張雅茹，薛 莉，左志剛，張 進(jìn)，馬征途

（內(nèi)蒙古雙奇藥業(yè)股份有限公司，內(nèi)蒙古呼和浩特 010010）

一株從青海酸奶中分離出來的嗜酸乳桿菌的分離鑒定與特性研究

張雅茹，薛 莉，左志剛，張 進(jìn)，*馬征途

（內(nèi)蒙古雙奇藥業(yè)股份有限公司，內(nèi)蒙古呼和浩特 010010）

從青海酸奶中分離鑒定出嗜酸乳桿菌，并對(duì)其進(jìn)行降血脂的研究。結(jié)合細(xì)菌形態(tài)學(xué)和16S rDNA序列同源性分析進(jìn)行鑒定，并通過檢測(cè)總膽固醇和甘油三酯的含量來確定嗜酸乳桿菌降血脂的能力。結(jié)果表明，從青海酸奶中分離出的菌株為嗜酸乳桿菌，其能降低小鼠血清中的膽固醇，可見嗜酸乳桿菌具有降血脂的功能。

嗜酸乳桿菌；分離鑒定；降血脂

嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus） 屬于乳桿菌屬，是人體腸道內(nèi)的重要微生物，與人體健康息息相關(guān)，當(dāng)其達(dá)到一定數(shù)量時(shí)，對(duì)維護(hù)腸道健康和菌群平衡起著十分重要的作用，是目前乳酸菌家族中重點(diǎn)研究與開發(fā)的益生菌之一，被視為第3代酸乳發(fā)酵劑菌種[1-2]。嗜酸乳桿菌在腸道內(nèi)發(fā)酵后，可產(chǎn)生乳酸和醋酸，能提高鈣、磷、鐵的利用率，促進(jìn)鐵和VD的吸收，產(chǎn)生VK及VB，還可以減少膽固醇的吸收，并能降低輻射對(duì)人體的傷害，已被廣泛用于發(fā)酵食品與微生態(tài)制劑[3]。

隨著國(guó)內(nèi)外眾多學(xué)者對(duì)嗜酸乳桿菌的生物學(xué)特性、功能性及應(yīng)用等方面研究的不斷深入，人們?cè)絹碓秸J(rèn)識(shí)到嗜酸乳桿菌的益生特性，含有嗜酸乳桿菌的產(chǎn)品也日益豐富，包括酸奶、膠囊、片劑、粉劑及口服液等[4]。試驗(yàn)通過對(duì)青海酸奶分離的嗜酸乳桿菌進(jìn)行分離鑒定，并對(duì)其降血脂的特性進(jìn)行了研究，為開發(fā)降血脂產(chǎn)品奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品

青海酸奶。

1.1.2 培養(yǎng)基

MRS液體培養(yǎng)基、MRS固體培養(yǎng)基。

1.1.3 主要試劑

PCR引物，上海桑尼生物科技有限公司提供；10×PCR buffer、dNTP、rTaq酶，大連寶生物有限公司提供；PCR試劑盒、膠回收試劑盒等，Invitrogen公司提供；高脂飼料包括78.8%基礎(chǔ)飼料、1%膽固醇、10%蛋黃粉、10%豬油、0.2%膽鹽。

先熬豬油，再將膽固醇溶解，最后加膽鹽，但要掌握火候，膽鹽高溫易變硬?；靹蚝笾苯拥谷腼暳现?，拌勻后進(jìn)行烹炒，使油脂浸透。

1.1.4 試驗(yàn)動(dòng)物

健康清潔級(jí)昆明小鼠，由內(nèi)蒙古大學(xué)動(dòng)物中心提供。

1.1.5 血脂指標(biāo)檢測(cè)

貝克曼庫(kù)爾特AU5800型全自動(dòng)生化分析儀。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分離純化

