張媛媛 張建榮 耿燕秋 張艷霞

·實驗研究·

左卡尼汀通過激活Nrf2/ARE通路改善大鼠橫紋肌溶解急性腎損傷

張媛媛 張建榮 耿燕秋 張艷霞

目的 探討左卡尼汀對大鼠橫紋肌溶解急性腎損傷的保護作用及其作用機制。方法 取36只健康雄性成年大鼠，將其隨機分為空白組、模型組及左卡尼汀治療組，每組12只。模型組和治療組通過肌肉注射50%甘油法(10 ml/kg)制備橫紋肌溶解急性腎損傷模型，此外治療組腹腔注左卡尼汀(200 mg/kg)。處死大鼠后心內(nèi)采血并留取腎臟組織。應(yīng)用自動生化儀檢測血清肌酸激酶(creatine kinase，CK)、尿素氮(BUN)和肌酐(SCr)水平。光鏡下觀察大鼠腎臟組織的病理變化；用實時定量聚合酶鏈反應(yīng)和免疫組化法分別檢測大鼠腎臟組織的核因子NF-E2相關(guān)因子2(NF-E2-related factor 2，Nrf2)及血紅素加氧酶(heme oxygenase 1,HO-1)；酶聯(lián)免疫吸附法檢測大鼠腎臟組織的超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)及丙二醛(malonaldehyde,MDA)。結(jié)果 與空白組相比，模型組及治療組的血清CK、BUN、SCr，腎臟組織的Nrf2、HO-1、MDA水平和急性腎小管壞死(acute tubular necrosis,ATN)評分明顯升高，SOD水平明顯下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組相比，治療組血清CK、BUN、SCr，腎臟組織MDA水平和ATN評分明顯降低，腎臟組織Nrf2、HO-1和SOD明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 左卡尼汀對橫紋肌溶解急性腎損傷具有保護作用，其機制可能與激活Nrf2/ARE通路增強HO-1的表達及抑制MDA的合成有關(guān)系。

左卡尼??；橫紋肌溶解；急性腎損傷；氧化應(yīng)激

橫紋肌溶解(rhabdomyolysis，RM)是由于擠壓、運動等原因所致橫紋肌破壞，引起內(nèi)環(huán)境紊亂的一組臨床綜合征，?？梢鸺毙阅I損傷(acute kidney injury,AKI)[1]。目前尚無能有效緩解RM致AKI的藥物，患者預(yù)后也較差。研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激參與了RM致AKI的發(fā)生發(fā)展[2]。左卡尼汀是機體內(nèi)的一種特殊氨基酸，其基本生理功能是轉(zhuǎn)運脂肪酸進入細胞線粒體，通過三羧酸循環(huán)為機體提供能量。研究表明，左卡尼汀具有抗氧化應(yīng)激的作用[3]。本研究探討左卡尼汀對RM致AKI的保護作用及其作用機制。

資料與方法

一、實驗動物

健康雄性成年Sprague-Dawley(SD)大鼠，36只，平均體質(zhì)量210 g，中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供，許可證號：SCXK-(軍)2012-0004。

二、分組及處理

將36只健康雄性成年大鼠隨機分為空白組、模型組及治療組，每組12只?？瞻捉M：不予特殊處理；模型組：雙后側(cè)肢肌注50%甘油(10 ml/kg)，余無特殊；治療組：雙后側(cè)肢肌注50%甘油(10 ml/kg)同時在24 h后腹腔注射左卡尼汀200 mg/kg。每組在肌注甘油后第48h、72h、96h各處死4只大鼠，心內(nèi)采血并留取腎臟組織，1/4腎組織置于福爾馬林液固定行腎臟病理檢查，其余組織置于-80 ℃冰箱待測核因子NF-E2相關(guān)因子2(NF-E2-related factor 2，Nrf2)、血紅素加氧酶(heme oxygenase 1,HO-1)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(malonaldehyde,MDA)。

三、血清指標(biāo)檢測

應(yīng)用自動生化儀檢測血清肌酸激酶(creatine kinase，CK)、肌酐(SCr)和尿素氮(BUN)。

四、制備切片

按照石蠟切片一般步驟制作石蠟切片。將切片進行HE染色，中性樹脂封片，采用奧林巴斯光學(xué)顯微鏡讀片并采集圖像。就光鏡下HE染色標(biāo)本，對腎小管損傷進行評分。急性腎小管壞死(acute tubular necrosis,ATN)評分標(biāo)準(zhǔn)：每張切片×200倍鏡下取10個視野，0=正常，1=輕微損傷(受損腎小管<5%)，2=輕度損傷(受損腎小管5%～25%)，3=中度損傷(受損腎小管25%～75%)，4=重度損傷(受損腎小管>75%)，半定量計算平均值，作為腎小管損傷的評分指數(shù)。

