賀 偉， 展宏剛

(山東省泰山醫(yī)院，山東 泰安 271000)

SIRT1對(duì)早期腦缺血大鼠水通道蛋白4表達(dá)的影響

賀 偉， 展宏剛△

(山東省泰山醫(yī)院，山東 泰安 271000)

目的： 檢測(cè)水通道蛋白4(AQP4)及沉默信息調(diào)節(jié)因子1(SIRT1)在腦缺血大鼠腦組織中的表達(dá)變化，探究SIRT1對(duì)AQP4的調(diào)節(jié)作用，明確二者在腦缺血及腦水腫發(fā)生發(fā)展中的作用。方法: 雄性SD大鼠隨機(jī)分成假手術(shù)組(sham組)和腦缺血模型組(MCAO組)，其中MCAO組又分為6 h、12 h、24 h和48 h 4個(gè)時(shí)點(diǎn)組別。采用線栓法阻塞大腦中動(dòng)脈建立局灶性腦缺血模型，于相應(yīng)時(shí)點(diǎn)進(jìn)行神經(jīng)癥狀評(píng)分，Morris水迷宮檢測(cè)大鼠學(xué)習(xí)認(rèn)知功能，TTC染色觀察腦梗死體積，干濕重法檢測(cè)腦含水量的變化，HE染色觀察大腦皮層周圍組織神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，Western blot檢測(cè)AQP4、SIRT1和基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)的表達(dá)情況。結(jié)果: 與sham組相比較，隨著再灌注時(shí)間增加，MCAO組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分、腦梗死體積、腦組織通透性和腦組織含水量均持續(xù)增加，而大鼠學(xué)習(xí)認(rèn)知功能則降低顯著，HE染色顯示腦缺血大腦皮層周圍組織神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，數(shù)目減少；Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示AQP4表達(dá)水平呈增高趨勢(shì)，SIRT1表達(dá)降低，MMP-9表達(dá)增高，MCAO-48 h組與sham組比較差異最明顯(P<0.01)。結(jié)論: 腦缺血后，伴隨腦組織損傷的加劇，SIRT1和MMP-9信號(hào)通路的表達(dá)激活影響了AQP4的表達(dá)活化，共同參與了腦水腫的形成。

腦缺血； 腦水腫； 沉默信息調(diào)節(jié)因子1； 水通道蛋白4

腦缺血可發(fā)生于多種腦血管疾病過(guò)程中，涉及多環(huán)節(jié)、多因素、多途徑損傷的復(fù)雜酶促級(jí)聯(lián)反應(yīng)，引起嚴(yán)重的神經(jīng)損傷。而腦水腫是缺血性腦血管病中常見(jiàn)的并發(fā)癥之一，引起顱內(nèi)高壓、加重病情，甚至造成病人死亡。而血腦屏障(blood-brain barrier，BBB)通透性改變既是腦缺血損傷后的結(jié)果，又是導(dǎo)致?lián)p傷進(jìn)一步加重的重要因素[1]。水通道蛋白4(aquaporin 4，AQP4)是膜水通道蛋白家族的一員，在腦組織中廣泛表達(dá)，是控制水進(jìn)出腦組織的通道，在腦組織水平衡、 星形細(xì)胞遷移、神經(jīng)興奮及炎癥等方面均起著重要作用[2]。大量研究[3]表明，AQP4與腦水腫關(guān)系密切， 參與了多種疾病所引起的腦水腫的病理過(guò)程。先前的大量研究[4]顯示，腦缺血早期，迅速引起腦損傷，損傷程度隨時(shí)間變化很大，這一時(shí)期所造成的腦水腫程度也最為嚴(yán)重。更有研究[5]指出，中腦動(dòng)脈閉塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)發(fā)生48 h之內(nèi)是腦水腫的發(fā)展的關(guān)鍵時(shí)期，也是臨床藥物治療的黃金時(shí)期。沉默信息調(diào)節(jié)因子1(silent information regulator 1，SIRT1)為哺乳動(dòng)物sirtuins家族成員之一，是一種依賴于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+)的去乙?；福诔扇私M織中廣泛表達(dá)。研究顯示，SIRT1通過(guò)去乙?；嚓P(guān)因子調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)在內(nèi)的多個(gè)細(xì)胞信號(hào)通路，參與心腦血管內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用[6]；另有研究顯示，MMP-9信號(hào)通路可以激活A(yù)QP4的表達(dá)，參與心血管疾病的發(fā)生過(guò)程[7],但在腦缺血后繼發(fā)腦水腫病理生理過(guò)程中的作用仍不清楚。為了進(jìn)一步研究腦缺血發(fā)生早期SIRT1、MMP-9信號(hào)通路與AQP4的表達(dá)存在具體的病理生理關(guān)系，我們建立大鼠MCAO模型，選取了MCAO 6 h、12 h、24 h及48 h這4個(gè)重要的時(shí)點(diǎn)分別進(jìn)行研究，以期探尋大鼠腦缺血后早期SIRT1對(duì)水通道蛋白4的調(diào)控規(guī)律及其與腦水腫的關(guān)系。

