楊 迎， 郭云飛， 翟旭雯， 張 研， 李 盼， 張 莉， 吳博威， 劉清華△

(山西醫(yī)科大學 1病理生理學教研室， 2生理學教研室，山西 太原 030001; 3山西省兒童醫(yī)院，山西 太原 030013)

心肌內(nèi)向整流鉀通道激動劑抑制異丙腎上腺素所致大鼠心室重構(gòu)*

楊 迎1， 郭云飛1， 翟旭雯2， 張 研1， 李 盼1， 張 莉3， 吳博威2， 劉清華1△

(山西醫(yī)科大學1病理生理學教研室，2生理學教研室，山西 太原 030001;3山西省兒童醫(yī)院，山西 太原 030013)

目的： 觀察和探討內(nèi)向整流鉀通道(IK1)激動劑鹽酸扎考必利(zacopride， Zac)對異丙腎上腺素(isoproterenol，Iso)所致心室重構(gòu)的影響及作用機制。方法: SD大鼠隨機分為正常對照組、Iso模型組、Zac干預組、Zac+氯喹干預組和卡托普利陽性對照組。腹腔注射異丙腎上腺素3 mg/kg，每天1次，連續(xù)給藥10 d，觀測各組全心質(zhì)量/體質(zhì)量比和左心室質(zhì)量/體質(zhì)量比。用全細胞膜片鉗技術(shù)檢測大鼠心室肌細胞電壓門控鈣電流(ICa-L)、靜息膜電位(RMP)及動作電位時程(APD)的變化。選用新生1～3 d的SD乳鼠，用0.08%胰蛋白酶和0.04% Ⅱ型膠原酶消化心臟組織，經(jīng)差速貼壁法和5-溴脫氧尿嘧啶核苷純化心肌細胞后隨機分成正常對照組、Iso模型組、Zac干預組、Zac+BaCl2干預組和Zac+氯喹干預組，培養(yǎng)24 h后用激光共聚焦顯微鏡檢測心肌細胞內(nèi)游離鈣離子濃度。結(jié)果: Iso模型組與正常對照組比較，全心肥厚指數(shù)、左心室肥厚指數(shù)明顯增加，膜片鉗結(jié)果提示RMP減小，APD明顯延長；Zac干預組明顯抑制心肌肥大，并增大RMP，縮短APD。同時應用低劑量IK1抑制劑氯喹可明顯抑制Zac的抗心室重構(gòu)作用，并逆轉(zhuǎn)Zac對RMP和APD影響。在乳鼠心肌細胞，Iso可使細胞表面積增大，細胞內(nèi)[Ca2+]i增高；Zac干預后細胞形態(tài)恢復至正常或接近正常水平，并顯著減輕鈣超載。IK1阻斷劑BaCl2和氯喹可阻斷Zac的效應。結(jié)論: IK1選擇性激動劑Zac明顯抑制異丙腎上腺素所致的心室重構(gòu)，其機制可能為增強IK1，進而增大RMP，縮短APD，從而阻斷心肌細胞內(nèi)鈣超載依賴的信號通路。

內(nèi)向整流鉀通道； 異丙腎上腺素； 鈣超載； 心室重構(gòu)； 扎考必利

心室重構(gòu)是心室肌受到損傷時發(fā)生的以心肌細胞肥大及間質(zhì)纖維化為特點的適應性反應，最終將造成心室形態(tài)結(jié)構(gòu)改變和心力衰竭。在心室重構(gòu)的進程中，往往伴有某些離子通道、交換體和離子泵的變化，即電重構(gòu)，如心肌電壓門控鈣電流(ICa-L)的變化，瞬時外向鉀電流(transient outward potassium current, Ito)、ATP敏感性鉀電流(ATP sensitive potassium current, IKATP)和內(nèi)向整流鉀電流(inward rectifier potassium current, IK1)下調(diào)，鈉鈣交換電流(Na+-Ca2+exchanger current, INa/Ca)增強及鈉鉀泵的抑制等[1-2]。近年來的研究顯示，電重構(gòu)不僅是心肌肥大的結(jié)果，還可先于組織重構(gòu)發(fā)生，進而影響組織重構(gòu)過程[3]，這提示研究者需重新探究電重構(gòu)與組織重構(gòu)的關(guān)系，并嘗試將離子通道作為有效干預心室重構(gòu)的新靶點。很多文獻報道，ATP敏感鉀通道(KATP通道)在心室重構(gòu)中具有重要作用，業(yè)已證明，KATP通道激動劑顯著減輕了多種原因誘發(fā)的心室重構(gòu)[4-5]。IK1和KATP分別由Kir2.x通道和Kir6.x通道構(gòu)成，它們同屬于內(nèi)向整流鉀通道家族，而且孔道形成亞單位的分子結(jié)構(gòu)相似[6]。實驗研究還表明IK1下調(diào)是心衰心肌電重構(gòu)的重要特征[7]。因此，我們設(shè)想，IK1通道的變化同樣涉及心室重構(gòu)的過程，激動心肌IK1可能同樣具有抗心室重構(gòu)的作用。

