趙 璐， 易甜甜， 羅水蓮， 蘇 立

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院心內(nèi)科，重慶 400010)

依普利酮部分逆轉(zhuǎn)甲狀腺激素誘導(dǎo)的心肌電重構(gòu)

趙 璐， 易甜甜， 羅水蓮， 蘇 立△

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院心內(nèi)科，重慶 400010)

目的： 研究醛固酮拮抗劑依普利酮對(duì)甲狀腺激素(T3)誘導(dǎo)的心肌電重構(gòu)的影響。方法：原代培養(yǎng)SD乳鼠心肌細(xì)胞，并隨機(jī)分為對(duì)照組、T3組、依普利酮(Epl)組、T3+Epl組，采用免疫熒光法鑒定心肌細(xì)胞，CCK-8法檢測(cè)T3與依普利酮對(duì)心肌細(xì)胞存活率的影響，細(xì)胞免疫熒光法、real-time PCR法、Western blot法檢測(cè)各組鉀離子通道Kv1.5、Kv4.3,L型鈣離子通道Cav1.2,縫隙連接蛋白40(Cx40)和Cx43 mRNA與蛋白的表達(dá)。結(jié)果：免疫熒光法顯示所培養(yǎng)細(xì)胞為心肌細(xì)胞且95%以上橫紋肌α-輔肌動(dòng)蛋白(sarcomeric α-actinin, α-actinin)抗體染色陽(yáng)性。與對(duì)照組比較，T3增加Kv1.5、Kv4.3、Cav1.2與Cx40 mRNA與蛋白的表達(dá)，減少Cx43 mRNA與蛋白的表達(dá)；Epl組Kv1.5、Kv4.3、Cav1.2與Cx40 mRNA與蛋白的表達(dá)降低，Cx43的表達(dá)升高；與T3組比較，T3+Epl組Kv1.5、Kv4.3、Cav1.2與Cx40 mRNA與蛋白的表達(dá)降低，Cx43的表達(dá)升高。結(jié)論：依普利酮可部分逆轉(zhuǎn)甲狀腺激素導(dǎo)致的心肌電重構(gòu)。

心肌細(xì)胞； 甲狀腺激素； 依普利酮； 離子通道； 縫隙連接蛋白

心肌電生理特性取決于諸多離子通道的離子交換功能，離子通道是心肌細(xì)胞電活動(dòng)產(chǎn)生的基礎(chǔ)[1]。研究證實(shí)L型鈣電流(L-type Ca2+current，ICa-L)、瞬時(shí)外向鉀電流(transient outward K+current，Ito)、超快延遲整流鉀電流(ultrarapid delayed rectifier K+current，IKur)與心肌電活動(dòng)密切相關(guān)。同時(shí)，心肌細(xì)胞間的電興奮通過(guò)縫隙連接進(jìn)行傳導(dǎo)，而縫隙連接蛋白40 (connexin 40, Cx40)與Cx43是細(xì)胞間縫隙連接的主要蛋白。因此，心肌細(xì)胞離子通道與縫隙連接的改變均可導(dǎo)致心肌的電重構(gòu)。

甲狀腺激素(thyroid hormone, T3)等體液因素可導(dǎo)致心肌細(xì)胞的電重構(gòu)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)L-甲狀腺素可使大鼠心肌肥大，肥大的心肌質(zhì)膜的表面積增大，離子通道相對(duì)密度減少的同時(shí)也導(dǎo)致多個(gè)離子通道蛋白的表達(dá)異常，出現(xiàn)強(qiáng)的致心律失常性[2]。近年來(lái)，腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS)參與心肌重構(gòu)得以證實(shí)[3]。依普利酮(eplerenone，Epl)作為新型選擇性醛固酮受體拮抗劑，與鹽皮質(zhì)激素受體結(jié)合，抑制醛固酮受體復(fù)合物的形成，從而影響由醛固酮受體復(fù)合物引起的一系列病理反應(yīng)，且與性激素相關(guān)的副作用較螺內(nèi)酯少，因此受到廣泛關(guān)注[4]。但依普利酮是否能逆轉(zhuǎn)甲狀腺激素誘導(dǎo)的心肌電重構(gòu)尚無(wú)明確定論。因此，本研究擬通過(guò)甲狀腺激素處理原代心肌細(xì)胞，觀(guān)察依普利酮對(duì)甲狀腺素所致心肌電重構(gòu)的影響。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)新生1～3 d齡SD乳鼠，雌雄不拘，由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證編號(hào)為CQLA-2014-0187。