材 料 和 方 法

1 材料與試劑

水合氯醛(中國(guó)醫(yī)藥)；0.9%氯化鈉注射液(湖南科倫制藥)；生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG/小鼠IgG Ⅱ抗試劑盒(北京中杉金橋生物)；Western blot Ⅰ抗Ⅱ抗去除液、Western blot 轉(zhuǎn)膜液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒和SDS-PAGE電泳液均購(gòu)自碧云天生物；蛋白markers(Lonza Rockland)；PVDF膜(0.45 μm；購(gòu)自SERVA)；增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑(Millipore)；所用單克隆抗體為 AQP4(Abcam)、MMP-9(Cell Signaling Technology)、SIRT1(LifeSpan)和β-actin(Ambobio)。

2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康雄性Sprague-Dawley大鼠，SPF級(jí)，體重250～300 g，由山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)為SCXK(魯)2016-0007。

3 實(shí)驗(yàn)方法

3.1 動(dòng)物分組及給藥 健康成年雄性SD大鼠110只，將動(dòng)物隨機(jī)分為假手術(shù)組(sham組)和MCAO模型組。MCAO模型組按照時(shí)點(diǎn)不同分為MCAO 6 h、12 h、24 h和48 h 4個(gè)亞組。每個(gè)MCAO亞組各25只大鼠，假手術(shù)組大鼠20只。

3.2 模型構(gòu)建 將麻醉成功的大鼠仰臥位固定在手術(shù)臺(tái)上，剪毛，常規(guī)消毒皮膚，頸部正中切口約2～3 cm，逐層分離，暴露左側(cè)頸總動(dòng)脈，鈍性分離左側(cè)頸總動(dòng)脈(common carotid artery，CCA)、頸外動(dòng)脈(external carotid artery，ECA)、頸內(nèi)動(dòng)脈(internal carotid artery，ICA)及迷走神經(jīng)，仔細(xì)分離盡量減少對(duì)迷走神經(jīng)的刺激。在近顱底處分離頸內(nèi)動(dòng)脈顱外段唯一分支——翼腭動(dòng)脈，并將其起始部結(jié)扎，游離頸外動(dòng)脈主干一段，在頸外動(dòng)脈下墊雙線分別2次結(jié)扎頸外動(dòng)脈，兩節(jié)點(diǎn)之間保留一定距離(約2 mm)，提起一端，將頸內(nèi)、外動(dòng)脈分叉處分離干凈。用血管夾夾閉頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈，將右側(cè)頸外動(dòng)脈近心段剪開(kāi)一小口，將漁線所做成的線栓子緩慢插入ECA及ICA入顱至大腦中動(dòng)脈(middle cerebral artery，MCA)開(kāi)口處，線栓子插入的平均深度為(18.5±0.5) mm，外留1 cm長(zhǎng)漁線，此時(shí)即在大腦中動(dòng)脈起始端堵塞大腦中動(dòng)脈，造成局灶性腦缺血，結(jié)扎漁線與血管，消毒并逐層縫合皮膚。假手術(shù)組除不插魚線外，其余操作與手術(shù)組相同。