本課題組首次報道了一個IK1通道選擇性激動劑扎考必利(zacopride, Zac)[8]。利用這個藥理學工具藥我們觀察激動心肌IK1對異丙腎上腺素(isoproterenol，Iso)所致成年大鼠心室重構(gòu)和乳鼠心肌細胞鈣超載的影響，并進一步探討IK1激動劑抗心室重構(gòu)的可能機制。

材 料 和 方 法

1 實驗動物

健康SD大鼠(軍科院實驗動物中心，合格證編號為0009841)，雄性，體重200～250 g；新生1～3 d的SD大鼠乳鼠，雌雄不限，購自山西醫(yī)科大學實驗動物中心。

2 藥品、試劑和主要儀器

Iso和Zac購自Tocris；氯喹、卡托普利(captoril)和5-溴脫氧尿嘧啶核苷(5-bromodeoxyuridine，BrdU)購自Sigma；DMEM、青霉素和鏈霉素購自HyClone；胎牛血清、胰蛋白酶和Ⅱ型膠原酶購自Gibco；其余均為國內(nèi)生產(chǎn)分析純產(chǎn)品。主要儀器為Axopatch 200B膜片鉗放大器(Molecular Devices)和FV1000激光共聚焦顯微鏡(Olympus)。

3 實驗方法

3.1 異丙腎上腺素致在體大鼠心室重構(gòu)模型的建立 8周齡大小的健康SD大鼠隨機分為6組，即正常對照(control)組、Zac組、Iso模型組、Iso+Zac組、Zac+氯喹(chloroquine, Chlo)干預(Iso+Zac+Chlo)組和卡托普利陽性對照(Iso+captopril)組。除control組和Zac組外，其余各組動物均腹腔注射異丙腎上腺素(3 mg·kg-1·d-1)，control組腹腔注射等量的生理鹽水，Zac組和Iso+Zac組腹腔注射15 μg/kg Zac，Zac+Chlo組同時腹腔注射15 μg/kg Zac和7.5 μg/kg氯喹，卡托普利陽性對照組按100 mg·kg-1·d-1給予卡托普利。連續(xù)給藥10 d。所有大鼠均飼以常規(guī)固體飼料和自來水，于停藥24 h禁食過夜，然后觀察相應指標。

3.2 取心稱重及保存 停藥24 h禁食過夜，麻醉后快速開胸取出心臟置于4 ℃預冷的生理鹽水，由主動脈逆行沖洗心臟血液后，用雙層濾紙吸干水分，電子天平準確稱量全心質(zhì)量，去除心房及瓣膜組織，沿室間隔剪開左心室和右心室，去除大血管及心包組織，稱量左心室質(zhì)量，最后計算全心質(zhì)量/體質(zhì)量比和左心室質(zhì)量/體質(zhì)量比。

3.3 分離單個大鼠心室肌細胞 術(shù)前15 min腹腔靜脈注射肝素，戊巴比妥鈉(65 mg/kg)麻醉后頸動脈放血，迅速開胸取出心臟，置于4 ℃用100%氧氣飽和的無鈣臺氏液中修剪，然后將心臟懸掛在Langendorff灌流裝置上經(jīng)主動脈逆行灌流。先用無鈣臺氏液灌流8～10 min，再用酶液循環(huán)灌流15～20 min。 灌流過程中保持37 ℃恒溫，灌流壓6.86 kPa，并持續(xù)通以100%氧氣。待心室肌組織變大、變軟后將其剪碎，置于KB 液中輕輕吹打得到分散的心室肌細胞，經(jīng)150 μm孔徑的濾網(wǎng)過濾后保存于KB液中，室溫放置2～3 h進行實驗。