1.2 主要藥物與試劑 高糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(Gibco)；Ⅱ型膠原酶、5-溴脫氧尿苷(5-bromodeoxyuridine，5-BrdU)、甲狀腺激素、胰蛋白酶(Sigma-Aldrich)；依普利酮(Aladdin)；CCK-8試劑盒(Dojindo)；抗橫紋肌α-輔肌動(dòng)蛋白(α-actinin)、Kv1.5抗體(Santa Cruz)；抗Kv4.3、Cav1.2抗體(Novus)；抗Cx40、Cx43 抗體(BIOSS)；抗GAPDH 抗體(天德悅)；Cy3標(biāo)記的山羊抗兔抗體、FITC 標(biāo)記的山羊抗兔抗體、辣根過(guò)氧化物酶HRP標(biāo)記的抗體、DAPI染色液(碧云天)；TRIzol試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、real-time PCR 試劑盒(TaKaRa)。

2 方法

2.1 原代心肌細(xì)胞的分離培養(yǎng)與鑒定 取1～3 d齡的SD乳鼠，在無(wú)菌條件下取下乳鼠心肌組織，用0.125%胰蛋白酶及0.08% Ⅱ型膠原酶多次混合消化后離心，收集細(xì)胞懸液，接種于6孔板中，采用差速貼壁法和5-BrdU純化心肌細(xì)胞，用含有10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，40 h后換液。采用細(xì)胞免疫熒光法鑒定原代心肌細(xì)胞。

2.2 CCK-8法檢測(cè)T3與依普利酮對(duì)心肌細(xì)胞活力的影響 按每孔接種1×104個(gè)細(xì)胞的密度將心肌細(xì)胞接種于96孔板。分別加入含0、1、2、5、10、100 nmol/L T3的培養(yǎng)基和含0、10-8、10-7、10-6、10-5mol/L依普利酮的培養(yǎng)基，分別在培養(yǎng)24 h后加入10 μL CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，使用酶標(biāo)儀于450 nm處讀取吸光度(A)值。細(xì)胞存活率=(A實(shí)驗(yàn)組-A空白孔)/(A對(duì)照組-A空白孔)×100%。每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，空白孔為未加細(xì)胞懸液的培養(yǎng)基。根據(jù)此結(jié)果選取最適T3和依普利酮的處理濃度。

2.3 實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)以原代培養(yǎng)3 d后的心肌細(xì)胞作為研究對(duì)象。實(shí)驗(yàn)前更換無(wú)血清培養(yǎng)基處理24 h，使細(xì)胞生長(zhǎng)趨于同步化，再加入各干預(yù)因素培養(yǎng)24 h。實(shí)驗(yàn)分為4組，分別為對(duì)照(control)組、T3(10 nmol/L)組、Epl(10-6mol/L)組和T3+Epl組(先加入10 nmol/L T3，30 min后加入10-6mol/L依普利酮)。

2.4 細(xì)胞免疫熒光檢測(cè) 將無(wú)菌蓋玻片置于6孔板中，滴加細(xì)胞懸液，放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，更換無(wú)血清培養(yǎng)基處理24 h，用4%多聚甲醛溶液室溫固定15 min，加3‰ TritonX-100 37 ℃孵育10 min，用10%山羊血清配制的兔抗大鼠Kv1.5、Kv4.3、Cav1.2、Cx40和Cx43 抗體4 ℃過(guò)夜。次日以山羊抗兔IgG-FITC 37 ℃孵育1 h，DAPI復(fù)染細(xì)胞核5 min，用抗熒光淬滅劑封片后，于倒置熒光顯微鏡下觀(guān)察并攝片。采用Image J軟件分析各組熒光圖片的平均熒光強(qiáng)度(median fluorescent intensity, MFI)值。