3.3 神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分 模型制作成功后，按照Bederson[8]評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)在4個(gè)時(shí)點(diǎn)對(duì)實(shí)驗(yàn)鼠的行為缺陷進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分：沒(méi)有觀察到神經(jīng)癥狀，行為正常者為0分；提尾懸空時(shí)，動(dòng)物的手術(shù)對(duì)側(cè)前肢表現(xiàn)為腕肘屈曲，肩內(nèi)旋，肘外展，緊貼胸壁者為1分；將動(dòng)物置于光滑平面上，推手術(shù)側(cè)肩向?qū)?cè)移動(dòng)時(shí)，阻力降低者為2分；動(dòng)物自由行走時(shí)向手術(shù)對(duì)側(cè)環(huán)轉(zhuǎn)或轉(zhuǎn)圈者為3分；軟癱，肢體無(wú)自發(fā)活動(dòng)或死亡者為4分。分?jǐn)?shù)越高，大鼠行為障礙越嚴(yán)重。評(píng)分結(jié)束后，挑選評(píng)分在1～3分者入組，造模后死亡及評(píng)分為4分的實(shí)驗(yàn)鼠排除入組。

3.4 Morris水迷宮檢測(cè)大鼠學(xué)習(xí)認(rèn)知功能 大鼠MCAO術(shù)后第7天，在無(wú)平臺(tái)情況下將小鼠放于水迷宮，馴化2次。于第14天開(kāi)始測(cè)試，連續(xù)進(jìn)行5 d。水池直徑150 cm，水深40 cm，水溫(25±2)℃，逃避平臺(tái)直徑10 cm，其平面沒(méi)在水面下1 cm。按照東、西、南、北4個(gè)方位，將水池均分為4個(gè)象限，將平臺(tái)置于第1象限的中心。水池外接攝像和計(jì)算機(jī)分析系統(tǒng)[9]。(1)定位航行試驗(yàn)：將大鼠從每一象限起點(diǎn)面朝池壁放入水中，依次記錄其游到平臺(tái)的時(shí)間，即為逃避潛伏期，時(shí)限為120 s。此時(shí)限內(nèi)找不到平臺(tái)，則由實(shí)驗(yàn)者將其引導(dǎo)到平臺(tái)上，并停留15秒，該次潛伏期記錄為120 s。將大鼠擦干放入籠子，5 min后再進(jìn)行下一次試驗(yàn)。每天以4次訓(xùn)練潛伏期的平均值作為當(dāng)日記錄結(jié)果。(2)空間探索試驗(yàn)：于第5天開(kāi)始進(jìn)行空間探索試驗(yàn)，用于評(píng)估短期記憶能力。將平臺(tái)移除，大鼠于原象平臺(tái)的對(duì)側(cè)限入水，記錄120 s內(nèi)每只大鼠穿越原放置平臺(tái)位置的次數(shù)。

