王克猛 魏世平 牛長(zhǎng)磊 王海燕 牛軍強(qiáng) 孟慶聚

·論著·

CyclinD1及CDK4在軟骨肉瘤診斷中的應(yīng)用

王克猛 魏世平 牛長(zhǎng)磊 王海燕 牛軍強(qiáng) 孟慶聚

目的 觀察CyclinD1及CDK4蛋白在軟骨肉瘤中的陽性表達(dá)狀態(tài)，探討CyclinD1及CDK4蛋白在軟骨肉瘤發(fā)生發(fā)展中的機(jī)制。方法 以SP法檢測(cè)腫瘤組織中CyclinD1及CDK4蛋白表達(dá)的情況。結(jié)果 軟骨肉瘤組織中CyclinD1、CDK4同時(shí)高表達(dá)，兩者呈正相關(guān)關(guān)系(P<0.05)。結(jié)論CyclinD1及CDK4蛋白均呈高表達(dá)，在軟骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展中起互相協(xié)同，使腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)增強(qiáng)，對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

軟骨肉瘤；CyclinD1蛋白；CDK4蛋白；免疫組織化學(xué)

軟骨肉瘤(chondrosarcoma，CHS)起源于軟骨組織的惡性腫瘤，Evans[1]根據(jù)軟骨肉瘤的惡性程度分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級(jí)。軟骨肉瘤的治療一般是手術(shù)局部或廣泛切除，使用放療、化療等輔助治療手段，效果不明顯，手術(shù)切除容易發(fā)生復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移，預(yù)后往往很差[2]。本研究通過免疫組織化學(xué)Sp法研究軟骨肉瘤中CyclinD1及CDK4的表達(dá)情況，探討其在軟骨肉瘤中表達(dá)的臨床意義,進(jìn)一步研究不同分化程度的軟骨肉瘤細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移之間的變化規(guī)律，以期為軟骨肉瘤的分子靶向診斷提供新的標(biāo)記物。

1 材料與方法

1.1 材料 隨機(jī)選取河北省醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院病理科、邢臺(tái)醫(yī)專第一附屬醫(yī)院病理科2008年3月至2011年10月手術(shù)切除的存檔病例，經(jīng)病理診斷，明確為軟骨肉瘤。復(fù)習(xí)原切片及免疫組織化學(xué)資料，根據(jù)2002年WHO軟組織與骨腫瘤病理學(xué)和遺傳學(xué)分類標(biāo)準(zhǔn)[3]，經(jīng)兩位資深骨病理醫(yī)師閱片確定，篩選出普通型軟骨肉瘤46例，其中組織學(xué)分級(jí)Ⅰ級(jí)16例、Ⅱ級(jí)20例、Ⅲ級(jí)10例；患者年齡5～83歲，中位年齡43.7歲；男25例，女21例；發(fā)生部位：股骨27例，髖骨(髂骨、恥骨、坐骨)11例，其他部位8例。患者均為散發(fā)病例，且為初次手術(shù)，術(shù)前均未經(jīng)放療或化療。作為對(duì)照另外選取18例骨軟骨瘤及10例正常軟骨組織。

1.2 方法 所有標(biāo)本均連續(xù)切4 μm厚切片，貼于防脫玻片，用Sp法進(jìn)行免疫組織化學(xué)法染色。鼠抗人CyclinD1單克隆抗體、鼠抗人CDK4單克隆抗體試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)公司，免疫組織化學(xué)染色按試劑盒操作說明進(jìn)行，染色過程中設(shè)陽性和陰性對(duì)照，陽性對(duì)照用已知陽性切片，陰性對(duì)照采用PBS代替一抗。