2.5 Real-time PCR檢測(cè)mRNA的表達(dá) 收集各組細(xì)胞，采用TRIzol法按提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。參照GenBank設(shè)計(jì)并合成引物，GAPDH的上游引物序列為5’-GGGCCAAAAGGGTCATCATCTC-3’，下游引物序列為5’-GCCCTTCCACGATGCCAAA-3’；Kv1.5的上游引物序列為5’-GGGGCAAGATCGTGGGTTC-3’，下游引物序列為5’-CCTGCTCCTCGTGGTCTGTCT-3’；Kv4.3的上游引物序列為5’-CTGCCCTTCTCAACCCCAAATACTC-3’，下游引物序列為5’-ACCGCTTCAAAACACCAGGACTC-3’；Cav1.2的上游引物序列為5’-TCACCCCCAGCAGCTACTCATC-3’，下游引物序列為5’-CTGCGGGTCTCATCTGGAAACATA-3’；Cx40的上游引物序列為5’-GCACACTGTGCGCATGCAGG-3’，下游引物序列為5’-TGCTGGCCTTACTAAGGCG-3’；Cx43的上游引物序列為5’-ATCCAGTGGTACATCTATGG-3’，下游引物序列為5’-CTGCTGGCTCTGCTGGAAGG-3’。反應(yīng)條件為：95 ℃ 60 s；95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參照，目的基因mRNA的表達(dá)水平用2-ΔΔCt計(jì)算。

2.6 Western blot檢測(cè)蛋白的表達(dá) 收集各組細(xì)胞，加入含PMSF的RIPA裂解液提取蛋白，用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒進(jìn)行定量。取30 μg蛋白，經(jīng)SDS-PAGE分離后，電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉90 min，分別加入兔抗大鼠Kv1.5、Kv4.3、Cav1.2、Cx40和Cx43單克隆抗體，4 ℃過(guò)夜，加入HRP 標(biāo)記的山羊抗兔IgG，室溫孵育90 min，TBST 洗膜后ECL 顯影。應(yīng)用Quantity One 4.6.2凝膠電泳分析軟件進(jìn)行圖像分析，以目的蛋白與GAPDH蛋白條帶積分光密度的比值進(jìn)行半定量分析。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組均數(shù)比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較應(yīng)用Bonferroni校正的t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 心肌細(xì)胞培養(yǎng)與鑒定

細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，經(jīng)倒置顯微鏡觀(guān)察，大部分細(xì)胞已貼壁，成梭形、多邊形，部分細(xì)胞出現(xiàn)自發(fā)性搏動(dòng)。培養(yǎng)48 h后呈多邊形，三角形、梭形與不規(guī)則形細(xì)胞伸出偽足，呈聚集性生長(zhǎng)，連接成片，搏動(dòng)頻率40～150次/分。使用心肌特異性標(biāo)記的抗橫紋肌α-actinin抗體鑒定心肌細(xì)胞，可見(jiàn)心肌細(xì)胞純度達(dá)95%以上，見(jiàn)圖1。

Figure 1.The images of the cell morphology (A, ×400) and the identification of primary cultured cardiomyocytes with immunofluorescence staining (B, ×200).

2 T3與依普利酮對(duì)心肌細(xì)胞存活率的影響

CCK-8法測(cè)定結(jié)果顯示100 nmol/L T3處理組的心肌細(xì)胞存活率明顯低于對(duì)照組(P<0.05)，而1、2、5、10 nmol/L T3組與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。10-5mol/L依普利酮處理組的心肌細(xì)胞存活率明顯低于對(duì)照組(P<0.05)，而10-8、10-7、10-6mol/L T3組與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。據(jù)此結(jié)果選擇10 nmol/L為T(mén)3處理濃度，10-6mol/L為依普利酮的處理濃度，見(jiàn)圖2。

Figure 2.The concentration-response relationship of T3 and eplerenone on the viabilities of the cardiomyocytes by CCK-8 assay. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs 0 nmol/L (T3)； #P<0.05 vs 0 mol/L (Epl).

