張淑麗 呂園園 官志忠 李 毅 齊曉嵐

(貴州醫(yī)科大學(xué)分子生物學(xué)重點實驗室，貴州 貴陽 550004)

SH-SY5Y 神經(jīng)細(xì)胞中α7神經(jīng)型尼古丁受體基因過表達(dá)對鈣調(diào)蛋白表達(dá)的影響

張淑麗 呂園園 官志忠1李 毅 齊曉嵐

(貴州醫(yī)科大學(xué)分子生物學(xué)重點實驗室，貴州 貴陽 550004)

目的 構(gòu)建穩(wěn)定的α7神經(jīng)型尼古丁受體(α7 nAChR)過表達(dá)的神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y，研究α7 nAChR過表達(dá)對鈣調(diào)蛋白(CaM)表達(dá)水平的影響。方法 設(shè)計α7 nAChR引物并擴(kuò)增α7 nAChR 特異性編碼的核苷酸序列，退火后克隆至pcDNA 3.1 質(zhì)粒，構(gòu)建α7 nAChR-pcDNA 3.1重組質(zhì)粒。將α7 nAChR-pcDNA 3.1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細(xì)胞，用含G418的培養(yǎng)液篩選，挑選陽性克隆后采用實時熒光定量(Real-time)PCR和蛋白質(zhì)印跡方法檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞中α7 nAChR mRNA 及蛋白表達(dá)水平的變化，蛋白質(zhì)印跡方法檢測CaM表達(dá)水平的變化。結(jié)果 構(gòu)建的α7 nAChR mRNA過表達(dá)質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)入SH-SY5Y細(xì)胞后，經(jīng)G418篩選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞克隆株，與對照組相比，α7 nAChR mRNA及蛋白表達(dá)量分別增加了533%和110%，CaM表達(dá)量增加了43%。結(jié)論 成功構(gòu)建了α7 nAChR mRNA過表達(dá)的SH-SY5Y細(xì)胞株，α7 nAChR表達(dá)上調(diào)增加了CaM表達(dá)水平，這可能與阿爾茨海默病的發(fā)病有一定的關(guān)系。

α7神經(jīng)型尼古丁受體；鈣調(diào)蛋白；SH-SY5Y 細(xì)胞

阿爾茨海默病(AD)以進(jìn)行性認(rèn)知功能損傷和記憶障礙為特征的一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。AD發(fā)病早期，膽堿能系統(tǒng)內(nèi)Aβ沉積的同時伴有α7神經(jīng)型尼古丁受體(α7 nAChR)的表達(dá)減少。此外，AD 早期膽堿能損傷也與α7 nAChR表達(dá)以及功能異常有關(guān)。α7 nAChR能通過協(xié)助第二信使鈣離子，參與調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)的興奮性、神經(jīng)遞質(zhì)的釋放、長時程增強(qiáng)(LTP)誘導(dǎo)、改善學(xué)習(xí)以及記憶能力。在AD患者中，α7 nAChR的激活也會改善患者的注意力、學(xué)習(xí)及記憶能力。因此，α7 nAChR與AD發(fā)病早期有重要的關(guān)系。研究表明，促進(jìn)大腦膽堿能具體信號的調(diào)節(jié)，增強(qiáng)AD患者的認(rèn)知能力，最終改善其病癥可能是由于α7 nAChR的激活〔1～3〕。本研究用體外合成的mRNA增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)的α7 nAChR表達(dá)，研究其表達(dá)增加后鈣調(diào)蛋白(CaM)的表達(dá)水平，從而探討α7 nAChR對CaM表達(dá)水平的影響及其在AD發(fā)病機(jī)制中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 本實驗保存的人腦神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞株；HindⅢ、BamH Ⅰ、DEPC購自華美公司；DMEM 高糖培養(yǎng)基、胰酶、雙抗購于HyClone 公司；OPTI-MEM培養(yǎng)基、血清、二甲亞砜(DMSO)購于Gibco公司；由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成針對 α7 nAChR 的核苷酸模板引物序列；Genopure Plasmid Midi Kit、G418 Solution、X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent 購于 Roche 公司(德國)；Trizol 試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、瓊脂糖、溴乙啶(EB)、5×TBE、6×上樣緩沖液購于Invitrogen 公司(美國)；兔抗CaM(FL-149)：sc-5537多克隆抗體、鼠抗β-actin單克隆抗體：sc-81178及HRP標(biāo)記的抗鼠二抗：sc-2005購于 Santa Cruz Biotechnology Inc (美國)；兔抗α7多克隆抗體購于Genetex(美國)；辣根過氧化物酶 (HRP) 標(biāo)記的抗兔二抗#7074購于CST(美國)；聚乙烯二氟 (PVDF)膜、ECL-Plus 發(fā)光試劑、高效顯影膠片購自 Amersham 公司；Real time PCR 所用試劑均購于Roche公司；普通化學(xué)試劑購于 Sigma 公司。

