colony-stimulating factor and CD11b and CD18 antibodies for 1 week. The actin bundles were stained with rhodamine-labeled phalloidin, and nuclei were stained with DAPI. CD11b and CD18 antibodies, lentivirus with interfering vector plasmid of target geneItgam(encoding CD11b) and empty virus (control virus) were used to treat osteoclasts for 1 week, and then immunofluorescence staining was performed. CD11b antibody, lentivirus and control virus were used to treat osteoclasts for 1 week, and total protein was taken for Western blot. RESULTS: Lower multinuclear positive rates in the groups treated with CD11b antibody were observed than that in the groups treated with CD18 antibody and control group. Lower immunofluorescence intensity of Syk, CD11b and NFATc1 was found in CD11b antibody group than that in control group. Lower Syk, CD11b and NFATc1 immunofluorescence intensity was also observed in lentivirus group than that in control virus group.The results of Western blot analysis showed that the protein levels of CD11b, Syk, NFATc1, c-Fos and p-ERK/ERK in CD11b antibody group were decreased as compared control group. Compared with control virus group, the protein levels of CD11b, Syk, NFATc1, c-Fos and p-ERK/ERK in lentivirus group were also decreased. CONCLUSION: CD11b subunit of Mac-1 promotes osteoclast differentiation by up-regulating c-Fos, ERK activity and NFATc1.

Macrophage differentiation antigen-1; Osteoclasts; Lentivirus

1000- 4718(2017)03- 0539- 05

2016- 09- 27

2016- 12- 09

國家自然科學基金資助項目(No. 81301541)

△通訊作者 Tel: 029-86126666； E-mail: y384537310@126.com

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A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.03.026