3 免疫熒光法評(píng)價(jià)T3與依普利酮對(duì)Kv1.5、Kv4.3、Cav1.2、Cx40和Cx43的蛋白相對(duì)表達(dá)水平的影響

與對(duì)照組比較，T3組的Kv1.5、Kv4.3、Cav1.2與Cx40的MFI升高(P<0.01)，Cx43的MFI降低(P<0.01)，Epl組的Kv1.5、Kv4.3、Cav1.2與Cx40的MFI降低(P<0.01)，Cx43的MFI升高(P<0.01)。與T3組比較，T3+Epl組的Kv1.5、Kv4.3、Cav1.2與Cx40的MFI降低(P<0.01)，Cx43的MFI升高(P<0.01)，見(jiàn)圖3。

Figure 3.The effects of T3 and eplerenone on the protein expression of Kv1.5, Kv4.3, Cav1.2, Cx40 and Cx43 in the cardiomyocytes by immunofluorescence staining (×400). Mean±SD. n=5. **P<0.01 vs control; ##P<0.01 vs T3.

4 T3與依普利酮對(duì)Kv1.5、Kv4.3、Cav1.2、Cx40和Cx43 mRNA表達(dá)的影響

T3、依普利酮干預(yù)24 h后，與對(duì)照組比較，T3組的Kv1.5、Cav1.2與Cx40的mRNA水平分別增加了2.61、2.01和2.44倍(P<0.01)，Kv4.3的mRNA水平增加了1.31倍(P<0.05)，Cx43的mRNA水平減少了63%(P<0.01)。Epl組Kv1.5和Kv4.3的mRNA水平分別減少了51%和48%(P<0.05)，而Cav1.2與Cx40的mRNA水平降低與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，Cx43的mRNA水平則增加了1.45倍(P<0.01)。與T3組比較，T3+Epl組Kv1.5、Kv4.3、Cav1.2與Cx40的mRNA表達(dá)降低(P<0.01)， Cx43的mRNA表達(dá)升高(P<0.01)，見(jiàn)圖4。

Figure 4.The mRNA expression of Kv1.5, Kv4.3, Cav1.2, Cx40 and Cx43 in the cardiomyocytes detected by real-time PCR. Mean±SD. n=3. *P<0.05, **P<0.01 vs control; ##P<0.01 vs T3.

5 T3與依普利酮對(duì)Kv1.5、Kv4.3、Cav1.2、Cx40和Cx43蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較，T3組的Kv1.5、Kv4.3、Cav1.2與Cx40 蛋白表達(dá)均升高，Cx43 蛋白表達(dá)降低，Epl組的Kv1.5、Kv4.3、Cav1.2與Cx40 蛋白表達(dá)均降低，Cx43的蛋白表達(dá)升高。與T3組比較，T3+Epl組的Kv1.5、Kv4.3、Cav1.2與Cx40蛋白表達(dá)均降低，Cx43的蛋白表達(dá)升高，見(jiàn)圖5。

討 論

本研究證實(shí)甲狀腺激素可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞Kv1.5、Kv4.3、Cav1.2、Cx40和Cx43的表達(dá)發(fā)生改變，提示甲狀腺素可導(dǎo)致心肌細(xì)胞電重構(gòu)。既往研究已證實(shí)醛固酮拮抗劑可以改善心肌纖維化等結(jié)構(gòu)重構(gòu)，而對(duì)于電重構(gòu)相關(guān)研究則較少。本研究結(jié)果提示醛固酮拮抗劑依普利酮可通過(guò)抑制Cav1.2、Kv1.5、Kv4.3、Cx40的mRNA及蛋白表達(dá)上調(diào)與Cx43的表達(dá)下調(diào)，在一定程度上改善甲狀腺激素導(dǎo)致的心肌電重構(gòu)。