五、免疫組化法測腎臟組織Nrf2、HO-1

按照SABC法免疫組化染色，DAB顯色顯示陽性顆粒呈棕黃色，采用奧林巴斯光學(xué)顯微鏡觀察并采集圖像。用積分綜合計量法計算出的結(jié)果評價免疫組化染色結(jié)果。即采用雙盲法，每張切片×200倍鏡下取10個視野，對染色強度進行評分：不著色為陰性記為0分，淺黃色為弱陽性記為1分，黃色為陽性記為2分，棕黃色為強陽性記為3分。每種陽性強度對應(yīng)的值×該強度細胞的百分比，求和(1×弱陽性百分比+2×中等陽性百分比+3×強陽性百分比)，0為陰性，0-1為弱陽性，1-1.5為中等陽性，大于1.5為強陽性。

六、實時定量聚合酶鏈反應(yīng)測腎臟組織Nrf2、HO-1

按照產(chǎn)品說明書操作提取總RNA，進行反轉(zhuǎn)錄，再進行擴增反應(yīng)，將PCR產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳，采用凝膠圖像分析系統(tǒng)進行半定量分析。Nrf2上游引物序列tcctctgctgccattagtca，下游引物序列g(shù)tgccttcagtgtgcttctg，退火溫度58.8 ℃，產(chǎn)物長度107 bp；HO-1上游引物序列cagagtttcttcgccagagg，下游引物序列tgagtgtgaggacccatcg，退火溫度59.78 ℃，產(chǎn)物長度1 168 bp；內(nèi)參選用β-actin,上游引物序列ccacacccgccaccagttcg，下游引物序列ctagggcggcccacgatgga，退火溫度66 ℃，產(chǎn)物長度140 bp。

七、酶聯(lián)免疫吸附法測腎臟組織SOD、MDA

按照試劑盒步驟操作，據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及對應(yīng)的OD值計算標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程，再依據(jù)樣品的OD值在回歸方程上計算出其相對應(yīng)的SOD、MDA樣品濃度。

八、統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析，正態(tài)分布資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較用單因素方差分析法；非正態(tài)分布資料以中位數(shù)表示；P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、血清指標(biāo)比較

與空白組相比，模型組及治療組CK、BUN、SCr均明顯升高(P<0.05)；與模型組相比，治療組CK、BUN、SCr則明顯下降(P<0.05)。(表1)

表1 不同時間段血清指標(biāo)的比較 ±s)

注：與空白組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05

二、腎臟組織變化

1.光鏡觀察 空白組：大鼠腎臟腎小球及腎小管結(jié)構(gòu)完整，細胞形態(tài)正常。模型組：腎小球增大腫脹，腎小管上皮細胞變性壞死，管腔內(nèi)有大量管型及細胞碎片，間質(zhì)有大量炎性細胞。治療組：腎小球結(jié)構(gòu)基本完整，腎小管結(jié)構(gòu)尚完整，細胞輕度變性、腫脹，管腔內(nèi)偶見滲出物。 2.ATN評分 與空白組相比，模型組及治療組ATN評分均明顯升高(P<0.05)，與模型組相比，治療組，ATN評分則明顯下降(P<0.05)。(表2)

表2 ATN評分統(tǒng)計表

注：與空白組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05

3.腎臟組織Nrf2、HO-1的mRNA含量比較

與空白組相比，模型組及治療組的Nrf2、HO-1的mRNA含量均明顯升高(P<0.05)；與模型組相比，治療組的Nrf2、HO-1的mRNA含量明顯升高(P<0.05)。(圖1～2)

注:與空白組比較,aP<0.05;與模型組比較,bP<0.05圖1 各組大鼠腎組織HO-1mRNA含量比較(A,x±s)

注:與空白組比較,aP<0.05;與模型組比較,bP<0.05圖2 各組大鼠腎組織Nrf2mRNA含量比較(A,x±s)

4.免疫組化檢測腎臟組織Nrf2、HO-1 與空白組相比，模型組及治療組的HO-1、Nrf2的含量均明顯升高(P<0.05)；與模型組相比，治療組的HO-1及Nrf2的含量明顯升高(P<0.05)。(表3)