1.2 方法

1.2.1 α7 nAChR-pcDNA3.1 表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 根據(jù)GenBank提供的基因序列，應(yīng)用Ambion公司網(wǎng)站提供的軟件設(shè)計α7 nAChR的引物序列，α7 nAChR上游引物：5′-CCCAAGCTTATGCAGGAGGCAGATATCAGTGGC-3′，下游引物：5′-CGCGGATCCTTACGCAAAGTCTTTGGACACG-3′。以上序列經(jīng)Blast Search檢測確認(rèn)了其與α7 nAChR基因以外的人類已知序列無同源性，并由上海生物工程股份有限公司合成，其5′、3′末端分別是 BamHⅠ和 HindⅢ限制性酶切位點。運(yùn)用逆轉(zhuǎn)錄PCR的方法獲取人α7 nAChR基因之后電泳鑒定及回收。用T4 DNA 連接酶將其定向克隆至已線性化的質(zhì)粒pcDNA 3.1之后，構(gòu)建重組質(zhì)粒。陰性對照組直接采用pcDNA 3.1空載體。將它們轉(zhuǎn)化至DH5α大腸桿菌，挑取單克隆擴(kuò)增培養(yǎng)，抽提去內(nèi)毒素的細(xì)菌質(zhì)粒DNA，酶切，電泳鑒定插入片段大小，雙向測序鑒定插入的堿基序列核酸及方向。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 用含10%胎牛血清、1%雙抗(青霉素100 U/ml，鏈霉素100 U/ml)的高糖DMEM培養(yǎng)基于5% CO2、37℃恒溫中培養(yǎng)SH-SY5Y貼壁細(xì)胞。生長良好的細(xì)胞用0.25%的胰酶蛋白酶消化接種至六孔板，待其匯合度為80%左右時，在試劑說明書指導(dǎo)下進(jìn)行GFP熒光質(zhì)控，摸索最優(yōu)轉(zhuǎn)染條件。再分別將不同重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入培養(yǎng)良好的SH-SY5Y細(xì)胞，設(shè)空白對照組、陰性對照組(空載體)、轉(zhuǎn)染組。于OPTI-MEM培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)染6 h后換10%血清的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h之后，加0.8 g/L G418篩選培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，直至出現(xiàn)單克隆細(xì)胞。利用有限稀釋法挑取陽性單克隆并進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)。收集陽性細(xì)胞測定α7 nAChR mRNA及蛋白表達(dá)水平。實驗重復(fù)3次，每次三個復(fù)孔。

1.2.3 實行熒光(Real-time)定量PCR檢測α7 nAChR mRNA 表達(dá)水平 采用 Trizol一步法提取細(xì)胞總 RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再以cDNA為模板進(jìn)行Real-time PCR。所用試劑為Firststart Universal SYBR Green Master(Rox)。引物序列參照王凡等〔4〕，α7 nAChR上游引物：5′-ACCACTCACCGTCTACTTCTCC-3′，下游引物：5′-CATCTGGGAAACGAACAGTCTT-3′，擴(kuò)增片段167 bp；β-actin上游引物：5′-TGGCACCACACCTTCTACAATG-3′，下游引物：5′-TCATCTTCTCGCGGTTGGC-3′，擴(kuò)增片段103 bp。采用ABI Step One Plus型實時熒光定量PCR儀(美國)，采集α7 nAChR及β-actin基因擴(kuò)增各循環(huán)的熒光信號，以SDS2.1軟件收集熒光和分析數(shù)據(jù)。分析結(jié)果時以β-actin為內(nèi)對照，計算α7 nAChR基因在實驗組與對照組的相對水平(RQ=2-△△Ct)。實驗重復(fù)3次，每次3個復(fù)孔。

1.2.4 蛋白表達(dá)水平測定 收集細(xì)胞，提取細(xì)胞蛋白(裂解2 h，14 000 r/min離心5 min)，BCA方法定量，用Western印跡方法檢測α7 nAChR、CaM蛋白表達(dá)水平，以β-actin為內(nèi)對照。用ImageJ軟件分析結(jié)果，計算α7 nAChR、CaM蛋白條帶與β-actin蛋白像素灰度的比值作為蛋白表達(dá)相對水平。實驗重復(fù)3次，每次3個復(fù)孔。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS22.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析及q檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 質(zhì)粒構(gòu)建的鑒定 將α7 nAChR-pcDNA 3.1重組質(zhì)粒用BamHⅠ和Hind Ⅲ雙酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果在約1 000 bp和5 000 bp處出現(xiàn)兩個條帶，與實驗設(shè)計的α7 nAChR基因模板核苷酸長度相符，結(jié)果見圖1。將重組質(zhì)粒進(jìn)行雙向DNA序列測定得到測序結(jié)果與實驗設(shè)計的模板核苷酸序列相符(圖2)，進(jìn)一步表明 α7 nAChR 基因的表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功。