將青海酸奶用生理鹽水做系列稀釋，涂布于MRS固體培養(yǎng)基，于37℃條件下厭氧培養(yǎng)36 h，挑取單菌落，反復(fù)劃線分離至獲得純菌株。對(duì)菌落形態(tài)進(jìn)行觀察，并進(jìn)行革蘭氏染色。

1.2.2 糖發(fā)酵結(jié)果

試驗(yàn)項(xiàng)目包括苦杏仁苷、阿拉伯糖、纖維二糖、七葉苷、果糖、半乳糖、葡萄糖、葡糖酸鹽、乳糖、麥芽糖、甘露醇、甘露糖、松三糖、蜜二糖、鼠李糖、核糖、水楊苷、山梨醇、白砂糖、海藻糖和木糖發(fā)酵試驗(yàn)，發(fā)酵結(jié)果與《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》進(jìn)行比對(duì)[5]。

1.2.3 16S rDNA序列分析與分子鑒定

將純化好的菌株接種于10 mL無菌MRS液體培養(yǎng)基中，于37℃條件下培養(yǎng)24 h，連續(xù)培養(yǎng)3代后采用CTAB法提取其總DNA[6]，并利用細(xì)菌通用引物PCR擴(kuò)增其16S rDNA片段[7]。上游引物序列為：5'-CAGA GTTT GATC CTGG CT-3'；下游引物序列為5'-AGGA GGTG ATCC AGCC GCA-3'。PCR反應(yīng)體系（25 μL），其中包括：上下游引物各0.5 μL（10 μmol/L），模板DNA0.5 μL，5×PCR Buffer 2.5 μL，dNTP.1 μL，加超純水至25 μL，rTaq酶0.3 μL。PCR擴(kuò)增程序：98℃，3 min；98℃，25 s；55℃，25 s；72℃，1 min；30個(gè)循環(huán)，72℃，10 min；4℃保溫。將PCR產(chǎn)物利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)片段長(zhǎng)度約1 500 bp后的陽(yáng)性產(chǎn)物直接送至上海桑尼生物技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定，得到的序列運(yùn)用軟件校準(zhǔn)排齊后，在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blast同源性比對(duì)分析，將待測(cè)菌株鑒定到種。

1.2.4 小鼠血清血脂的變化

將昆明雄性小鼠隨機(jī)分成4組，每組20只，分別為空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、嗜酸乳桿菌高劑量組（1.0×109CFU/只）、嗜酸乳桿菌低劑量組（1.0× 107CFU/只）4個(gè)組。空白對(duì)照組用基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)，其余3組喂高脂飼料，定時(shí)定量給食及飲水，自由攝取，喂養(yǎng)15 d，待高脂模型建立后，每組隨機(jī)取10只小鼠，測(cè)體重后對(duì)眼球采血，采血后盡快分離血清，測(cè)定總膽固醇和甘油三酯。模型建立后，空白對(duì)照組繼續(xù)給予基礎(chǔ)飼料，模型對(duì)照組及試驗(yàn)組繼續(xù)給予高脂飼料?？瞻讓?duì)照組每天灌胃生理鹽水2 mL/只；模型對(duì)照組每天灌胃生理鹽水2 mL/只；試驗(yàn)組每天分別灌胃嗜酸乳桿菌1.0×109CFU/只和1.0×107CFU/只，并定期稱量體重，待15 d給藥結(jié)束后，對(duì)每組剩余10只小鼠進(jìn)行眼球取血，測(cè)定總膽固醇和甘油三酯。

2 結(jié)果

2.1 菌體鏡檢結(jié)果

顯微鏡下嗜酸乳桿菌的形態(tài)見圖1。

圖1 顯微鏡下嗜酸乳桿菌的形態(tài)