3.5 血腦屏障通透性測(cè)定 大鼠MCAO術(shù)后48 h，經(jīng)尾靜脈注射伊文思藍(lán)(Evans blue, EB; 2%， 4 mL/kg)，注射后2 h麻醉大鼠，將其固定于鼠板上，打開(kāi)胸腔，用12號(hào)針頭經(jīng)左心室插入心臟，并在右心耳處剪口，用靜脈滴注的方式將0.9%生理鹽水灌注入心臟(灌注壓為110 mmHg)，至右心耳流出無(wú)色清亮的液體，斷頭取腦，去除硬腦膜，生理鹽水沖洗后，濾紙吸干表面水分，取缺血側(cè)大腦稱其濕重后置于甲酰胺溶液(每100 mg腦組織中加入1 mL甲酰胺)中，56 ℃水浴24 h。24 h后1 000 r/min 離心5 min，用吸管輕吸出上清液，可見(jiàn)光分光光度計(jì)測(cè)定上清液632 nm處的吸光度(A)值，甲酰胺作為空白比色，按公式計(jì)算腦組織EB含量：腦組織EB滲透率=(左腦A值/左腦重量)/(右腦A值/右腦重量)。

3.6 腦含水量的測(cè)定 采用干濕重法測(cè)定腦含水量。不同時(shí)相點(diǎn)，大鼠處死后迅速取腦，將取出的腦組織放在一個(gè)內(nèi)有生理鹽水濕潤(rùn)的定性濾紙的培養(yǎng)皿中，以防止腦組織水分蒸發(fā)。去除皮質(zhì)表面的軟腦膜、小腦、腦干，用濾紙輕輕拭去腦組織表面的血跡，分離獲取梗死側(cè)大腦半球，置于稱量杯中稱取濕重，從取腦到稱重完畢時(shí)間控制在5 min內(nèi)。然后將腦組織放入電熱恒溫箱中，100 ℃烘干24～48 h烘烤至恒重，記錄干重(兩次干重之差≤0.2 mg)。按如下公式計(jì)算：腦組織含水量(%)=(濕重-干重)/濕重×100%。

3.7 腦梗死體積百分比的測(cè)定 缺血再灌注之后，將各實(shí)驗(yàn)鼠麻醉后迅速斷頭取腦，切除嗅球和低位腦干，用生理鹽水沖洗后迅速將腦組織置于-20 ℃冰箱中速凍15～20 min，取出腦組織放入腦槽中，在冰床上進(jìn)行操作。大腦沿冠狀面自前腦額極起向后連續(xù)切片，一般切成5～6 片、厚度相近(平均2 mm)的冠狀腦切片。小心地將腦片置于 2% TTC 溶液中，放入37 ℃恒溫箱中避光孵育30 min。正常腦組織可染成深紅色，梗死灶為白色，將腦片置于4%多聚甲醛中固定12 h，數(shù)碼照相機(jī)拍照。選擇每一切面的額側(cè)面用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件計(jì)算每張腦片的面積和梗死面積。大鼠腦梗死灶體積百分比(%)=(正常側(cè)大腦半球體積-梗死側(cè)非梗死區(qū)大腦半球的體積)/正常側(cè)大腦半球體積×100%=[(A1’+A2’+…+An’)d-(A1+A2+…+An)d]/(A1’+ A2’+…+An’)d×100%，An’表示每片正常腦組織面積，An表示梗死側(cè)非梗死區(qū)每片腦組織面積，d表示每片厚度。以此腦梗死灶體積百分比來(lái)反映MCAO后腦損傷的嚴(yán)重程度。

3.8 腦組織取材 將各實(shí)驗(yàn)組剩余大鼠麻醉，斷頭處死，迅速置于冰盤上分離腦組織，在視交叉前行冠狀切取腦組織，取右側(cè)腦組織塊在冰冷的生理鹽水中漂洗稱重，分離的梗死腦組織半球再分為2部分：一部分用4%多聚甲醛固定，后續(xù)經(jīng)脫水、透明、包埋，制成腦組織石蠟塊；另一部分置于液氮中保存待用。

3.9 大腦皮層周圍組織的HE染色 取大鼠腦組織石蠟塊，切片機(jī)連續(xù)切片，厚度約4 μm，置60 ℃烤箱烘烤備用。取石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，蘇木素染色10 min，流水稍洗，體積分?jǐn)?shù)1%的鹽酸乙醇分化，流水沖洗數(shù)分鐘，伊紅染色5 min，流水稍洗，梯度乙醇常規(guī)脫水，中性樹(shù)膠封片。染色后，BX51普通生物顯微鏡對(duì)腦組織觀察并拍照，觀察腦組織病理結(jié)構(gòu)的改變。

