徐永明，徐宏光，張曉玲，高智，肖良

（1.皖南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院弋磯山醫(yī)院脊柱外科，安徽蕪湖241001；2.中國科學院上海生命科學院骨科細胞與分子生物學實驗室，上海200025）

miR-125a-5p在大鼠終板軟骨細胞自然退變中的表達及其靶基因預測

徐永明1，徐宏光1，張曉玲2，高智1，肖良1

（1.皖南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院弋磯山醫(yī)院脊柱外科，安徽蕪湖241001；2.中國科學院上海生命科學院骨科細胞與分子生物學實驗室，上海200025）

目的：通過建立體外大鼠終板軟骨細胞自然退變模型，探討miR-125a-5p在自然傳代誘導大鼠終板軟骨細胞退變中的表達，通過生物信息學軟件預測相關靶基因.方法：取大鼠原代終板軟骨細胞，應用胰酶消化法和自然傳代法培養(yǎng)終板軟骨細胞，分別選取P2、P5、P8代細胞進行甲苯胺藍及阿辛藍染色觀察細胞形態(tài)改變.qRT-PCR檢測終板軟骨細胞中miR-125a-5p表達情況，通過生物信息學軟件預測相關靶基因.結果：細胞傳到P5代時細胞由多角形變成長梭形，外基質(zhì)分泌減少，細胞形態(tài)發(fā)生退變改變，qRT-PCR檢測結果顯示miR-125a-5p表達含量隨細胞代數(shù)增加逐漸減少.結論：大鼠終板軟骨細胞自然傳代至P5代出現(xiàn)退變改變，miR-125a-5p與終板軟骨退變有密切聯(lián)系.

miR-125a-5p；終板軟骨細胞；軟骨退變

隨著人口結構老齡化，脊柱退行性疾病發(fā)病率不斷上升，越來越多人們長期被頸腰痛所折磨，在引起頸腰痛諸多因素中椎間盤退變被視為最為重要因素之一[1].盡管目前在臨床中可采取藥物、理療、手術等多種治療手段，但是臨床療效往往無法令患者達到滿意的效果，也無法從根本上去預防和阻止椎間盤退變進一步發(fā)展.終板軟骨是構成椎間盤一重要結構，是椎間盤營養(yǎng)獲得主要途徑，終板軟骨退變進一步導致椎間盤退變，相反通過保護終板軟骨可以有效延緩椎間盤退變的發(fā)生[2,3]，因此對終板軟骨相關病理生理研究意義十分重要.

MicroRNA（miRNA）是一類內(nèi)源性表達，非編碼小RNA，能通過靶向轉錄抑制或切割進而起到對mRNA基因表達抑制作用.盡管估計miRNAs在人類基因組只占1%–3%，但是它們?nèi)∧軌蛟谌祟愔姓{(diào)節(jié)大約30%的蛋白編碼基因[4].miR-125a-5p作為miRNA家族中一員，目前在腦血管內(nèi)皮細胞、免疫調(diào)節(jié)、胰腺腫瘤等方面研究廣泛受到人們的關注[5-7]，然而目前其在骨科領域尤其涉及到終板軟骨有關研究中報道甚少，本研究旨在揭示miR-125a-5p在終板軟骨退變中表達及相關意義.

1 材料與方法

1.1 材料

10只Sprague Dawley（SD）大鼠（160±15g，雌雄不限）購買于上海斯萊克實驗動物有限公司［SCXK（滬）2012-0002］.二型膠原酶（Sigma;美國）；0.25%Trypsin-EDTA溶液、胎牛血清、青-鏈霉素雙抗溶液100×（Gibico;美國）；DMEM/F12培養(yǎng)液（Hyclone;美國）；甲苯胺藍染色試劑盒、阿辛藍染色試劑盒（碧云天生物技術研究所;中國）；細胞計數(shù)儀、Trizol試劑（Invitrogen;美國）；Realtime PCR試劑盒（takara;大連）；實時逆轉錄聚合酶鏈反應儀（RocheLightCycler480;德國）；倒置熒光顯微鏡（Leica;德國）.

