王 芳， 李 巖， 盧昕爍， 楊杰波， 劉方芳， 余雪松， 李 明△

(1廣東藥科大學(xué)基礎(chǔ)學(xué)院， 2廣州中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 廣東 廣州 510006)

PM2.5對血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡的影響及機(jī)制*

王 芳1， 李 巖2， 盧昕爍1， 楊杰波1， 劉方芳2， 余雪松1， 李 明1△

(1廣東藥科大學(xué)基礎(chǔ)學(xué)院，2廣州中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 廣東 廣州 510006)

目的： 從大氣細(xì)顆粒物PM2.5對血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡的影響，研究PM2.5對血管內(nèi)皮細(xì)胞的毒性。方法: 體外培養(yǎng)血管內(nèi)皮細(xì)胞株EA.hy926，用不同濃度的PM2.5染毒24 h后，用CCK-8法測細(xì)胞的活性，用DCFH-DA熒光標(biāo)記法檢測細(xì)胞內(nèi)氧自由基生成情況，用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率，然后用Western blot法檢測凋亡相關(guān)蛋白細(xì)胞色素C、cleaved caspase-9和cleaved caspase-3的表達(dá)變化。結(jié)果: CCK-8法結(jié)果顯示PM2.5對血管內(nèi)皮細(xì)胞有明顯的毒性，在濃度大于25 mg/L時可使EA.hy926細(xì)胞活性顯著下降；PM2.5染毒24 h后可見DCFH-DA熒光染色增強(qiáng)，說明細(xì)胞內(nèi)有大量的氧自由基形成；流式細(xì)胞術(shù)和Western blot檢測證實PM2.5可以通過上調(diào)細(xì)胞色素C表達(dá)和活化cleaved caspase-9和cleaved caspase-3而誘導(dǎo)EA.hy926細(xì)胞凋亡。此外,用N-乙酰半胱氨酸抑制氧自由基生成可以抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，提示PM2.5引起的細(xì)胞凋亡與氧化應(yīng)激有關(guān)。結(jié)論: PM2.5可導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激水平增強(qiáng)和凋亡增加，這可能是其影響心血管系統(tǒng)功能的機(jī)制之一。

PM2.5； 血管內(nèi)皮細(xì)胞； 氧化應(yīng)激； 細(xì)胞凋亡

隨著我國經(jīng)濟(jì)發(fā)展和城市化進(jìn)程的不斷加快，工業(yè)生產(chǎn)、交通和燃煤等所產(chǎn)生的大量顆粒物(particulate matter，PM)使大氣污染問題日益嚴(yán)峻，并嚴(yán)重危害人體健康[1]。與健康相關(guān)的PM按其空氣動力學(xué)直徑可以分為PM10、PM2.5和PM0.1，PM的粒徑越小，進(jìn)入呼吸系統(tǒng)部位越深，尤其是PM2.5和PM0.1，現(xiàn)在研究證實其不僅可以沉積在肺泡，還可以穿透血氣屏障進(jìn)入血液循環(huán)[2]，因此目前大氣污染除與呼吸系統(tǒng)疾病有關(guān)外，還可以影響心血管系統(tǒng)疾病的發(fā)生[3]。以上結(jié)果也得到了流行病的證實，調(diào)查顯示灰霾天氣時醫(yī)院住院人數(shù)增多，人群總死亡率明顯增高，其中以呼吸系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)疾病患者為主[4-5]。