3.10 Western blot實(shí)驗(yàn) 在研缽中放入約100 mg缺血側(cè)腦組織冰凍標(biāo)本，加入少量液氮，敲碎，然后把組織研磨成細(xì)小的組織碎片，置于2 mL的勻漿器中，加入Western blot或IP細(xì)胞裂解液，混勻。加入含1 mmol/L PMSF的裂解液1 mL研磨均勻，移入EP管中。高速冷凍離心機(jī)中以14 000×g，4 ℃離心10 min，小心取出上清，用BCA法測(cè)定總蛋白濃度。30～50 μg總蛋白上樣量以濃度為8%的凝膠電泳分離。冰水浴下恒流(300 mA)濕法轉(zhuǎn)膜1.5 h，以體積分?jǐn)?shù)5%的脫脂奶粉封閉1 h，加Ⅰ抗[SIRT1(1∶500)、AQP-4(1∶2 000)、MMP-9(1∶1 000)和β-actin(1∶5 000)]。4 ℃共孵育過(guò)夜。TBST洗滌，與Ⅱ抗共孵育2 h，用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行顯色，并利用灰度分析軟件定量分析，以β-actin的灰度值標(biāo)化蛋白表達(dá)水平。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，數(shù)據(jù)均以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間差異比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 MCAO大鼠的一般特征

實(shí)驗(yàn)期間，sham組大鼠一般狀態(tài)良好，對(duì)外界反應(yīng)靈敏，無(wú)死亡。與sham組比較，MCAO組大鼠精神萎靡，出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)功能障礙，行走向?qū)?cè)旋轉(zhuǎn)或傾倒，甚至癱瘓。Sham組造模全部成功，MCAO模型組造模成功71只，成功率約80.0%。

2 神經(jīng)功能評(píng)分

Sham組未閉塞大腦中動(dòng)脈，故評(píng)分均為0分；造模后MCAO模型組神經(jīng)功能評(píng)分如表1，表明各模型組均出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)功能缺損癥狀，隨著再灌注時(shí)間延長(zhǎng)，自6 h～48 h神經(jīng)功能評(píng)分呈逐漸增高趨勢(shì)；與MCAO-6 h組比較，MCAO-24 h及MCAO-48 h組神經(jīng)功能評(píng)分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)。

3 Morris水迷宮試驗(yàn)測(cè)試結(jié)果

與sham組比較，MCAO組大鼠逃避潛伏期逐漸延長(zhǎng)，穿越平臺(tái)次數(shù)減少，探索速度及平臺(tái)象限路程百分比降低，探索路程增加。MCAO組間比較，隨著缺血時(shí)間延長(zhǎng)，MCAO-48 h組逃避時(shí)間延長(zhǎng)明顯，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.01)；與MCAO-6 h組比較，24 h及48 h時(shí)點(diǎn)均顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)；探索速度均降低，尤其在MCAO-48 h組降低最為顯著(P<0.01)；平臺(tái)象限路程百分比降低，探索路程增加(P<0.05)，MCAO-48 h組增加最顯著(P<0.01),見(jiàn)表1、2。

表1 MCAO大鼠不同時(shí)點(diǎn)神經(jīng)功能評(píng)分、平均逃避潛伏期、MCAO腦組織EB外滲率的變化

#P<0.05,##P<0.01vssham;*P<0.05,**P<0.01vsMCAO-6 h.

表2 各組大鼠空間探索實(shí)驗(yàn)各項(xiàng)指標(biāo)的比較

#P<0.05,##P<0.01vssham;*P<0.05,**P<0.01vsMCAO-6 h.