ICa-L是心肌細(xì)胞重要的去極化電流，在動(dòng)作電位2相開(kāi)放，內(nèi)流的Ca2+促進(jìn)肌漿網(wǎng)釋放Ca2+，觸發(fā)心肌收縮偶聯(lián)。心肌電重構(gòu)時(shí)，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)Ca2+增多，并誘發(fā)肌漿網(wǎng)釋放更多Ca2+，使細(xì)胞內(nèi)Ca2+異常升高，細(xì)胞內(nèi)鈣超負(fù)荷，觸發(fā)鈣依賴(lài)式通道失活，使L型鈣通道活性降低，L型鈣離子通道Cav1.2電流密度下降，動(dòng)作電位時(shí)程和有效不應(yīng)期縮短，從而促進(jìn)多環(huán)折返的形成，這是Cav1.2的mRNA及蛋白表達(dá)下降導(dǎo)致心律失常的可能機(jī)制[5-6]。L型鈣通道Cav1.2的表達(dá)上調(diào)亦可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣超負(fù)荷，導(dǎo)致心肌電重構(gòu)[7]。本研究發(fā)現(xiàn)在T3處理心肌細(xì)胞24 h后L型鈣通道Cav1.2的mRNA及蛋白表達(dá)上調(diào)，依普利酮能逆轉(zhuǎn)T3導(dǎo)致的Cav1.2上調(diào)。

鉀離子流是心肌細(xì)胞動(dòng)作電位復(fù)極的主要外向電流。Kv1.5與Kv4.3 分別是心肌細(xì)胞超快延遲IKur與Ito形成的基礎(chǔ)。本研究結(jié)果提示，心肌細(xì)胞在T3干預(yù)后Kv1.5與Kv4.3 mRNA的表達(dá)分別升高2.61和1.31倍，且蛋白表達(dá)呈一致升高，表明在甲狀腺激素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中，鉀電流可能由于Kv1.5與Kv4.3 的變化而發(fā)生變化，從而引起心肌細(xì)胞動(dòng)作電位時(shí)程的改變，導(dǎo)致心肌電重構(gòu)。有研究發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)Kv4.3可增加Ito電流密度，縮短動(dòng)作電位時(shí)程，減少Ca2+內(nèi)流[8-9]。因此,鉀離子通道Kv4.3可通過(guò)調(diào)節(jié)跨膜Ca2+內(nèi)流，引起L型鈣通道變化，這可能是Kv4.3導(dǎo)致心肌電重構(gòu)的原因之一。

Figure 5.The protein expression of Kv1.5, Kv4.3, Cav1.2, Cx40 and Cx43 in the cardiomyocytes determined by Western blot. Mean±SD. n=5～7. *P<0.05, **P<0.01 vs control; #P<0.05, ##P<0.01 vs T3.

縫隙連接蛋白在心肌細(xì)胞表面組成縫隙連接通道，是心肌細(xì)胞之間進(jìn)行電化學(xué)信息交換的分子基礎(chǔ)，其結(jié)構(gòu)和功能的異常與心肌電重構(gòu)的發(fā)生關(guān)系密切。Cx40主要分布于心房肌及浦肯野傳導(dǎo)系統(tǒng)中，而Cx43廣泛分布于心房肌及心室肌細(xì)胞，Cx40與Cx43是心房電激動(dòng)傳導(dǎo)的關(guān)鍵蛋白。本研究發(fā)現(xiàn)T3誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中Cx43 mRNA和蛋白的表達(dá)下調(diào)并伴有Cx40 mRNA和蛋白的表達(dá)上調(diào)，與Dupont 等[10]在心肌肥大患者心內(nèi)膜表面發(fā)現(xiàn)的結(jié)果一致。但有關(guān)心肌電重構(gòu)Cx43的表達(dá)存在爭(zhēng)議，Cx43可在A(yíng)ngⅡ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中的表達(dá)上調(diào)[11]，在壓力超負(fù)荷犬的心肌中未見(jiàn)異常，但其分布不均[12]，而在甲亢大鼠中表達(dá)降低[13]。本研究結(jié)果提示，T3可使Cx43的表達(dá)下調(diào)，而Epl可部分逆轉(zhuǎn)這一效應(yīng)。研究結(jié)果不一致的原因不甚清楚，可能與不同的干預(yù)條件有關(guān)。結(jié)合國(guó)內(nèi)外多項(xiàng)研究結(jié)果，我們推測(cè)，無(wú)論Cx43的表達(dá)升高或降低或分布異常，均打亂了縫隙連接通道蛋白的平衡，干擾了心肌細(xì)胞電化學(xué)的正常傳導(dǎo)，導(dǎo)致了心肌細(xì)胞的電重構(gòu)。