目前，PM2.5已經(jīng)被認(rèn)為是重要的心血管疾病危險因素之一，對于其作用機(jī)制，由于以往認(rèn)為PM2.5主要通過造成肺部損傷引起全身炎癥性反應(yīng)，以間接作用的方式影響心血管系統(tǒng)疾病的發(fā)生[6]。直到近年來研究者發(fā)現(xiàn)PM2.5可以進(jìn)入血液循環(huán)，才有學(xué)者提出PM2.5可能直接造成心血管系統(tǒng)毒性[2-3]。血管內(nèi)皮細(xì)胞受損或功能障礙是動脈粥樣硬化等心血管疾病發(fā)生的共同基礎(chǔ)[7]，PM2.5進(jìn)入血液循環(huán)后可與血管內(nèi)皮細(xì)胞相接觸，因此PM2.5可能通過直接影響內(nèi)皮細(xì)胞功能來促進(jìn)心血管系統(tǒng)疾病的發(fā)生。為研究該問題，本研究在體外培養(yǎng)血管內(nèi)皮細(xì)胞，用PM2.5進(jìn)行干預(yù)，從氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡兩方面研究PM2.5對內(nèi)皮細(xì)胞的影響，以期加深對PM2.5心血管系統(tǒng)毒性的認(rèn)識。

材 料 和 方 法

1 儀器與試劑

1.1 主要儀器 AvantiTMJ25低溫高速離心機(jī)(Beckman)；MCO-175 CO2培養(yǎng)箱(SANYO)；MS800顯微鏡(Olympus)；ELx800酶標(biāo)儀(BioTek)；流式細(xì)胞儀(BD)；蛋白電泳儀、電轉(zhuǎn)儀和凝膠成像儀(Azure Biosystems)。

1.2 主要試劑 PM2.5(Sigma)；胰酶、DMEM 培養(yǎng)基和胎牛血清(Gibco)；CCK-8試劑盒(Dojindo)；活性氧檢測試劑盒H2-DCFDA(江蘇凱基生物技術(shù)有限公司)；凋亡試劑盒(上海貝博生物科技有限公司)；抗β-actin抗體、抗caspase-3抗體和HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG(ABclonal)；抗caspase-9抗體(CST)；抗細(xì)胞色素C(cytochrome C，Cyt-C)抗體(Abcam)；蛋白預(yù)染Marker(Thermo)；脫脂奶粉、蛋白定量試劑盒和RIPA細(xì)胞裂解液(上海碧云天生物有限公司)。

2 實驗方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人血管內(nèi)皮細(xì)胞EA.hy926株購自廣州吉妮歐生物科技有限公司，用含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM完全培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實驗。

2.2 細(xì)胞活性的檢測 取對數(shù)生長期的EA.hy926細(xì)胞，以每孔8×103個接種96孔板，分為對照組和不同濃度PM2.5染毒組(PM2.5終濃度分別為12.5、25、50、100和200 mg/L)，每組設(shè)6個復(fù)孔。根據(jù)實驗分組，對細(xì)胞進(jìn)行染毒，24 h后按照CCK-8試劑盒說明書，用酶標(biāo)儀在450 nm處檢測各孔吸光度(A)值，按公式計算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率(%)=染毒組A值/陰性對照組A值×100%。

2.3 細(xì)胞內(nèi)活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)生成的檢測 細(xì)胞以每孔1×106個接種于6孔板，分為對照組、不同濃度PM2.5染毒組(PM2.5濃度根據(jù)結(jié)果選擇25、50和100 mg/L)和N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine，NAC)處理組(以NAC 10 mol/L 預(yù)處理1 h后加入PM2.5 100 mg/L)。細(xì)胞孵育24 h后去除培養(yǎng)基，加入DCFH-DA探針(10 μmol/L)孵育90 min，用溫PBS漂洗2次，然后用溫?zé)o血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)30 min，置于熒光顯微鏡下觀察拍照。

2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 細(xì)胞分組和處理同上，孵育24 h后用無EDTA胰酶消化細(xì)胞，冷PBS離心洗滌2次，然后用400 μL binding buffer重懸細(xì)胞，先加入Annexin V-FITC 5 μL 4 ℃避光孵育15 min，再加入碘化丙啶(propidium iodide，PI)10 μL，4 ℃避光孵育5 min后，立即以流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。