4 大鼠血腦屏障通透性的變化

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示，EB染色范圍反映了大鼠血腦屏障通透性。MCAO組與假手術(shù)組相比，血腦屏障通透性顯著增加(P<0.01)；隨著時(shí)間的持續(xù)，與MCAO-6 h組相比較，MCAO-24 h及MCAO-48 h組腦組織均顯著增加血腦屏障通透性(P<0.05)，而MCAO-12 h與MCAO-6 h組相比較略有增加，但相互之間無(wú)顯著差異。

5 腦組織含水量的變化

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示，sham組各時(shí)點(diǎn)腦組織含水量都維持在較低的正常水平，組間變化不大，相互之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性；與sham組相比較，MCAO組各時(shí)點(diǎn)的腦含水量顯著增加；隨著再灌注時(shí)間延長(zhǎng)，各組腦含水量均逐漸升高，尤其在MCAO-12 h組腦含水量顯著激增，與MCAO-6 h組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)；MCAO-24 h及48 h組的腦含水量均維持在較高的水平。

Figure 1.The changes of brain water content in the MCAO rats at different time points. Mean±SD. n=6. ##P<0.01 vs sham; *P<0.05 vs MCAO-6 h.

6 腦梗死體積的變化

與假手術(shù)組相比，缺血再灌注各組腦組織梗死范圍從再灌注6 h逐漸升高(P<0.05)，再灌注48 h達(dá)到峰值，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.01)。假手術(shù)組無(wú)缺血改變，TTC 染色呈均勻紅色。MCAO 組梗死體積百分比隨再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增加(P<0.05)，在48 h達(dá)到最大，見(jiàn)圖2。

Figure 2.The cerebral infarct sizes in the MCAO rats at different time points. Mean±SD. n=6. #P<0.05, ##P<0.01 vs sham; *P<0.05 vs MCAO-6 h.

7 光鏡檢查

光鏡下大腦海馬組織HE染色可見(jiàn)，sham組神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)正常，CA1區(qū)神經(jīng)元排列整齊、均勻，無(wú)間質(zhì)水腫。MCAO組缺血周邊大腦組織結(jié)構(gòu)水腫明顯，神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞數(shù)目銳減，細(xì)胞間隙增寬，神經(jīng)纖維網(wǎng)呈空泡樣變，隨著缺血時(shí)間增加，神經(jīng)元胞漿及胞膜形態(tài)不規(guī)則，邊界不清，胞核濃縮程度加重，部分細(xì)胞腫脹顯著；尤其在缺血48 h前后，神經(jīng)元胞體體積明顯增大，細(xì)胞水腫顯著，見(jiàn)圖3。

Figure 3.The pathological changes of the hippocampus of the MCAO rats observed with HE staining (×100).

8 Western blot檢測(cè)MCAO大鼠腦組織相關(guān)蛋白表達(dá)

Western blot條帶及灰度定量分析結(jié)果可見(jiàn)，MCAO模型組各時(shí)點(diǎn)AQP4蛋白表達(dá)升高，其中MCAO-24 h及48 h蛋白表達(dá)升高顯著，與sham組存在顯著性差異(P<0.01)；與MCAO-6 h組相比較，MCAO-24 h及48 h組，AQP4蛋白表達(dá)增加顯著(P<0.05)，MCAO-12 h組表達(dá)增加不顯著，見(jiàn)圖4。

MCAO模型組各時(shí)點(diǎn)MMP-9蛋白表達(dá)持續(xù)升高，與sham組差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)；與MCAO-6 h組相比較，MCAO-12 h及24 h組MMP-9蛋白表達(dá)量略有增加，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，MCAO-48 h組MMP-9蛋白表達(dá)水平增加顯著(P<0.05)，見(jiàn)圖5。