由圖1可知，革蘭氏染色為陽(yáng)性，兩端鈍圓、中等大小、無芽胞、不運(yùn)動(dòng)的桿菌，以單個(gè)、成雙或短鏈狀出現(xiàn)。

2.2 糖發(fā)酵結(jié)果

嗜酸乳桿菌糖發(fā)酵鑒定結(jié)果見表1。

表1 嗜酸乳桿菌糖發(fā)酵鑒定結(jié)果

由表1可知，該細(xì)菌發(fā)酵苦杏仁苷、果糖、半乳糖、葡萄糖、乳糖、麥芽糖、海藻糖、甘露糖、核糖、水楊苷和蔗糖，不發(fā)酵阿拉伯糖、纖維二糖、七葉苷、葡萄糖酸鹽、甘露醇、松三糖、蜜二糖、棉籽糖、鼠李糖、山梨醇和木糖，符合《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》對(duì)嗜酸乳桿菌特點(diǎn)的描述，初步鑒定為嗜酸乳桿菌。

2.3 核酸鑒定結(jié)果

16S rDNA基因目的片段和PCR產(chǎn)物見圖2。

用1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物，由圖2可以觀察到在1 500 bp左右處有一明亮的特征條帶，表面擴(kuò)增16S rDNA成功。

嗜酸乳桿菌16S rDNA測(cè)序見圖3。

經(jīng)過與GenBank中已發(fā)表菌株的標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行同源性比較，此菌株與嗜酸乳桿菌的同源性為99.3%。

2.4 嗜酸乳桿菌對(duì)高脂小鼠的影響

2.4.1 嗜酸乳桿菌對(duì)高脂小鼠體重的影響

圖2 16S rDNA基因目的片段和PCR產(chǎn)物

圖3 嗜酸乳桿菌16S rDNA測(cè)序

嗜酸乳桿菌對(duì)小鼠體重的影響見圖4。

圖4 嗜酸乳桿菌對(duì)小鼠體重的影響

由圖4可知，試驗(yàn)初期各高脂組小鼠的初始體重與空白組有顯著差異，但3個(gè)高脂組間無差異。試驗(yàn)?zāi)└鹘M小鼠的體重均有增加，其中模型對(duì)照組的體重增加最多為13.5 g，樣品低劑量組和高劑量組的體重增加分別為10.1 g和9.2 g，空白對(duì)照組增加8.2 g。通過體重可以看出，高脂飼料會(huì)導(dǎo)致小鼠體重顯著增加，樣品組間無顯著差異，但與模型對(duì)照組間有差異，說明嗜酸乳桿菌可以控制高血脂小鼠的體重。

2.4.2 嗜酸乳桿菌對(duì)高脂小鼠總膽固醇的影響

大豆卵磷脂對(duì)高脂小鼠血清膽固醇含量的影響見圖5。

由圖5可知，試驗(yàn)前模型對(duì)照組與樣品組無顯著差異，但3組的總膽固醇含量均高于空白對(duì)照組。試驗(yàn)?zāi)┠Ｐ徒M的總膽固醇最高為2.96 mmol/L，高劑量組和低劑量組的總膽固醇分別為2.70 mmol/L和2.58mmol/L，空白對(duì)照組的總膽固醇為2.57 mmol/L。說明嗜酸乳桿菌可以降低血液中總膽固醇的含量，且呈現(xiàn)一定數(shù)量關(guān)系。

2.4.3 嗜酸乳桿菌對(duì)高脂小鼠甘油三酯的影響

大豆卵磷脂對(duì)血清甘油三酯含量的影響見圖6。

圖5 大豆卵磷脂對(duì)高脂小鼠血清膽固醇含量的影響

圖6 大豆卵磷脂對(duì)血清甘油三酯含量的影響

由圖6可知，試驗(yàn)前模型組與樣品組無顯著差異，但3組的甘油三酯含量均高于空白對(duì)照組。試驗(yàn)?zāi)┠Ｐ蛯?duì)照組的甘油三酯含量最高為1.87 mmol/L，高劑量組和低劑量組的甘油三酯含量分別為1.39 mmol/L和1.26 mmol/L，空白對(duì)照組的甘油三酯為1.06 mmol/L。說明嗜酸乳桿菌可以降低血液中甘油三酯的含量。

