張秋紅，于姍姍

（1．濟(jì)南市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，山東 濟(jì)南 250102；2．濟(jì)南市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心中藥檢驗(yàn)科，山東 濟(jì)南 250102）

高效液相色譜法測(cè)定慢肝福丸中丹參酮ⅡA的含量

張秋紅1，于姍姍2

（1．濟(jì)南市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，山東 濟(jì)南 250102；2．濟(jì)南市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心中藥檢驗(yàn)科，山東 濟(jì)南 250102）

目的：建立測(cè)定慢肝福丸中丹參酮ⅡA含量的方法。方法：采用高效液相色譜法，色譜柱為Welchrom-C18柱，流速為1.0 mL/min，以甲醇-水（80∶20，V/V）為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為270 nm，柱溫為30℃，進(jìn)樣量為20 μL。結(jié)果：丹參酮ⅡA進(jìn)樣量在0.02～0.20 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系（r＝0.999 9）；精密度、重復(fù)性、中間精密度、穩(wěn)定性試驗(yàn)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)色差（RSD）均小于1%，平均加樣回收率為98.60%，RSD為1.98%（n＝9）。結(jié)論：該方法結(jié)果可靠、準(zhǔn)確，靈敏度高，操作簡(jiǎn)單，重復(fù)性好，可用于慢肝福丸的質(zhì)量控制。

慢肝福丸；丹參酮ⅡA；高效液相色譜法；含量測(cè)定

慢肝福丸是由現(xiàn)代中醫(yī)處方發(fā)展而來的中藥復(fù)方制劑，由丹參、龜甲、青皮等23味中藥組成。每味中藥粉碎成細(xì)粉，過100目篩，混勻，裝入專用消毒箱內(nèi)，用鈷-60射線照射滅菌后，每100 g粉末加入煉蜜100～110 g，混勻后制成大蜜丸，藥用PVC包裝，即得。具有增強(qiáng)免疫，抑制病毒復(fù)制，抑制肝臟結(jié)締組織增生，提高血漿蛋白的功效，可用于治療慢性肝炎、肝硬化。該復(fù)方中藥制劑尚未有定量測(cè)定研究，為確保療效、保證產(chǎn)品質(zhì)量，本研究采用高效液相色譜（HPLC）法對(duì)慢肝福丸中的丹參酮ⅡA進(jìn)行測(cè)定，為該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供依據(jù)[1-8]。

1 材料

1.1 儀器

采用戴安 UltiMate 3000高效液相色譜儀，配 UltiMate 3000 Pump，UltiMate 3000 Column Compartment，UltiMate 3000 Variable Wavelength Detector（美國(guó)戴安）；KUDOS SK250H 型超聲波清洗器（上?？茖?dǎo)）；Sartorius BP211D 型電子分析天平（德國(guó)賽多利斯）；SHZ-D（Ⅲ）型循環(huán)水式真空泵（鞏義予華儀器）。

1.2 藥品與試劑

慢肝福丸（中國(guó)人民解放軍第一五零中心醫(yī)院，批號(hào)：140620，140822，140315）；丹參酮ⅡA（批號(hào)：110766-20061）由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供；磷酸（優(yōu)級(jí)純，天津科密歐）；甲醇（色譜純、分析純，國(guó)藥集團(tuán)）；純凈水（杭州娃哈哈）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

色譜柱：C18柱（5 μm，250 mm×4.6 mm，Welchrom）；流動(dòng)相：甲醇-水（80∶20，V/V）；檢測(cè)波長(zhǎng)：270 nm；柱溫：30℃；流速：1.0 mL/min。在此條件下，丹參酮ⅡA分離效果良好，理論板數(shù)按丹參酮ⅡA峰計(jì)算應(yīng)不低于2 000，分離度不低于2.0。

分別吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性樣品溶液各20 μL，按上述色譜條件測(cè)定，記錄色譜峰。結(jié)果丹參酮ⅡA的保留時(shí)間在17.5 min左右，樣品峰與其他組分之間的分離度大于2.0，陰性樣品對(duì)丹參酮ⅡA檢測(cè)無干擾。見圖1。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液取丹參酮ⅡA對(duì)照品10.0 mg，精密稱定，置100 mL棕色量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，得對(duì)照品貯備液（0.1 mg/mL）；精密移取1 mL，置10 mL棕色量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得（10.0 μg/mL）。

2.2.2 供試品溶液取本品約9.0 g，剪碎，精密稱重，置棕色具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流1.5 h，放冷，加甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，用0.22 μm的微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液按處方比例法配制除丹參以外的陰性樣品，按“2.2.1”的方法制備丹參陰性樣品溶液。

2.3 線性關(guān)系考察

精密吸取“2.2.1”中的對(duì)照品溶液（10.0 μg/mL）1 mL，2 mL，4 mL，6 mL，8 mL，10 mL，置10 mL的棕色量瓶中，加甲醇至刻度，進(jìn)樣20 μL，注入色譜儀，記錄色譜峰。以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量（X）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得丹參酮ⅡA的回歸方程為：

Y＝101.1X＋0.743 1，

r＝0.999 9（n＝6）。

結(jié)果表明，在0.02～0.20 μg范圍內(nèi)，丹參酮ⅡA的進(jìn)樣量與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.4 精密度試驗(yàn)

精密吸取丹參酮ⅡA對(duì)照品溶液（10.0 μg/mL），于測(cè)定條件下重復(fù)進(jìn)樣6次，每次進(jìn)樣20 μL。以丹參酮ⅡA峰面積計(jì)算其RSD，計(jì)算結(jié)果為1.0%，結(jié)果表明儀器的精密度良好。