M：DNA Marker (DL5000)；1、2、3、4泳道：α7 nAChR-pcDNA 3.1重組質(zhì)粒酶切圖1 α7 nAChR-pcDNA 3.1重組質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖

圖2 α7 nAChR核苷酸序列測序峰圖

2.2 最優(yōu)化的轉(zhuǎn)染條件 轉(zhuǎn)染GFP 24 h之后在488 nm激發(fā)光波長下(藍(lán)光激發(fā)綠光)進(jìn)行倒置熒光顯微鏡觀察GFP熒光標(biāo)記率。根據(jù)熒光值，轉(zhuǎn)染試劑∶質(zhì)粒=3∶1，復(fù)合物體積為200 μl(六孔板)，孵育條件為常溫、15 min時轉(zhuǎn)染最佳，見圖3。

圖3 最優(yōu)條件的轉(zhuǎn)染GFP熒光圖(×100)

2.3 轉(zhuǎn)染α7 nAChR基因后其mRNA 及蛋白表達(dá)水平 SH-SY5Y細(xì)胞轉(zhuǎn)染α7 nAChR-pcDNA 3.1質(zhì)粒后mRNA 及蛋白表達(dá)水平〔分別為(533.3±120.2)、(2.161±0.187)〕分別增長533%及110%，與對照組〔分別為(0.999±0.001)、(1±0.102)〕相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；而陰性對照組〔分別為(0.958±0.069)、(1.137±0.152)〕與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。說明已將α7 nAChR轉(zhuǎn)入SH-SY5Y細(xì)胞，且增加了α7 nAChR mRNA和蛋白表達(dá)水平。見圖4。

圖4 轉(zhuǎn)染α7 nAChR-pcDNA 3.1質(zhì)粒后α7 nAChR蛋白表達(dá)水平

2.4 轉(zhuǎn)染α7 AChR基因后CaM蛋白表達(dá)水平 轉(zhuǎn)染α7 nAChR-pcDNA 3.1質(zhì)粒后CaM蛋白表達(dá)水平(1.445±0.128)增長了43%，CaM蛋白表達(dá)水平與對照組(1±0.113)相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。而陰性對照組(0.956±0.142)與對照組相比無差異(P>0.05)。說明上調(diào)α7 nAChR水平能增加CaM蛋白表達(dá)水平。見圖5。

圖5 轉(zhuǎn)染α7 nAChR mRNA質(zhì)粒后CaM蛋白表達(dá)水平

3 討 論

膽堿能神經(jīng)功能缺陷在AD 發(fā)病的機(jī)制中具有重要作用。nAChR是神經(jīng)系統(tǒng)中一類非第二信使介導(dǎo)性神經(jīng)遞質(zhì)結(jié)合的離子通道，由α和β2兩種亞單位構(gòu)成。它是以不同亞單位組合的五聚體，主要調(diào)控細(xì)胞內(nèi)外K+、Na+和Ca2+等離子流動〔2〕，其含量的減少與AD發(fā)病相關(guān)〔3〕。nAChR廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，α7nAChR是其中較為特殊的亞型，在海馬和皮層神經(jīng)元中高表達(dá)〔5〕，激活的α7nAChR可以調(diào)節(jié)神經(jīng)元的興奮性和神經(jīng)遞質(zhì)釋放〔6，7〕、改變突觸可塑性〔8〕、幫助神經(jīng)元抵御內(nèi)外因素引起的損傷，維持正常的生理功能，且對維持記憶及認(rèn)知功能十分重要。大量試驗使用了α7 nAChR激動劑治療一些神經(jīng)退行性疾病與認(rèn)知障礙如AD，表明加強(qiáng)α7 nAChR功能可能改善AD患者的學(xué)習(xí)、記憶缺失癥狀〔9，10〕。α7 nAChR受損是膽堿能神經(jīng)元退化的關(guān)鍵因素。最近有研究表明，在老化過程中α7 nAChRs對維持認(rèn)知功能、學(xué)習(xí)和記憶能力具有重要性，以及α7 nAChRs對海馬突觸可塑性的重要性〔11〕。研究表明，α7 nAChR對改善AD和精神分裂癥患者的認(rèn)知障礙有顯著作用〔12，13〕。因此，α7 nAChRs已被確認(rèn)為一種很有前途的治療藥物〔13〕。本研究將α7 nAChR mRNA片段轉(zhuǎn)染到SH-SY5Y細(xì)胞中，其mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯增強(qiáng)，表明α7 nAChR mRNA能有效地增強(qiáng)內(nèi)源性α7 nAChR的表達(dá)。