2.5 凋亡相關(guān)信號分子的檢測 實驗分組和處理同上，24 h后用冷PBS洗滌3次，用含PMSF的RIPA細(xì)胞裂解液冰上裂解細(xì)胞30 min，然后4 ℃、12 500×g離心5 min，收集上清液，用BCA法測量蛋白濃度。取30 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分離、轉(zhuǎn)膜。Western blot主要步驟如下：5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，TBST清洗10 min、3次，加入相應(yīng)Ⅰ抗(1∶1 000)，其中抗caspase-9抗體和抗caspase-3抗體可同時檢測未活化的凋亡蛋白酶及被切割活化后的凋亡蛋白酶。4 ℃孵育過夜，TBST清洗后加入酶標(biāo)Ⅱ抗(1∶3 000)，室溫孵育1 h，最后用TBST清洗并用ECL法顯色，凝膠成像系統(tǒng)拍照，用ImageJ分析軟件分析條帶的灰度值，用目標(biāo)蛋白與β-actin灰度值的比值來表示蛋白的相對表達(dá)水平。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

以GraphPad Prism 5統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多樣本組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 PM2.5對EA.hy926細(xì)胞的毒性作用

當(dāng)PM2.5濃度為12.5 mg/L時， EA.hy926細(xì)胞的存活率雖然有所降低，但與對照組無顯著性差異；當(dāng)PM2.5濃度大于25 mg/L時，EA.hy926細(xì)胞存活率明顯下降，與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P<0.01)，見圖1。

Figure 1.The viability of EA.hy926 cells exposed to PM2.5 for 24 h. Mean±SD. n=6. **P<0.01 vs 0 mg/L group.

2 PM2.5對EA.hy926細(xì)胞內(nèi) ROS水平的影響

熒光染色結(jié)果顯示，對照組細(xì)胞在熒光顯微鏡下幾乎看不到熒光，而PM2.5刺激后細(xì)胞內(nèi)可見較強(qiáng)的熒光，且隨著PM2.5濃度的增大熒光強(qiáng)度逐漸增加，說明PM2.5染毒可以使血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)ROS生成增多，引起細(xì)胞的氧化應(yīng)激狀態(tài)。以抗氧化劑NAC預(yù)處理后細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度明顯減弱，說明NAC可減少PM2.5誘導(dǎo)的ROS生成，見圖2。

Figure 2.The production of ROS in the EA.hy926 cells exposed to PM2.5 for 24 h (×400).

3 PM2.5對EA.hy926細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示用25 mg/L的PM2.5作用于EA.hy926細(xì)胞，24 h后即可檢測到凋亡細(xì)胞數(shù)增多，隨著PM2.5濃度的增加，細(xì)胞凋亡明顯增多，當(dāng)PM2.5作用濃度為100 mg/L時，凋亡率是對照組的近4倍。實驗還顯示用NAC預(yù)處理后再給予PM2.5染毒可以減輕細(xì)胞凋亡，與對應(yīng)濃度的PM2.5組比較細(xì)胞凋亡率明顯下降，見圖3。

Figure 3.Apoptosis of EA.hy926 cells induced by PM2.5 for 24 h detected by flow cytometry with Annexin V-FITC/PI staining. Mean±SD. n=3. *P<0.05, **P<0.01 vs control group; ##P<0.01 vs 100 mg/L PM2.5 group.

4 PM2.5對EA.hy926細(xì)胞凋亡信號分子的影響

PM2.5作用于EA.hy926細(xì)胞24 h后，與對照組相比，胞漿中的Cyt-C含量明顯增高，同時cleaved caspase-9和cleaved caspase-3增加。實驗中發(fā)現(xiàn)用抗氧化劑NAC預(yù)處理可以抑制PM2.5引起的上述信號分子改變，說明氧化應(yīng)激參與了PM2.5引起的細(xì)胞凋亡，見圖4。

討 論

Figure 4.The levels of apoptosis-related proteins in the EA.hy926 cells exposed to PM2.5 for 24 h. Mean±SD. n=3. *P<0.05, **P<0.01 vs control group; #P<0.05， ##P<0.01 vs 100 mg/L PM2.5 group.