1.3 免疫組化染色結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn) CyclinD1、CDK4蛋白陽性表達(dá)為棕褐色顆粒，主要表達(dá)于細(xì)胞核內(nèi)，分布呈現(xiàn)局灶性或彌漫性。顯微鏡下400×高倍鏡下隨機(jī)觀察10個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)腫瘤細(xì)胞中的陽性細(xì)胞數(shù)，觀察中向同一方向移動(dòng)切片，保證觀察切片不重復(fù)，不重疊。標(biāo)本無陽性反應(yīng)細(xì)胞或陽性反應(yīng)細(xì)胞率小于10%為陰性；標(biāo)本陽性細(xì)胞呈淡棕黃色或陽性反應(yīng)細(xì)胞率介于10%～50%為陽性(+)；標(biāo)本陽性細(xì)胞呈深棕黃色，且陽性反應(yīng)細(xì)胞率大于50%為強(qiáng)陽性(++)[4]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1CyclinD1蛋白在正常軟骨組織、骨軟骨瘤及軟骨肉瘤中的表達(dá)情況CyclinD1蛋白陽性表現(xiàn)為細(xì)胞核內(nèi)有棕黃色顆粒。10例正常軟骨組織中呈弱陽性1例，陰性9例；在5例骨軟骨瘤及28例軟骨肉瘤中CyclinD1呈陽性表達(dá)，陽性率分別為27.8%(5/18)、60.9%(28/46)。在骨軟骨瘤及軟骨肉瘤中CyclinD1的陽性表達(dá)率明顯高于正常軟骨組織(P<0.05)，而骨軟骨瘤中CyclinD1的陽性表達(dá)率明顯低于軟骨肉瘤(P<0.05)。在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ不同組織學(xué)分級(jí)的軟骨肉瘤中呈陽性表達(dá)分別有6、13及9例，陽性率分別為37.5%(6/16)、65%(13/20)和90%(9/10)，陽性表達(dá)率與分化程度呈反比(P<0.05)。見圖1,表1、2。

IHC×400IHC×100

圖1 CyclinD1在骨軟骨瘤及軟骨肉瘤中的表達(dá)HE

表2 CyclinD1在不同分化程度的軟骨肉瘤中的表達(dá) 例

2.2CDK4在正常軟骨組織、骨軟骨瘤及軟骨肉瘤中的表達(dá)情況CDK4蛋白陽性表現(xiàn)為細(xì)胞核內(nèi)有棕黃

色顆粒。在正常軟骨組織、骨軟骨瘤及軟骨肉瘤中CDK4陽性表達(dá)率分別為20%(2/10)、38.9%(7/18)、63%(29/46)。在骨軟骨瘤及軟骨肉瘤中的陽性表達(dá)率明顯高于正常軟骨組織(P<0.05)，而軟骨肉瘤中的陽性表達(dá)率明顯高于骨軟骨瘤(P<0.05)。CDK4蛋白的陽性表達(dá)率在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三級(jí)中分別為31.3%(5/16)、75%(15/20)和90%(9/10)，陽性表達(dá)率與分化程度呈反比(P<0.05)。見圖2,表3、4。

IHC×400IHC×100

圖2 CDK4在正常軟骨組織及軟骨肉瘤中的表達(dá)HE

表4 CDK4在不同分化程度的軟骨肉瘤中的表達(dá) 例

2.3CyclinD1與CDK4蛋白的相關(guān)性及與軟骨肉瘤主要臨床病理資料間關(guān)系CyclinD1及CDK4同時(shí)高表達(dá)，兩者呈正相關(guān)關(guān)系(P<0.05)，CyclinD1及CDK4的表達(dá)與患者的年齡、性別、腫瘤發(fā)生部位及大小差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表5、6。

表5 CyclinD1和 CDK4的相關(guān)性分析 例

表6 CyclinD1、CDK4的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 例

3 討論

細(xì)胞周期素(Cyclins)-細(xì)胞周期素依賴性激酶(Cyclindependentkinases,CDKs)-細(xì)胞周期素依賴性激酶抑制因子(Cyclindependentkinaseinhibitors,CKIs)是調(diào)控正常哺乳動(dòng)物細(xì)胞周期的網(wǎng)絡(luò)。處于調(diào)控中心位置是CDKs，起正調(diào)節(jié)的是周期素，起負(fù)調(diào)節(jié)作用的是CKIs。在細(xì)胞周期中，G1/S期調(diào)控點(diǎn)；S期調(diào)控點(diǎn)；G2期調(diào)控點(diǎn)和中/后期調(diào)控點(diǎn)都是非常關(guān)鍵的過渡點(diǎn)。尤其G1/S調(diào)控點(diǎn)，可以調(diào)控細(xì)胞周期的時(shí)間。細(xì)胞周期中的許多因子參與腫瘤細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化過程中，特別是Gl期相關(guān)的各種因子，可單獨(dú)或協(xié)同促進(jìn)或抑制惡性腫瘤細(xì)胞的發(fā)生和發(fā)展。