3.4 全細胞膜片鉗技術(shù)記錄ICa-L、靜息膜電位(res-ting membrane potential, RMP)及動作電位(actin potential, AP) 實驗前先將存放于高鉀KB液中的細胞逐步復鈣。取幾滴細胞懸液加入細胞池(約1 mL)，平放在連有微操縱儀的倒置顯微鏡上靜置10 min，待細胞充分貼壁后，用臺氏液灌流，速度約2 mL/min。電極用玻璃毛細管經(jīng)微電極拉制儀(Narishige)分2步拉制而成，充灌電極內(nèi)液后，電阻約2～5 MΩ。選取橫紋清晰的心肌細胞進行實驗。形成高阻抗封接后，用負壓破膜，進行全細胞記錄。離子電流信號經(jīng)Axopatch 200B膜片鉗放大器、Digidata 1322A模數(shù)轉(zhuǎn)換器及pCLAMP 8.0采集、貯存及分析。電壓鉗方式下進行全細胞ICa-L記錄，電流鉗方式下記錄RMP及AP。

3.5 乳鼠心肌細胞的分離、培養(yǎng)和建立心肌重構(gòu)細胞模型 75%乙醇浸泡消毒乳鼠，立即取出心臟并放入冰冷的PBS液中，切取心室，初步洗去心室內(nèi)的血液后，轉(zhuǎn)移入EP管中，剪成(1～3) mm×1 mm×1 mm的碎塊，靜置5 min后，棄上清，加入0.04% Ⅱ型膠原酶液和0.08%胰蛋白酶(按照2∶1體積臨時混和，總量隨心臟組織多少調(diào)整)，37 ℃消化6～8 min，靜置后吸出上清置于50 mL離心管(預先加入25 mL含15% FBS的DMEM培養(yǎng)基)中，終止胰酶作用。再次加入混合酶液，重復以上步驟，直至組織塊基本消化干凈。將所有收集的細胞懸液800 r/min 離心10 min收集細胞，重懸后200目濾網(wǎng)過濾，細胞種植于培養(yǎng)瓶中進行預貼壁培養(yǎng)。2 h后收集未貼壁心肌細胞懸液以適當密度種植于6孔板，加BrdU至終濃度為0.1 mmol/L抑制非心肌細胞增殖，血清饑餓48 h后按組加入藥物，原代培養(yǎng)的心肌細胞分成5組：control組、Iso(1 μmol/L)組、Iso+Zac(1 μmol/L)組、Iso+Zac+BaCl2(1 μmol/L)組和Iso+Zac+Chlo(0.3 μmol/L)組。

3.6 加載熒光染料及鈣成像 心肌細胞用PBS液沖洗2遍，用100 μL含5 μmol/L鈣離子探針Fluo-4/AM滴于蓋玻片上，37 ℃避光40 min，PBS液沖洗玻片3遍，洗去多余染料，保留少許PBS液平衡細胞10 min，于20 min內(nèi)進行細胞內(nèi)Ca2+濃度(intracellular Ca2+concentration,[Ca2+]i)檢測。加載好熒光染料的細胞置于共聚焦激光掃描鏡的載物臺上，進行形態(tài)觀測，隨機選取心肌細胞，計算心肌細胞表面積和測定胞內(nèi)游離鈣的熒光值。

4 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)或均數(shù)±標準誤(mean±SEM)表示，采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 Zac對在體異丙腎上腺素所致的心室重構(gòu)的影響

異丙腎上腺素可導致心臟體積增大，全心肥厚指數(shù)和左心室肥厚指數(shù)顯著升高，而Zac可有效逆轉(zhuǎn)異丙腎上腺素所致心室重構(gòu)，其效應與公認的抗重構(gòu)藥物卡托普利相似。應用低劑量氯喹選擇性阻斷IK1可消除Zac的抗心室重構(gòu)作用，表明Zac的抗重構(gòu)作用是通過其激動IK1通道介導的，見圖1、表1。

Figure 1.The effects of zacopride (Zac) on isoproterenol (Iso)-induced cardiac hypertrophy in the rats.

表1 Zac對異丙腎上腺素所致心室重構(gòu)的影響

BW: body weight; HW: heart weight; LVW: left ventricular weight; Chlo: chloroquine.**P<0.01vscontrol;△△P<0.01vsIso;##P<0.01vsIso+Zac.

2 Zac對心室肌細胞RMP和動作電位時程(action potential duration, APD)的影響

長期應用異丙腎上腺素可導致心室肌細胞發(fā)生電重構(gòu)，RMP減小，細胞膜去極化，APD明顯延長。應用Zac干預后可使RMP增大甚至恢復至生理水平，并縮短APD(P< 0.01)。小劑量氯喹選擇性阻斷IK1可消除Zac的作用，表明Zac抗電重構(gòu)作用是通過其激動IK1通道介導的，見圖2、表2。

Figure 2.The effects of zacopride (Zac) on the resting membrane potential (RMP) and the action potential duration (APD) in isoproterenol (Iso)-treated rats. APD50 and APD90: action potential duration at 50% and 90% of repolarization, respectively; Chlo: chloroquine. Mean±SD. n=6. **P<0.01 vs Iso； ##P<0.01 vs Iso+Zac+Chlo.