如圖6結(jié)果所示，sham組的SIRT1蛋白呈較高水平表達(dá)，MCAO模型組中，隨著缺血時(shí)間的延長(zhǎng)，SIRT1蛋白表達(dá)水平持續(xù)降低。與sham組比較，MCAO-12 h、24 h及48 h組SIRT1蛋白表達(dá)水平均降低顯著，差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)；MCAO-6 h組降低不明顯；與MCAO-6 h組相比較，MCAO-24 h及48 h組的SIRT1蛋白表達(dá)均顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)；MCAO-12 h組SIRT1的表達(dá)水平略有降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。

Figure 4.The expression of AQP4 in brain tissues of the MCAO rats at different time points. Mean±SD. n=8. #P<0.05, ##P<0.01 vs sham; *P<0.05 vs MCAO-6 h.

Figure 5.The expression of MMP-9 in the brain tissues of the MCAO rats at different time points. Mean±SD. n=8. #P<0.05, ##P<0.01 vs sham; *P<0.05 vs MCAO-6 h.

討 論

Figure 6.The expression of SIRT1 in the brain tissues of the MCAO rats at different time points. Mean±SD. n=8. #P<0.05, ##P<0.01 vs sham; *P<0.05 vs MCAO-6 h.

缺血性腦損傷過(guò)程中，除缺氧和能量代謝衰竭外，由缺血誘導(dǎo)的一系列瀑布樣效應(yīng)是導(dǎo)致神經(jīng)元死亡的重要機(jī)制[10]。AQP4是膜水通道蛋白家族的一員，在腦組織中廣泛表達(dá)，是控制水進(jìn)出腦組織的通道，在腦組織水平衡、 星形細(xì)胞遷移、神經(jīng)興奮及炎癥等方面均起著重要作用[11]。SIRT1是一種煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴的蛋白去乙酰化酶類，在抑制炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，抑制氧化應(yīng)激，調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，介導(dǎo)基因組沉默，減少蛋白表達(dá)、代謝及能量消耗，抑制細(xì)胞凋亡等途徑發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[12-13]。在大鼠腦缺血模型中，白藜蘆醇通過(guò)增加SIRT1的活性實(shí)現(xiàn)對(duì)缺血預(yù)處理大鼠模型海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的保護(hù)作用[14]；先前研究發(fā)現(xiàn)，SIRT1參與了肺泡巨噬細(xì)胞對(duì)MMP-9表達(dá)的調(diào)控作用，進(jìn)而在慢性阻塞性肺病的發(fā)生發(fā)展中起保護(hù)性作用[15]。MMP-9是腦缺血后過(guò)度表達(dá)的炎癥因子。研究證實(shí)，MMP-9可以通過(guò)降解閉合蛋白(occludin)等緊密連接蛋白，導(dǎo)致血腦屏障通透性增加[16-17]。更有研究證實(shí)[7]，在腦缺血早期，MMP-9可以通過(guò)調(diào)節(jié)AQP4的表達(dá)水平，參與腦水腫的發(fā)生過(guò)程。但是在腦缺血的早期發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，SIRT1、MMP-9及AQP4的變化仍鮮有探討。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MCAO模型大鼠各時(shí)點(diǎn)神經(jīng)功能評(píng)分都增加，且隨著時(shí)間延長(zhǎng)，神經(jīng)功能評(píng)分也就越高，學(xué)習(xí)認(rèn)知能力也不斷降低；隨后的腦組織取材研究中也顯示，無(wú)論是腦組織含水量還是腦梗死體積分?jǐn)?shù)都隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而進(jìn)行性加重。HE染色選取海馬腦組織觀察，顯示神經(jīng)細(xì)胞水腫進(jìn)行性加重。