圖1 丹參酮ⅡA的含量測(cè)定HPLC色譜圖

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取慢肝福丸（批號(hào)：140620）共6份，按“2.2.2”的方法制備平行供試品溶液6份，分別取供試品溶液20 μL，按“2.1”的色譜條件測(cè)定，按外標(biāo)法計(jì)算樣品含量。結(jié)果測(cè)得樣品中丹參酮ⅡA的平均含量為0.327 7 mg/丸，RSD為0.6%。表明本方法重現(xiàn)性符合要求。

2.6 中間精密度試驗(yàn)

取慢肝福丸（批號(hào)：140620）9份，每份1丸，由不同人員按“2.2.2”方法分別制備供試品溶液，每人3份，9份供試品溶液分別進(jìn)樣20 μL，測(cè)定峰面積，并計(jì)算樣品中的丹參酮ⅡA含量之間的RSD值。結(jié)果樣品中測(cè)得丹參酮ⅡA含量之間的RSD為0.8%，表明本方法中間精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密稱取慢肝福丸（批號(hào)：140620），分別按“2.2.2”的方法制備供試品溶液，分別在0，2，4，8，10，24 h進(jìn)樣20 μL，記錄峰面積。結(jié)果丹參酮ⅡA峰面積的RSD為0.8%，結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的慢肝福丸9份（批號(hào)：140620，丹參酮ⅡA含量為0.327 7 mg/丸），按表1分別精密加入丹參酮ⅡA對(duì)照品貯備液（0.1 mg/mL），按“2.2.2”的方法制備供試品溶液，并在規(guī)定的色譜條件下測(cè)定，并計(jì)算加樣回收率。見表1。

2.9 樣品測(cè)定

取3批慢肝福丸，分別按“2.2.2”方法處理樣品及測(cè)定，每一批進(jìn)樣量為20 μL，進(jìn)樣6次，求平均含量。見表2。

表1 丹參酮ⅡA加樣回收率試驗(yàn) （n＝9）

表2 3批慢肝福丸中丹參酮ⅡA的含量

由表2可見，三批樣品測(cè)得的丹參酮ⅡA含量分別為0.327 7，0.322 2，0.323 4 mg/丸，其均值0.324 4 mg/丸，取其80%作為本標(biāo)準(zhǔn)的含量下限，即每丸中含丹參以丹參酮ⅡA（C19H18O3）計(jì)算，不得少于259.5 μg。

3 討論

3.1 流動(dòng)相及提取溶劑種類的選擇

根據(jù)文獻(xiàn)[9-16]將其流動(dòng)相確定為甲醇-水（80∶20，V/V），選擇甲醇為溶劑進(jìn)行提取。

3.2 提取方法的考察

加熱回流提取法：取本品約9.0 g（批號(hào)：140620），剪碎，置棕色具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流1 h，放冷，加甲醇補(bǔ)足缺失的質(zhì)量，搖勻，用0.22 μm的微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

超聲提取法：取本品約9.0 g（批號(hào)：140620），剪碎，置棕色具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲提?。üβ?00 W，頻率50 Hz）1 h，放冷，加甲醇補(bǔ)足缺失的質(zhì)量，搖勻，用0.22 μm的微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

對(duì)上述兩種方法所制得的供試品溶液，按“2.1”的色譜條件測(cè)定，結(jié)果表明，加熱回流提取法提取丹參酮ⅡA所得的含量明顯高于超聲提取法，故選回流提取法作為供試品溶液的制備方法。

3.3 提取時(shí)間的考察

取本品約9.0 g（批號(hào)：140620），剪碎，置棕色具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流0.5，1.0，1.5 h，放冷，加甲醇補(bǔ)足缺失的質(zhì)量，搖勻，用0.22 μm的微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。按“2.1”的色譜條件測(cè)定，結(jié)果1.5 h提取丹參酮ⅡA的含量明顯高于0.5 h，1.0 h，但與2.0 h相差不大，故選擇1.5 h作為供試品的提取時(shí)間。

綜上所述，該HPLC測(cè)定丹參酮ⅡA的方法操作簡(jiǎn)單，靈敏度高，重復(fù)性好，結(jié)果可靠、準(zhǔn)確，可用于慢肝福丸的質(zhì)量控制。

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本文編輯：張鈺

Determination of TanshinoneⅡAContent in Manganfu Pills by HPLC

Zhang Qiu-hong1, Yu Shan-shan
(1. Jinan Food and Drug Inspection Center, Shandong Jinan 250102, China; 2. Department of Clinical Laboratory of Chinese Medicine, Jinan Food and Drug Inspection Center, Shandong Jinan 250102, China）

Manganfu Pills; TanshinoneⅡA; HPLC; Content Determination

R286.0

A

10.3969/j.issn.2096-3327.2017.02.006

2016 - 09 - 20

張秋紅，女，碩士，副主任藥師。研究方向：中藥質(zhì)量控制與資源研究。通訊作者E-mail：zhangqh9886@163.com

于姍姍，女，碩士，主管藥師。研究方向：中藥質(zhì)量控制。E-mail：yssyb@126.com

【Abstranct】Objective：To develop a method for determination of tanshinoneⅡAcontent in manganfu pills.Methods：HPLC method was adopted on a Welchrom-C18column at a f ow rate of 1. 0 mL/min using methanol-water (80︰20, V/V) as mobile phase. The detection wavelength was 270 nm, while the column temperature was 30℃, and the sample load was 20 μL.Results：The linear range of tanshinone ⅡAwas 0.02～0.20 μg (r＝0.999 9). All the RSDs of precision, reproducibility, intermediate precision and stability test results were less than 1%. The average recovery of samples was 98.60%, with a RSD of 1.98% (n＝9).Conclusion：The method is reliable, accurate, sensitive, simple, and reproducible, which may be used for the quality control of manganfu pills.