1.2 方法

1.2.1 大鼠原代終板軟骨細胞的獲取和培養(yǎng)

10只SD級大鼠按500mg/kg藥物量腹腔注射濃度為4%水合氯醛處死，常規(guī)消毒后在超凈臺內(nèi)取出整段腰椎，用組織剪剔除腰椎附屬的肌肉、韌帶、軟組織，尖刀片分別切取各個節(jié)段腰椎間盤組織并用含1%雙抗（青霉素-鏈霉素混合液）的磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌2-3次，眼科剪再將獲得的終板軟骨組織剪碎成大小接近1mm3，0.25%Trypsin-EDTA溶液消化30min后加入0.2%II型膠原酶消化6h，將所得懸液過濾2-3次后離心懸液5mi（1000r/min）去除消化液，加入含有10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液吹打均勻并種植于10cm培養(yǎng)皿后放入無菌細胞培養(yǎng)箱內(nèi)進行培養(yǎng)（37℃含5%CO2），培養(yǎng)液每3天更換一次，細胞融合至大約90%時按1：2傳代.

1.2.2 甲苯胺藍染色

分別將P2、P5、P8代細胞種植在12孔培養(yǎng)皿中，待細胞融合至90%時收集細胞后用PBS洗滌2次，用4%多聚甲醛固定15min后PBS再次洗滌2次，每孔加入1ml甲苯胺藍染色60min去除染液后PBS洗滌3次，自然晾干后分別用倒置顯微鏡下拍照觀察細胞改變.

1.2.3 阿辛藍染色

如1.2.2所述，收集細胞后向12孔培養(yǎng)皿中每孔分別加阿辛藍染液1ml染色30分鐘，PBS洗滌3次，每次5分鐘，自然晾干后分別用倒置顯微鏡下拍照觀察細胞鏡改變.

1.2.4 RNA提取及RT-PCR

分別將不同代數(shù)的大鼠終板軟骨細胞接種至6孔培養(yǎng)皿中，待細胞融合至90%時，用0.25%Trypsin-EDTA溶液消化細胞并離心后分別吸取至1.5ml EP管中，每管中加入0.5ml Trizol在冰上裂解提取RNA，按20μl反轉體系反轉成cDNA后進行RT-PCR，每個樣品均設三個重復孔.設U6為內(nèi)部參照.反應條件：95℃預變30s；95℃變性5s；60℃退火延伸25s，擴增50個循環(huán).使用Roche LightCycler480軟件自動分析結果，計算2-△△Ct值，rno-miR-125a-5p引物由廣州銳博生物公司合成.

1.2.5 靶基因預測及Gene Ontology（Go）分析

對miR-125a-5p進行靶基因預測分析時，為了增加靶基因預測結果的可靠性，選取了miranda、mirbase、mirdb等3個數(shù)據(jù)庫進行分析，將3個數(shù)據(jù)庫有關交集的靶基因作為最終預測結果.通過應用David軟件對所得到的靶基因進行Go分析，將靶基因按照參與有相關生物學過程進行分類.

1.2.6 統(tǒng)計學處理

實驗數(shù)據(jù)均由SPSS18.0統(tǒng)計軟件處理，以均數(shù)±標準差表示，兩組間比較采用兩獨立樣本間t檢驗，設檢驗水準為α=0.05，P＜0.05具有統(tǒng)計學意義.

2 結果

2.1 大鼠終板軟骨細胞通過體外自然傳代發(fā)生退變改變

大鼠終板軟骨細胞進行體外自然傳代至P5代時，細胞形態(tài)發(fā)生明顯改變，由多角形逐漸變成長梭形，細胞排列較紊亂，生長速度減慢，甲苯胺藍及阿辛藍染色見細胞外基質(zhì)分泌減少，細胞發(fā)生退變改變（見圖1）.

圖1 P2、P5、P8代大鼠終板軟骨細胞阿辛藍和甲苯胺藍染色（×100倍）

2.2 miR-125a-5p在大鼠終板軟骨細胞中表達

qRT-PCR結果顯示miR-125a-5p表達在大鼠終板軟骨細胞中隨著細胞代數(shù)增大呈逐漸減少趨勢，miR-125a-5p與軟骨細胞退變存在密切聯(lián)系（見圖2）.

圖2 大鼠不同代數(shù)終板軟骨細胞與原代比較miR-125a-5p表達情況（*表示P＜0.05；**表示P＜0.01）

2.3 miR-125a-5p相關靶基因預測

通過3種不同生物軟件預測miR-125a-5p靶基因有1334個，其中3種軟件共同涉及到的靶基因有8個，有2種軟件共同涉及到的靶基因有112個，部分靶基因列出見表1、圖3.