近年來，PM對心血管系統(tǒng)的影響逐漸被研究者所認(rèn)識[2-5]。流行病學(xué)和臨床觀察顯示空氣動力學(xué)直徑小于2.5 μm的PM2.5升高可使包括動脈粥樣硬化、心律失常和高血壓在內(nèi)的多種心血管疾病的發(fā)病率明顯增高[8-9]，而降低PM2.5濃度則可以減緩動脈中層硬化(動脈粥樣硬化的前期病變)的進(jìn)程[10]，因此目前PM2.5 已被美國心血管協(xié)會認(rèn)為是動脈粥樣硬化發(fā)病的危險因素之一。

以往認(rèn)為PM2.5主要通過造成肺部損傷引起全身炎癥性反應(yīng)來間接影響心血管系統(tǒng)功能[6]，然而近年來有研究在小鼠體內(nèi)證實PM2.5除滯留在肺組織外，還可以借助巨噬細(xì)胞或上皮細(xì)胞間隙進(jìn)入血液循環(huán)[11]，據(jù)此有研究者提出PM2.5對心血管系統(tǒng)的直接毒性作用，即PM2.5可能通過直接接觸血管內(nèi)皮細(xì)胞引起其功能改變或損傷最終促進(jìn)心血管系統(tǒng)疾病的發(fā)生[3, 12]。目前有部分報道提出PM2.5可引起內(nèi)皮細(xì)胞損傷，如萬強(qiáng)等[13]證實廣州等地的PM2.5可造成內(nèi)皮細(xì)胞損傷，王菲菲等[14]證實燃煤來源的PM2.5能抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，但上述實驗僅報道了PM2.5對細(xì)胞活性的抑制效果，對于PM2.5的作用機(jī)制并未進(jìn)行探討。同時為了避免PM2.5因采集地區(qū)和采集時間不同而造成的實驗誤差，本實驗購買了由美國標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院提供的PM2.5作為研究對象，該PM2.5作為標(biāo)準(zhǔn)品或?qū)φ掌繁挥迷诙鄠€有關(guān)PM2.5毒性的體內(nèi)外實驗中[15-16]。實驗采用CCK-8法也證實PM2.5可以降低血管內(nèi)皮細(xì)胞EA.hy926細(xì)胞的活力，和上述研究結(jié)論一致。在此基礎(chǔ)上，我們進(jìn)一步采用流式細(xì)胞術(shù)觀察了PM2.5對血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果顯示PM2.5處理組血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡明顯強(qiáng)于對照組，在實驗所用的最高濃度時細(xì)胞凋亡率是對照組的近4倍，證明引起細(xì)胞凋亡是PM2.5損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞的主要方式之一。

血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡是多種心血管疾病發(fā)生的基礎(chǔ)。線粒體通路是各種細(xì)胞毒性物質(zhì)引起細(xì)胞凋亡主要途徑[17]。其中主要步驟包括線粒體膜通透性增加，細(xì)胞Cyt-C釋放到胞漿中，然后Cyt-C與凋亡蛋白酶激活因子結(jié)合，并募集caspase-9形成凋亡小體，caspase-9被激活后進(jìn)而裂解激活下游的凋亡執(zhí)行蛋白caspase-3，破壞細(xì)胞最終引起細(xì)胞凋亡。我們采用Western blot法證實PM2.5作用后細(xì)胞胞漿內(nèi)Cyt-C的含量明顯增高，caspase-9和caspase-3活化增加，說明線粒體途徑可能是PM2.5引起細(xì)胞凋亡的機(jī)制之一。