1991年，Motkura等[5]發(fā)現(xiàn)了CyclinD1基因，該基因定位于11ql3染色體，其主要功能是與CDK結(jié)合并激活之，作為G1期細(xì)胞周期素，促使細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期。CyclinD1作為蛋白激酶復(fù)合體的調(diào)節(jié)亞基，使損傷的DNA得不到修復(fù)。其過度表達(dá)可使細(xì)胞增殖異常而導(dǎo)致腫瘤形成，因而被認(rèn)為原癌基因。

CDKs家族是細(xì)胞周期調(diào)節(jié)機(jī)制的中心，可以被細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)作為正性調(diào)節(jié)因子激活，也可以被細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子(CDKI)抑制，CDKs、Cyclin、CDKI這三種分子的表達(dá)和相互作用很大程度上決定了細(xì)胞周期的進(jìn)展程度，主要在G1→S和G2→M兩個(gè)轉(zhuǎn)折點(diǎn)進(jìn)行自控性調(diào)節(jié)，而CDKs的活性表達(dá)及調(diào)控是這種轉(zhuǎn)變控制裝置的核心。在哺乳動(dòng)物中已發(fā)現(xiàn)的CDKs至少達(dá)7種，分別命名為CDC2 (CDK1)、CDK2～7，CDK4蛋白是CDKs蛋白家族中的重要成員，作為細(xì)胞周期G1期的調(diào)控因子，在細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的過程中起著至關(guān)重要的作用[6,7]，對(duì)于細(xì)胞的增殖和分化[8]的調(diào)節(jié)起重要作用。CyclinD1的基因擴(kuò)增或蛋白過度表達(dá)在乳腺癌、卵巢癌、甲狀旁腺癌、胃腸癌、食管癌、非小細(xì)胞肺癌、骨肉瘤、口腔癌、肝細(xì)胞癌、骨肉瘤等多種人類腫瘤組織中均有報(bào)道[9-12]。CDK4蛋白在鼻咽癌、胃癌細(xì)胞、腦星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤中有明顯擴(kuò)增或異常表達(dá)[13,14]，同時(shí)司曉輝等[4]也指出頜骨軟骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展與CDK4的過表達(dá)相關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)中，在正常軟骨組織、骨軟骨瘤及軟骨肉瘤中CyclinD1蛋白的陽性表達(dá)率逐步提高，陽性率分別為10%(1/10)、27.8%(5/18)、60.9%(28/46)，軟骨肉瘤與骨軟骨瘤陽性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而且CyclinD1蛋白在軟骨肉瘤中的表達(dá)隨分化程度的降低其陽性表達(dá)明顯增高(P<0.05)。CDK4在軟骨肉瘤中的陽性表達(dá)率明顯高于骨軟骨瘤(P<0.05)，而且Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ不同組織學(xué)分級(jí)中的軟骨肉瘤中陽性表達(dá)率分別為31.3%(5/16)、75%(15/20)和90%(9/10)，隨分化程度降低而逐漸增高，其陽性表達(dá)與組織學(xué)分級(jí)密切相關(guān)(P<0.05)。

綜上所述，當(dāng)細(xì)胞受到外源性增殖分裂信號(hào)刺激后，細(xì)胞周期因子CyclinD1基因表達(dá)增加，CyclinD1蛋白與CDK4蛋白結(jié)合、活化，形成以CDK4為催化亞基、CyclinD1為調(diào)節(jié)亞基的激酶復(fù)合體，促使細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，至此細(xì)胞的分裂增殖得以完成，這可能是軟骨肉瘤發(fā)生、發(fā)展的重要因素，是腫瘤細(xì)胞增殖的重要機(jī)制，可作軟骨肉瘤診斷的分子生物學(xué)標(biāo)志之一，為制訂正確合理的治療方案提供依據(jù)，那么我們通過使用CyclinD1及CDK4抑制劑，達(dá)到阻止癌細(xì)胞增殖的目的，從而為軟骨肉瘤的分子靶向治療提供依據(jù)。

1EvansHL,AyalaAG,RomsdahlMM.Prognosticfactorsinchondrosareomaofbone:aclinicopathologicanalysiswithemphasisonhistologicgrading.Cancer,1977,40:818-831.