3 討論

（1）從青海酸奶中分離出來的菌經(jīng)過16S rDNA鑒定為嗜酸乳桿菌。

（2）嗜酸乳桿菌能降低高血脂昆明小鼠血液中總膽固醇和甘油三酯的含量。

2014年8月8日，《中國(guó)心血管病報(bào)告2013》顯示，心血管病死亡占城鄉(xiāng)居民總死亡原因的首位，而這些心血管疾病絕大多數(shù)是由高血脂導(dǎo)致的動(dòng)脈硬化而引起。在血脂異常人群中，據(jù)2010年全國(guó)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，血清總膽固醇≥6.22 mmol/L的患病率分別占18歲以上男性、女性的3.4%和3.2%，血清甘油三酯≥2.26 mmol/L的男女患病率分別為13.8%和8.6%。中國(guó)心血管病危險(xiǎn)因素流行趨勢(shì)明顯，導(dǎo)致心血管病的發(fā)病人數(shù)持續(xù)增加，而今后10年心血管病患病人數(shù)仍將快速增長(zhǎng)。目前，市面上治療腦血管疾病的藥物大多有副作用，如硝酸酯是治療腦血管疾病的一種常用藥物，但是長(zhǎng)期服用就會(huì)導(dǎo)致身體內(nèi)部的調(diào)節(jié)機(jī)制紊亂，使血管收縮，藥物的療效降低。因此，開發(fā)一種對(duì)人體無副作用的降脂保健品必將有廣闊的市場(chǎng)。

[1]FullerR.Peobioticsinhumanmedicine[J].Gut，1991（32）：439-442.

[2]趙瑞香.嗜酸乳桿菌及其應(yīng)用研究 [M].北京：科學(xué)出版社，2007：22-29.

[3]奚灝鏘，袁根良，杜冰，等.嗜酸乳桿菌發(fā)酵培養(yǎng)工藝研究 [J].廣東飼料，2009，18（8）：20-22.

[4]范興藝.嗜酸乳桿菌的分離、鑒定及其在發(fā)酵豆乳中生長(zhǎng)特性的研究 [D].杭州：浙江工商大學(xué)，2008.

[5]布坎南R E，吉本斯N E.伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè) [M].北京：科學(xué)出版社，1984：802．

[6]F·奧斯伯，R·布倫特．精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南 [M]．顏?zhàn)臃f，王海林，譯．北京：科學(xué)出版社，1998：37-39．

[7]Mauro S，Diego M，Silvia C，et al．Development of genus species specific PCR analysis for identification of carno bacterium strains[J]．Curr Microbiol，2002，45（1）：24-29.◇

Isolation and Identification and Characteristic Study of one Lactobacillus Acidophilus in Yogurt from Qinghai

ZHANG Yaru，XUE Li，ZUO Zhigang，ZHANG Jin，*MA Zhengtu
（Inner Mongolia Shuangqi Pharmaceutical Co.，Ltd.，Huhhot，Inner Mongolia 010010，China）

To isolate one kind of Lactobacillus acidophilus in yogurt from Qinghai and investigate its hypolipidemic action. Bacterial identification is performed on the basis of bacterial morphology and 16S rDNA sequence homology analysis，and the hypolipidemic action is researched by determining Lactobacillus acidophilus reducing the content of total cholesterol and triglycerides.The results show that the bacterium is Lactobacillus acidophilus，which can reduce content of total cholesterol and triglycerides.Lactobacillus acidophilus is characterized by reducing blood fat.

Lactobacillus acidophilus；isolationd and identification；hypolipidemic action

Q93.34

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.01.050

1671-9646（2017）01b-0044-03

2016-11-14

張雅茹（1976— ），女，本科，中級(jí)化工制藥，研究方向?yàn)槲⑸鷳B(tài)制劑。

*通訊作者：馬征途（1980— ），男，在讀碩士，中級(jí)化工制藥，研究方向?yàn)槲⑸鷳B(tài)制劑。