表1 分別通過miranda、mirbase、mirdb3種生物信息軟件預測rno-miR-125a-5p可能結合的靶基因

圖3 miranda、mirbase、mirdb 3個生物信息軟件預測miR-125a-5p有關靶基因韋恩圖

2.4 miR-125a-5p相關Go（Gene Ontology）分析

通過Go分析結果發(fā)現(xiàn)miR-125a-5p主要通過參生物學過程、細胞組成及分子功能3大方面進行相應靶基因的調(diào)控（見圖4）.

圖4 David軟件進行miR-125a-5p有關Go分析

3 討論

當今社會中腰腿痛不斷的影響著人類健康，椎間盤退變是引起腰痛的諸多病因中最常見原因之一.終板軟骨是構成椎間盤重要組成部分，其主要由終板軟骨細胞、細胞外基質(zhì)、二型膠原組成.對人日?；顒舆^程中所產(chǎn)生的不同力學刺激具有重要調(diào)節(jié)功能，椎間盤獲取營養(yǎng)途徑主要來源終板軟骨，終板軟骨的退變進而引起椎間盤退變.研究通過保護終板軟骨可有效緩解椎間盤退變[2].通過對終板軟骨的研究對明確椎間盤退變有著重要意義.

MicroRNA(miRNA)是一類由內(nèi)源基因編碼的長度約為22個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，在1993年第一個miRNA被Lee等人發(fā)現(xiàn)[8].在不同物種中miRNA具有高度保守性，越來越多的miRNA被鑒定和研究在人類、動物、植物以及病毒中，到目前大約超過2000多個miRNAs在人類中被發(fā)現(xiàn).目前發(fā)現(xiàn)的microRNA主要依賴與靶基因mRNA3’-UTR不完全互補及完全互補進而影響靶基因mRNA的穩(wěn)定性.對維系組織或器官系統(tǒng)的正常發(fā)育等方面有著重要作用.

目前miRNA與椎間盤退變相關研究漸有報道，胡凱等[9]發(fā)現(xiàn)在人退變椎間盤髓核組織中miR-663b表達水平明顯降低.miR-663b通過負向調(diào)控matrix metallopeptidase2（MMP-2）最終導致MMP-2在退變椎間盤組織中明顯增多.同時陳宇飛等[10]發(fā)現(xiàn)miR-129-5p表達在退變椎間盤髓核組織中顯著下調(diào)，并且通過生物信息學方法預測miR-129-5p的靶基因為Ⅰ型膠原基因和整合素α1基因，從而引起細胞功能學的改變.并在小鼠體內(nèi)通過過表達miR-129-5p可明顯抑制Ⅰ型膠原基因和整合素α1基因，從而抑制椎間盤中蛋白Ⅰ型膠原和整合素α1的合成，相反抑制miR-129-5p可上調(diào)Ⅰ型膠原基因和整合素α1基因，進而對椎間盤退變起調(diào)控作用.

前期我們通過生物學芯片發(fā)現(xiàn)miR-125a-5p在腰椎退變的人終板軟骨中明顯比正常人椎間盤表達量低，并在人終板軟骨細胞體外得以驗證.本實驗中通過自然傳代誘導大鼠終板軟骨細胞退變，qRT-PCR結果表明miR-125a-5p在自然傳代誘導終板軟骨細胞退變隨細胞代數(shù)增多表達量逐漸減低，間接證實miR-125a-5p可能參與軟骨退變過程，并通過多種靶基因預測軟件發(fā)現(xiàn)Galnt14、Gcnt1、Itga7、Pipox、Prim2、Rhot2、Slc35a4、Sstr3最為有可能的靶基因，同時Go分析提示其參與多個生物學過程中的調(diào)控.因此我們希望通過進一步研究明確miR-125a-5p在椎間盤退變中調(diào)控的相關靶基因，闡明其在椎間盤退變中有關作用，目前miRNA作為椎間盤退變新的治療靶點，望今后在治療椎間盤退變等相關疾病帶來了新的曙光.

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〔10〕陳宇飛.m iR-129-5p在椎間盤退變中的作用及其表觀遺傳調(diào)控研究[D].第四軍醫(yī)大學,2014.

R-332

：A

：1673-260X（2017）03-0039-03

2016-11-10

國家自然科學基金（81572185）

徐宏光，男，博士研究生，教授，博士生導師，研究方向：脊柱外科與老年骨病