本研究通過(guò)免疫組化及Western blot等技術(shù)手段研究缺血區(qū)AQP4蛋白的表達(dá)水平及腦組織分布特征，結(jié)果表明AQP4蛋白表達(dá)水平隨著時(shí)間的延長(zhǎng)迅速的增加，在MCAO-48 h達(dá)到最大表達(dá)水平。伴隨著腦水腫程度加重，AQP4蛋白的表達(dá)增強(qiáng)，這一結(jié)果表明AQP4的表達(dá)變化與MCAO模型腦水腫的形成密切相關(guān)。為進(jìn)一步闡明腦水腫發(fā)生過(guò)程中TJPs表達(dá)降低的具體病理生理過(guò)程，我們檢測(cè)了MMP-9蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果顯示MCAO后隨著腦損傷的加劇，MMP-9的表達(dá)也是相伴增加的。而SIRT1蛋白在MCAO模型早期則顯示出持續(xù)降低的表達(dá)水平。

由此，我們推測(cè)MCAO后伴隨著腦組織損傷而產(chǎn)生的腦水腫可能是因?yàn)樵谌毖獱顟B(tài)下SIRT1信號(hào)分子表達(dá)受到抑制，對(duì)MMP-9蛋白表達(dá)抑制作用減弱，引起MMP-9的過(guò)表達(dá)，破壞了血腦屏障的結(jié)構(gòu)與功能，引發(fā)后續(xù)信號(hào)通路中AQP4蛋白的表達(dá)增加，使得腦組織水及電解質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)紊亂，各種炎性介質(zhì)也隨之進(jìn)入腦組織，從而導(dǎo)致腦水腫的發(fā)生與不斷的發(fā)展。本部分研究?jī)?nèi)容從分子角度初步探究了腦缺血及其繼發(fā)腦水腫早期的病理生理過(guò)程，為進(jìn)一步藥物干預(yù)研究提供了研究基礎(chǔ)和理論依據(jù)，也為臨床預(yù)防和治療腦水腫提供重要的參考。

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(責(zé)任編輯： 林白霜， 羅 森)

Effect of SIRT1 on dynamic expression of AQP4 in early stage of cerebral ischemia in rats

HE Wei, ZHAN Hong-gang

(TaishanHospitalofShandongProvince,Tai’an271000,China.E-mail:zhhgang@126.com)

AIM: To investigate the pathological changes of aquaporin 4 (AQP4) and related proteins in the rats with focal cerebral ischemia injury, and to observe the effect of silent information regulator 1 (SIRT1) on the AQP4 expression in order to explore the pathological mechanism of cerebral ischemia and brain edema. METHODS: Adult male SD rats were randomly divided into sham group and middle cerebral artery occlusion (MCAO) model group. The MCAO model group was divided into the 4 time point (6 h, 12 h, 24 h and 48 h) subgroups. The animal model of MCAO was established by suture method in mature SD rats. The neural symptom score was measured at the corresponding time points. Morris water maze test was used to study the cognitive function. The cerebral infarction volume was evaluated by TTC staining. The changes of brain water content was analyzed by a dry/wet weight method. The morphological changes of the brain tissues were observed under microscope with HE staining. The protein expression of SIRT1, MMP-9 and AQP4 was determined by Western blot. RESULTS: Compared with sham group, the neural function score of the rats in MCAO model group was significantly elevated. With the increasing reperfusion time, the cerebral infarction volume, brain tissue permeability and the brain water content were also increased. The increases in the protein levels of AQP4 and the related proteins showed apparent changes. The protein expression of SIRT1 was decreased, while the MMP-9 expression was increased. The most obvious differences of the protein level changes in MCAO-48 h model group were observed (P<0.01). CONCLUSION: Accompanied with the aggravating cerebral injury after cerebral ischemia, the process of AQP4 expression is activated with the increasing expression levels of MMP-9 and SIRT1. These factors are combined to induce the formation of brain edema.

Cerebral ischemia; Cerebral edema; Silent information regulator 1; Aquaporin 4

1000- 4718(2017)03- 0455- 07

2016- 09- 20

2016- 11- 15

△通訊作者 Tel: 13335298880; E-mail： zhhgang@126.com

R363.2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.03.012