氧化應(yīng)激是線粒體損傷的常見原因，2015年Lawal等[18]報道PM2.5可上調(diào)血管內(nèi)皮細(xì)胞ROS生成。我們用熒光標(biāo)記法在顯微鏡下見到PM2.5刺激后血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)熒光染色明顯增強(qiáng)，說明細(xì)胞內(nèi)氧自由基產(chǎn)生增多，與其研究結(jié)果相一致。據(jù)此我們推測PM2.5可能通過誘導(dǎo)氧自由基生成進(jìn)而損傷線粒體，使其通透性增加引起Cyt-C釋放到細(xì)胞漿內(nèi)，從而啟動線粒體通路導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。為了證實該推測，實驗進(jìn)一步采用NAC作為氧自由基清除劑進(jìn)行了研究[19]。熒光染色結(jié)果顯示加入NAC明顯抑制了PM2.5誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞氧自由基生成，同時NAC組與PM2.5組比較血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡顯著下降，胞漿Cyt-C含量降低、caspase-9和caspase-3活化減少，說明減少氧自由基生成可以抑制PM2.5引起的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，證實了PM2.5誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡與氧化應(yīng)激相關(guān)。

綜上所述，本實驗發(fā)現(xiàn)PM2.5能夠造成血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激，從而通過線粒體途徑激活caspase-3誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，這可能是其造成心血管毒性的機(jī)制之一，實驗同時證實抑制細(xì)胞的氧自由基生成可以保護(hù)PM2.5造成的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，為防治PM2.5相關(guān)心血管疾病提供了研究思路。此外，由于本實驗是采用體外細(xì)胞模型，將PM2.5直接施加于內(nèi)皮細(xì)胞上來觀察PM2.5的毒性作用，這種模型雖然是目前體外研究中常用的方法，但可能和體內(nèi)并不完全一致，因此我們在后繼研究中擬采用PM2.5呼吸道吸入的方式建立PM2.5染毒動物模型來進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

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(責(zé)任編輯： 盧 萍， 羅 森)

Oxidative stress and apoptosis in endothelial cells exposed to PM2.5

WANG Fang1, LI Yan2, LU Xin-shuo1, YANG Jie-bo1, LIU Fang-fang2, YU Xue-song1, LI Ming1

(1SchoolofBasicCourses,GuangdongPharmaceuticalUniversity,2SchoolofBasicMedicalScience,GuangzhouUniversityofChineseMedicine,Guangzhou510006,China.E-mail:Lim99011@163.com)

AIM: To study the toxicity of PM2.5 in the endothelial cells by investigating the induction of reactive oxygen species (ROS) and apoptosis in EA.hy926 cells exposed to PM2.5. METHODS: The endothelial cell line EA.hy926 was culturedinvitroand exposed to PM2.5 at different concentrations for 24 h. The cell viability was measured by CCK-8 assay and the generation of intracellular ROS was stained with DCFH-DA. The cell apoptosis was analyzed by flow cytometry with Annexin V-FITC/PI staining, and the protein levels of cytochrome C, caspase 9 and caspase 3 was detected by Western blot. RESULTS: After the treatment with PM2.5, the viability of the EA.hy926 cells was decreased markedly and the production of ROS was increased significantly. PM2.5 exposure upregulated the expression of cytoplasm cytochrome C and activated caspase-9 and caspase-3, resulting in the increase of the cell apoptosis significantly. The ROS generation was directly involved in PM2.5-mediated endothelial cell apoptosis asN-acetyl-L-cysteine pretreatment abolished both ROS production and cell apoptosis induced by PM2.5. CONCLUSION: PM2.5 induces oxidative stress and apoptosis in the vascular endothelial cells, which may be one of the mechanisms that PM2.5 influences the function of cardiovascular system.

PM2.5; Endothelial cells; Oxidative stress; Apoptosis

1000- 4718(2017)03- 0423- 05

2016- 10- 12

2016- 11- 01

廣東省科技計劃(No. 2014A020212266；No. 2016A020215156)

△通訊作者 Tel: 020-39352194； E-mail: Lim99011@163.com

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.03.007