AD發(fā)病與神經(jīng)元內(nèi)鈣平衡失調(diào)有關(guān)，這種失調(diào)與神經(jīng)元結(jié)構(gòu)和功能失常甚至細(xì)胞死亡有直接的關(guān)系〔14〕。配體門控型離子通道的α7 nAChR對Ca2+通透性極強(qiáng)，對維持細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)具有顯著作用。Ca2+流入神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)與CaM相結(jié)合，進(jìn)一步激活下游涉及維持LTP的級聯(lián)反應(yīng)〔15〕。CaM在細(xì)胞中是一種重要的多功能蛋白，40多種通道或酶被它激活，并參與許多生物學(xué)功能。CaM不僅與神經(jīng)元細(xì)胞的信號級聯(lián)放大系統(tǒng)、突觸可塑性及細(xì)胞分化與增生相關(guān)，而且在LTP和學(xué)習(xí)記憶中起著顯著作用〔16，17〕。

本實驗成功構(gòu)建了α7 nAChR mRNA真核表達(dá)載體，有效地增強(qiáng)了 SH-SY5Y 細(xì)胞中 α7 nAChR 的表達(dá)，為進(jìn)一步的研究提供了基礎(chǔ)。本實驗結(jié)果表明，當(dāng)α7 nAChR過表達(dá)時使CaM蛋白水平表達(dá)增加，可能是α7 nAChR增加使Ca2+內(nèi)流，引起CaM激活，使其成為有活性的鈣-鈣調(diào)蛋白復(fù)合物(Ca2+/CaM)，其蛋白的表達(dá)水平能影響突觸功能可塑性和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的形成，導(dǎo)致整體認(rèn)知功能的改變，減緩AD的發(fā)病進(jìn)展及減少AD的發(fā)生。因此，α7 nAChR在AD的發(fā)病機(jī)制中具有重要作用，并為臨床開發(fā)治療AD的藥物提供了理論參考依據(jù)。

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〔2015-12-09修回〕

(編輯 李相軍)

Effect of over-expression of α7 neural nicotinic receptor gene on the expression of CaM protein in SH-SY5Y cells

ZHANG Shu-Li, Lü Yuan-Yuan, GUAN Zhi-Zhong,etal.

The Key Laboratory of Molecular Biology, Guizhou Medical University, Guiyang 550004,Guizhou,China

Objective To investigate the influence of over-expression of α7 nicotinic acetylcholine receptor (nAChR) induced by mRNA transfection on the protein level of calmodulin (CaM)，and understand the neuroprotective mechanism of α7 nAChR and its function in the pathogenesis of Alzheimer's disease (AD). Methods The recombinant α7 nAChR mRNA was transfected into SH-SY5Y cells, the stable clones were screened by culture medium with G418, and the levels of α7 nAChR mRNA and protein were monitored by using Real-time PCR and Western blot, respectively. The protein level of the CaM was also determined by Western blot.Results Cell clone strains with stable transfection of α7 nAChR mRNA recombinant plasmid was obtained. Compared with controls, the expressions of α7 nAChR mRNA and protein in such cells were increased by the synergist efficiency with 533% and 110%, respectively. The protein level of CaM was increased by 43%. Conclusions Over-expression of α7 nAChR gene resulted from the recombinant α7 nAChR mRNA can increase the level of CaM, which may affect the signal transduction pathway, which suggests that α7 nAChR may play a significant neuroprotective role in the pathogenesis of AD.

α7 nAChR；CaM；SH-SY5Y cell

國家自然科學(xué)基金資助項目(81360178)；教育部“長江學(xué)者和創(chuàng)新團(tuán)隊發(fā)展計劃資助”(IRT13058)；貴州省科技廳重大專項(黔科合重大專項字2014〔6008〕)；貴州省科技廳項目(201344，黔科合SY字〔2013〕3020)

齊曉嵐(1976-)，女，醫(yī)學(xué)博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事老年性癡呆發(fā)病機(jī)制研究。

張淑麗(1990-)，女，碩士，主要從事神經(jīng)分子生物學(xué)研究。

R749.01

A

1005-9202(2017)06-1307-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.06.003

1 貴州醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)教研室