甲亢時(shí)心肌組織中AngⅡ水平升高。本課題組的前期研究也證實(shí)，甲狀腺素誘導(dǎo)后心肌組織的AngⅡ水平升高，表明高甲狀腺素誘導(dǎo)的心肌電重構(gòu)中，有RAAS系統(tǒng)的參與[14]。醛固酮拮抗劑依普利酮可以通過(guò)鹽皮質(zhì)激素受體抑制醛固酮的活性。研究發(fā)現(xiàn)醛固酮拮抗劑依普利酮可通過(guò)激活生電鈉泵，改善心肌纖維化，減少心臟結(jié)構(gòu)重構(gòu)及心律失常的發(fā)生[15],同時(shí)可通過(guò)調(diào)節(jié)肌漿網(wǎng)Ca2+-ATP酶的表達(dá)改善心衰大鼠的心肌電重構(gòu)[16]。本研究結(jié)果顯示，T3誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞Kv1.5、Kv4.3、Cav1.2、Cx40和Cx43的改變可被依普利酮逆轉(zhuǎn)，進(jìn)一步提示醛固酮拮抗劑依普利酮可在一定程度上改善甲狀腺激素誘導(dǎo)的心肌電重構(gòu)。因此，醛固酮拮抗劑可能通過(guò)調(diào)節(jié)離子通道蛋白和縫隙連接蛋白表達(dá)而具有抗心律失常作用，我們將在后續(xù)的研究中，以全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)進(jìn)一步證實(shí)其對(duì)上述離子通道電生理學(xué)功能的影響。

[1] Nattel S, Harada M. Atrial remodeling and atrial fibrillation: recent advances and translational perspectives[J]. J Am Coll Cardiol, 2014, 63(22):2335-2345.

[2] Dai DZ. Vulnerable substrate and multiple ion channel disorder in a diseased heart will be new targets for antiarrhythmic therapy[J]. Acta Pharmacol Sinica, 2000, 21(4):289-295.

[3] Mayyas F, Alzoubi KH, Van Wagoner DR. Impact of aldosterone antagonists on the substrate for atrial fibrillation: aldosterone promotes oxidative stress and atrial structural/electrical remodeling[J]. Int J Cardiol, 2013, 168(6):5135-5142.

[4] Yang J, Young MJ. Mineralocorticoid receptor antagonists-pharmacodynamics and pharmacokinetic differences[J]. Curr Opin Pharmacol, 2016, 27:78-85.

[5] Chen WJ, Yeh YH, Lin KH, et al. Molecular characterization of thyroid hormone-inhibited atrial L-type calcium channel expression: implication for atrial fibrillation in hyperthyroidism[J]. Basic Res Cardiol, 2011, 106(2):163-174.

[6] Dartsch T, Fischer R, Gapelyuk A, et al. Aldosterone induces electrical remodeling independent of hypertension[J]. Int J Cardiol, 2013, 164(2):170-178.

[7] Yu Z, Wang T, Xu L, et al. Thyroid hormone increased L-type calcium channel mRNA expression and L-type calcium current of myocytes in rabbits[J]. Biomed Mater Eng, 2012, 22(1-3):49-55.