表2 Zac對異丙腎上腺素模型大鼠心室肌細胞AP形態(tài)的影響

APA: action potential amplitude; RMP: resting membrane potential; Iso: isoproterenol; Chlo: chloroquine.**P<0.01vscontrol；##P<0.01vsIso+Zac.

3 長期單純應用Zac對ICa-L的影響

成年健康SD大鼠每日腹腔注射Zac，連續(xù)10 d，觀察其對大鼠心室肌細胞ICa-L的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，長期應用Zac對ICa-L無明顯影響。這一結(jié)果與我們前期在大鼠心室肌細胞上急性給予Zac不影響ICa-L的結(jié)果一致[8]，見圖3。

4 Zac對異丙腎上腺素所致乳鼠心室重構(gòu)的影響

鏡下可見異丙腎上腺素模型組的心肌細胞明顯增大，Zac干預后細胞形態(tài)恢復至正?；蚪咏Ｋ?。這一結(jié)果與Zac對在體異丙腎上腺素所致的心室重構(gòu)的抑制作用相一致。

利用激光共聚焦測定胞內(nèi)鈣濃度的結(jié)果表明，Zac使肥厚模型組心肌細胞內(nèi)升高了的Ca2+濃度顯著降低，而低濃度BaCl2和氯喹作為IK1阻斷劑可逆轉(zhuǎn)Zac的抗重構(gòu)作用，即激動IK1可通過抑制Ca2+激活的致心室重構(gòu)的信號通路，產(chǎn)生顯著的抗心室重構(gòu)作用，見圖4、5。

Figure 3.No effect of zacopride on ICa-L in rat cardiomyocytes was observed. Mean±SD. n=6.

Figure 4.Zacopride (Zac) inhibited isoproterenol (Iso)-induced intracellular calcium overload in cultured neonatal rat cardiomyocytes. The scale bar=50 μm.

Figure 5.The effects of zacopride (Zac) on isoproterenol (Iso)-induced remodeling and calcium overload in neonatal rat cardiomyocytes. Chlo: chloroquine. Mean±SEM. n=6. *P<0.05, **P<0.01 vs control; △P<0.05,△△P<0.01 vs Iso； #P<0.05, ##P<0.01 vs Iso+Zac.

討 論

大規(guī)模動物實驗和臨床研究已經(jīng)證實，β受體阻滯劑、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑、血管緊張素Ⅱ受體阻滯劑、醛固酮拮抗劑、鈣通道阻滯劑、內(nèi)皮素受體拮抗劑等藥物能改善心室重構(gòu)，其作用機制主要涉及減輕心臟負荷、改善心肌收縮和舒張功能；抑制誘導心肌細胞肥大或間質(zhì)纖維化的基因表達或體液因子釋放等[9-11]。然而，由心室重構(gòu)引發(fā)的心力衰竭及惡性心律失常的死亡率仍然較高[9]。

肥大心肌細胞共同的電生理異常是APD延長，APD延長可增加ICa-L通道開放時間，[Ca2+]i升高[12]。Ca2+激活的信號通路被認為在心室重構(gòu)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。電壓門控鈣通道阻斷劑可通過減少胞外鈣離子內(nèi)流，發(fā)揮顯著的抗心肌肥大效應[13]。但考慮到Ca2+對心肌細胞收縮的重要作用，阻斷鈣通道可能會降低心泵功能，從而限制其臨床使用。尋找新的離子通道干預靶點，從而改善心室重構(gòu)將是未來心血管藥理學領(lǐng)域的重要方向。Fauconnier等[14]證實心衰大鼠心室肌細胞內(nèi)Ca2+濃度升高可抑制IK1。陳依春等[15]亦發(fā)現(xiàn)異丙腎上腺素致心肌肥厚模型大鼠心室肌IK1明顯被抑制。IK1下調(diào)亦是心衰心肌電重構(gòu)的重要特征[7]。因此，我們將IK1通道作為抗心律失常干預的新靶點。本研究首次提出上調(diào)心肌細胞IK1進而增大靜息膜電位，可改善心肌細胞電重構(gòu)進而逆轉(zhuǎn)結(jié)構(gòu)重構(gòu)。