2Artavanis-TsakonasS,MatsunoK,FortiniME.Notchsignaling.Science,1995,268:225-232.

3LeethanakulC,PatelV,GillespieJ,etal.Distinctpatternofexpressionofdifferentiationandgrowth-relatedgenesinsquamouscellcarcinomasoftheheadandneckrevealedbytheuseoflasercapturemicrodissectionandcDNAarrays.Oncogene,2000,19:3220-3224.

4 司曉輝,金巖,楊連君.細(xì)胞周期素依賴激酶4在頜骨軟骨肉瘤的表達(dá)及意義.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2000,21:929-931.

5MotkuraT,BloomT,KimHG,etal.Anovelcyelinencodedbyabell-linkedcandidateoncogene.Nature,1991,350:512.

6MalumbresM,BarbacidM.Cellcycle,CDKsandcanaer:achangingparadigm.NatRevCancer,2009,9:153-166.

7PatelP,AsbachB,ShteynE,etal.Brk/Proteintyrosinekinase6phosphorylatesp27KIPI,regulatingtheactivityofCyclinD-Cyclin-dependentkinase4.MolCellBiol,2015,35:1506-1522.

8DicksonMA.Molecularpathways:CDK4inhibitorsforcancertherapy.ClinCancerRes,2014,20:3379-3383.

9UmekitaY,OhiY,SagaraY,etal.OverexpressionofcyclinD1predictsforpoorprognosisinestrogenreceptor-negativebreastcancerpatients.IntJCancer,2002,8:415-418.

10DworakowskaD,JassemE,JassemJ,etal.PrognosticvalueofcyclinD1overexpressionincorrelationwithpRbandp53statusinnon-smallcelllungcancer(NSCLC).JCancerResClinOncol,2005,31:479-485.

11JooM,KangYK,KimMR,etal.cyclinD1overexpressioninhepatocellularcarcinoma.Liver,2001,21:89-95.

12SiX.Expressionandsignificanceofcellcycle-relatedproteinscyclinD1,CDK4,p27,E2F-1andets-1inchondrosarcomaofthejaws.OralOncol,2001,37:431-436.

13 于洪泉,趙剛,許侃,等.腦星形細(xì)胞瘤中CDK4蛋白表達(dá)及意義.中國實(shí)驗(yàn)診斷學(xué),2003,7:529-530.

14 趙英芳,田新霞,盧陽.胃癌中p16INK4a-CDK4-pRb通路蛋白表達(dá)異常.內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2005,27:271-274.

Expression and clinical significance of CyclinD1 and CDK4 in chondrosarcoma

WANGKemeng*,WEIShiping,NIUChanglei*,etal.

*DepartmentofOrthopedics,TheFirstAffiliatedHospitalofXingtaiMedicalCollege,Hebei,Xingtai054000,China

Objective To observe the expression of CyclinD1 and CDK4 proteins in chondrosarcoma,and to explore their action mechanism in pathogebesis and development of chondrosarcoma.Methods The expression levels of CyclinD1 and CDK4 protein were detected by immunohistochemistry (SP).Results The high-expression of CyclinD1 and CDK4 was found in chondrosarcoma tissues,moreover, the expression levels of CyclinD1 were positively correlated to those of CDK4 (P<0.05).Conclusion The high-expressin of CyclinD1 and CDK4 exists in chondrosarcoma tissues,which plays an important role in pathogenesis and development of chondrosarcoma.

chondrosarcoma; cyclinD1 protein; CDK4 protein; immunohistochemistry

10.3969/j.issn.1002-7386.2017.07.006

054000 河北省邢臺(tái)市，邢臺(tái)醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校第一附屬醫(yī)院骨科(王克猛、牛長(zhǎng)磊、王海燕、牛軍強(qiáng)、孟慶聚)；邢臺(tái)醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校(魏世平)

魏世平,054000 河北省邢臺(tái)市，邢臺(tái)醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校;

E-mail：weishiping2003@163.com

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1002-7386(2017)07-0985-03

2016-07-20)