[8] Kaprielian R, Wickenden AD, Kassiri Z, et al. Relationship between K+channel down-regulation and [Ca2+]iin rat ventricular myocytes following myocardial infarction[J]. J Physiol, 1999, 517(Pt 1):229-245.

[9] Lebeche D, Kaprielian R, Hajjar R. Modulation of action potential duration on myocyte hypertrophic pathways[J]. J Mol Cell Cardiol, 2006, 40(5):725-735.

[10]Dupont E, Matsushita T, Kaba RA, et al. Altered connexin expression in human congestive heart failure[J]. J Mol Cell Cardiol, 2001, 33(2):359-371.

[11]Teunissen BE, Jongsma HJ, Bierhuizen MF. Regulation of myocardial connexins during hypertrophic remodelling[J]. Eur Heart J, 2004, 25(22):1979-1989.

[12]Vetter C, Zweifel M, Zuppinger C, et al. Connexin 43 expression in human hypertrophied heart due to pressure and volume overload[J]. Physiol Res, 2010, 59(1):35-42.

[13]Marchlewska K, Kula K, Walczak-Jedrzejowska R, et al. Maturational changes in connexin 43 expression in the seminiferous tubules may depend on thyroid hormone action[J]. Arch Med Sci, 2013, 9(1):139-145.

[14]Kobori H, Hayashi M, Saruta T. Thyroid hormone stimulates renin gene expression through the thyroid hormone response element[J]. Hypertension, 2001, 37(1):99-104.

[15]De Mello WC. Beneficial effect of eplerenone on cardiac remodelling and electrical properties of the failing heart[J]. J Renin Angiotensin Aldosterone Syst, 2006, 7(1):40-46.

[16]Kobayashi N, Yoshida K, Nakano S, et al. Cardioprotective mechanisms of eplerenone on cardiac performance and remodeling in failing rat hearts[J]. Hypertension, 2006, 47(4):671-679.

(責(zé)任編輯： 林白霜， 余小慧)

Eplerenone partly reverses thyroid hormone induced myocardial electrical remodeling

ZHAO Lu, YI Tian-tian, LUO Shui-lian, SU Li

(DepartmentofCardiology,TheSecondAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400010,China.E-mail:sulicq@163.com)

AIM: To investigate the effects of eplerenone (Epl) on thyroid hormone (T3) induced myocardial electrical remodeling. METHODS:The ventricles of 1～3 d neonatal rats were digested with 0.125% trypsin and 0.08% collagenase type 2. The cell suspension was replated for 90 min to reduce the proportion of non-myocardial cells. The isolated cardiomyocytes were randomly divided into control group, T3 group, Epl group and T3+Epl group. The cardiomyocytes were identified by immunofluorescence staining. The viability of the cardiomyocytes was measured by CCK-8 assay. The expression of Kv1.5, Kv4.3, Cav1.2, connexin 40 (Cx40) and Cx43 at mRNA and protein levels was determined by immunofluorescence staining, real-time PCR and Western blot. RESULTS:The results of the cell immunofluorescence labeling conformed that the cultured cells were cardiomyocytes with more than 95% positive staining of sarcomeric α-actinin. Compared with control group, the mRNA and protein levels of Kv1.5, Kv4.3, Cav1.2 and Cx40 were increased, but the expression of Cx43 was decreased in T3 group. The mRNA and protein levels of Kv1.5, Kv4.3, Cav1.2 and Cx40 were decreased, but the expression of Cx43 was increased in Eplerenone group. Compared with T3 group, the mRNA and protein expression levels of Kv1.5, Kv4.3, Cav1.2 and Cx40 were decreased, but the expression of Cx43 was increased in T3+Epl group. CONCLUSION: Eplerenone partly reverses T3-induced myocardial electrical remodeling.

Cardiomyocytes; Thyroid hormone; Eplerenone; Ion channel; Connexin

1000- 4718(2017)03- 0428- 07

2016- 09- 26

2016- 11- 15

△通訊作者 Tel: 023-63693452; E-mail: sulicq@163.com

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.03.008