在本研究中，長期給予異丙腎上腺素既導致大鼠心室結(jié)構(gòu)重構(gòu)，心肌細胞體積肥大，重量增加；也引起明顯的電重構(gòu)，表現(xiàn)為RMP降低，細胞膜去極化，APD明顯延長，兩者均可導致細胞膜上電壓門控Ca2+內(nèi)流增多，從而引起細胞內(nèi)鈣超載。[Ca2+]i增多可以進一步觸發(fā)Ca2+激活的信號通路，相關(guān)蛋白合成增加，導致心室結(jié)構(gòu)重構(gòu)。Zac作為IK1特異性激動劑可減輕異丙腎上腺素誘發(fā)的心肌細胞鈣超載并逆轉(zhuǎn)心室重構(gòu)；氯喹作為IK1阻斷劑與Zac聯(lián)合應用可以消除Zac的效應。這表明Zac的抗心室重構(gòu)和減輕鈣超載作用都是由其激動IK1介導的。鑒于Zac自身并不引起電壓門控Ca2+電流的明顯變化，我們分析Zac減輕鈣超載的機制不是直接抑制ICa-L，而是通過激動IK1實現(xiàn)的。通過激動IK1，Zac增大RMP，縮短APD，這兩者均可抑制電壓門控Ca2+通道開放，Ca2+內(nèi)流減少，鈣超載減輕，進而抑制Ca2+激活的信號轉(zhuǎn)導通路，這可能是IK1激動劑抗心室重構(gòu)的主要機制。

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(責任編輯： 林白霜， 羅 森)

Cardiac IK1agonist inhibits isoproterenol-induced ventricular remodeling in rats

YANG Ying1, GUO Yun-fei1, ZHAI Xu-wen2, ZHANG Yan1, LI Pan1, ZHANG Li3, WU Bo-wei2, LIU Qing-hua1

(1DepartmentofPhysiopathology,2DepartmentofPhysiology,ShanxiMedicalUniversity,Taiyuan030001,China;3Children’sHospitalofShanxi,Taiyuan030013,China.E-mail:liuqh20041206@163.com)

AIM: To investigate the effect of inward rectifier potassium channels (IK1) agonist zacopride on isoproterenol (Iso)-induced ventricular remodeling and the involved mechanisms.METHODS: SD rats were randomly divided into 5 groups: control, Iso model, Iso+zacopride, Iso+zacopride+chloroquine and Iso+captopril groups. The model of cardiac hypertrophy was developed by intraperitoneal injection of Iso (3 mg·kg-1·d-1for 10 d) and verified by determination of heart-to-body weight ratio and left ventricle-to-body weight ratio. The changes of voltage-gated calcium current (ICa-L), resting membrane potential (RMP) and action potential duration (APD) of the rat ventricular myocytes were detected by the technique of whole-cell patch clamp. Neonatal rat cardiomyocytes were isolated by 0.08% trypsin and 0.04% type II collagenase, and purified using differential adherence method and 5-bromodeoxyuridine. Cultured neonatal rat cardiomyocytes were randomly divided into 5 groups: control, Iso, Iso+zacopride, Iso+zacopride+BaCl2and Iso+zacopride+chloroquine groups. After harvested for 24 h, the [Ca2 +]iof the cardiomyocytes was recorded using a laser confocal scanning microscope.RESULTS: Compared with control group, the whole heart hypertrophic index and left ventricular hypertrophic index in Iso group were increased significantly (P<0.01). Patch clamp data suggested that RMP was reduced, and APD was obviously prolonged. Zacopride treatment obviously inhibited myocardial hypertrophy, increased the RMP and shortened APD (P<0.01). At the same time, application of low dose of IK1atagonist chloroquine reversed the effect of zacopride. In cultured neonatal rat cardiomyocytes, Iso increased the cell area and [Ca2 +]i. Zacopride treatment restored the hypertrophic morphology of the cells to normal or nearly normal levels, and significantly attenuated calcium overload. IK1blocker, BaCl2or chloroquine, reversed the effect of zacopride.CONCLUSION: IK1agonist zacopride significantly inhibits left ventricular remodeling caused by isoproterenol. Via enhancing IK1, thereafter increasing RMP and shor-tening APD, zacopride might decrease Ca2+influx and inhibit intracellular calcium overload-dependent signaling pathway.

Inward rectifier potassium channels; Isoproterenol; Calcium overload; Ventricular remodeling; Zacopride

1000- 4718(2017)03- 0399- 06

2016- 10- 12

2016- 11- 24

國家自然科學基金資助項目(No. 31200864)；山西省回國留學人員科研資助項目(No. 2016-059)

△通訊作者 Tel: 13753119195; E-mail: liuqh20041206@163.com

R541.7； R363.2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.03.003