5.左卡尼汀對大鼠腎臟組織SOD、MDA的影響 與空白組相比，模型組及治療組SOD均明顯降低(P<0.05)；與模型組相比，治療組SOD則明顯升高(P<0.05)。MDA的變化則與SOD相反，與空白組相比，模型組及治療組MDA均明顯升高(P<0.05)；與模型組相比，治療組MDA則明顯下降(P<0.05)。(表4)

表3 各組大鼠腎組織Nrf2、HO-1定量比較

注：與空白組比較，F(xiàn)=88.91-173.46，q=6.89-16.88,aP<0.05；與模型組比較，q=5.88-12.12,bP<0.05

表4 各組大鼠腎臟組織SOD、MDA濃度

注：與空白組比較，F(xiàn)=45.23-163.80，q=5.42-18.93,aP<0.05；與模型組比較，q=4.15-15.39,bP<0.05

討 論

RM是常見的肌肉損傷導(dǎo)致的肌紅蛋白尿、電解質(zhì)紊亂等臨床綜合癥，?？蓪?dǎo)致AKI[4]。損傷肌肉釋放的肌紅蛋白本身具有過氧化物酶樣活性，能使脂質(zhì)、生物分子過氧化，并增加異前列腺素的產(chǎn)生，引起腎血管收縮導(dǎo)致腎臟灌注減少；同時隨著肌紅蛋白的降解，毒性代謝產(chǎn)物在酸性環(huán)境的作用下形成肌紅蛋白管型，堵塞腎小管并使腎臟灌注減低；肌紅蛋白亦誘導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)[5-6]。大量的活性氧通過脂質(zhì)過氧化反應(yīng)損傷腎臟，其誘導(dǎo)產(chǎn)生的MDA可使蛋白質(zhì)及DNA發(fā)生聚合從而損傷腎臟[7]。本研究即通過測定MDA的水平來反應(yīng)機體脂質(zhì)過氧化損傷的程度，間接反應(yīng)細胞氧化損傷的程度，證實了脂質(zhì)過氧化參與了RM致AKI的發(fā)病機制[1]。

機體擁有復(fù)雜的氧化應(yīng)激應(yīng)答系統(tǒng)來緩解自由基及有毒物質(zhì)對機體的損傷，這是由保護性蛋白DNA上游調(diào)節(jié)區(qū)的抗氧化反應(yīng)原件(antioxidant responsive element,ARE)來調(diào)控的[8-9]。Nrf2/ARE通路是迄今為止發(fā)現(xiàn)的機體最重要的內(nèi)源性抗氧化應(yīng)激通路[7]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，Nrf2是ARE的激活因子[10]。Nrf2的缺失或者激活障礙均能加重氧化應(yīng)激源對機體細胞的損傷，繼而導(dǎo)致細胞功能障礙、凋亡以及死亡[9]。Nrf2包含一個高度保守的堿性亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)。Nrf2包括Neh1到Neh6，共6部分，其中Neh1是堿性亮氨酸拉鏈基本的序列，是Nrf2與ARE結(jié)合的區(qū)域[11，12]。在生理狀態(tài)下，Kelch樣氯丙烷相關(guān)蛋白(Keap1)與Nrf2蛋白結(jié)合，使其固定在細胞質(zhì)內(nèi)，由Cullin3-Rbx-E3連接酶介導(dǎo)Nrf2的泛素化，通過26s蛋白酶體降解使其在細胞質(zhì)內(nèi)保持低轉(zhuǎn)錄性[13-14]。細胞發(fā)生氧化應(yīng)激時，Keap1改變構(gòu)象使其與Nrf2解偶聯(lián)，Nrf2轉(zhuǎn)入細胞核內(nèi)[14-15]。轉(zhuǎn)入細胞核內(nèi)的Nrf2與ARE結(jié)合，調(diào)節(jié)下游的基因轉(zhuǎn)錄，包括HO-1在內(nèi)的抗氧化基因的表達[16]。腎功能受損時HO-1的表達增加是腎臟組織的一種自我保護機制[17]。HO-1是血紅素降解的限速酶，可催化血紅素生成膽紅素、一氧化碳(CO)和鐵，HO-1的抗氧化功能一方面表現(xiàn)在其阻止游離血紅素參與氧化反應(yīng)，另一方面表現(xiàn)在HO-1及其酶解產(chǎn)物膽紅素、CO共同發(fā)揮清除自由基、抗脂質(zhì)過氧化作用[4]。ARE是一個特異性的DNA-啟動子結(jié)合序列，位于SOD和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶等保護性基因的5，端啟動序列[18]。SOD是機體重要的抗氧化酶，在細胞抗氧化損傷中起著重要的作用。

左卡尼汀是一種結(jié)構(gòu)上與氨基酸相似的維他命類似物，主要作用是轉(zhuǎn)運長鏈脂肪酸到線粒體基質(zhì)中進行β氧化及以ATP的形式供應(yīng)能量。左卡尼汀可以清除氧自由基，緩解氧化應(yīng)激反應(yīng)，防止脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的累積[19]。研究亦顯示，左卡尼汀能夠減輕脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，從而減輕腎臟缺血再灌注損傷進而保護腎功能[20]。Uatundag等[21]的研究表明，左卡尼汀可以從功能、形態(tài)學(xué)、生物化學(xué)方面對RM致AKI具有保護作用。Barhwal等[22]的研究結(jié)果顯示，左卡尼汀可以通過上調(diào)Nrf2/ARE通路，從而減輕海馬神經(jīng)元的氧化應(yīng)激損害及低氧引起的神經(jīng)退行性病變。本研究結(jié)果顯示RM模型組的Nrf2及HO-1的表達均明顯升高，證實了氧化應(yīng)激可以激活Nrf2/ARE通路，亦即Nrf2/ARE通參與了RM所致AKI的發(fā)生發(fā)展；同時左卡尼汀組Nrf2、HO-1的表達均進一步升高，證實了左卡尼汀可以通過上調(diào)Nrf2/ARE通路對RM所致AKI具有保護作用。

綜上所述，左卡尼汀對橫紋肌溶解所致急性腎損傷具有保護作用，其機制之一可能與其上調(diào)Nrf2/ARE通路、增強HO-1的表達并增加SOD的合成及抑制MDA的合成有關(guān)系，從而發(fā)揮清除自由基及抗脂質(zhì)過氧化等腎臟保護作用。

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Protective effect of L-carnitine on rhabdomyolysis-induced acute kidney injury via Nrf2/HO-1 activation

ZHANGYuan-yuan,ZHANGJian-rong,GENGYan-qiu,ZHANGYan-xia.

DepartmentofNephropathy,ChinesePeople'sArmedPoliceGeneralHospital,Beijing100039,China

ZHANGJian-rong,E-mail:Zhangjr0317@126.com

Objective To observe the protective effects of L-carnitine on renal function in rhabdomyolysis-induced acute kidney injury (AKI) in rats and the underlying mechanism.Methods Thirty-six adult rats were randomly divided into 3 groups: control group, AKI model group, and L-carnitine treatment group [rhabdomyolysis-induced AKI rats given L-carnitine (200 mg/kg)]. 50% glycerin was intramuscularlly injected to establish rhabdomyolysis-induced AKI models in rats. Blood samples were taken from the heart from rats and the kidneys were harvested. Serum creatine kinase (CK), blood urea nitrogen (BUN), serum creatinine (SCr) levels were measured, and renal pathological changes were observed under light microscope. RT-PCR and immunohistochemistry were used to detect the expression of Nrf2 and HO-1 in renal tissues. Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) was applied to detect the expression of SOD and MDA in renal tissues.Results As compared with control group, CK, BUN, SCr, Nrf2, HO-1, MDA and ATN were significantly elevated, and SOD was significantly reduced in model group and L-carnitine treatment group (F=8.78-200.77,q=5.42-19.40,P<0.05). As compared with model group, CK, BUN, SCr, MDA and ATN were significantly decreased, and Nrf2, HO-1 and SOD were significantly elevated in L-carnitine treatment group (q=4.15-15.39,P<0.05).Conclusions L-carnitine can ameliorate rhabdomyolysis-induced AKI, which may be related with its anti-oxidative stress.

L-carnitine; Rhabdomyolysis; Acute kidney injury; Oxidative stress

10.3969/j.issn.1671-2390.2017.01.012

重大災(zāi)害醫(yī)學(xué)救援衛(wèi)星綜合應(yīng)用服務(wù)示范項目[No.發(fā)改辦高技(2013)2140號]

221004 徐州，徐州醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院(張媛媛)；100039 北京，武警總醫(yī)院腎內(nèi)科(張建榮，耿燕秋，張艷霞)

張建榮，E-mail: Zhangjr0317@126.com

2016-06-13

2016-10-07)