李 琳 晁紅梅 裴銀輝

華北理工大學基礎醫(yī)學院 河北唐山 063000

正交設計優(yōu)化淋病奈瑟菌滅活疫苗免疫條件

李 琳 晁紅梅 裴銀輝

華北理工大學基礎醫(yī)學院 河北唐山 063000

①目的 應用正交設計優(yōu)化淋病奈瑟菌滅活疫苗免疫條件，為淋病奈瑟菌滅活疫苗的應用提供實驗依據(jù)。②方法 將淋病奈瑟菌稀釋為1×109CFU/mL、1×108CFU/mL和1×107CFU/mL 3個濃度備用；選擇皮內注射、肌肉注射、皮下注射三種免疫途經，設定初次免疫與第二次免疫的時間間隔依次為2、3、4周；根據(jù)L9(34)正交設計表的方案對家兔進行免疫，末次免疫7天后應用玻片凝集試驗分別測定各試驗組家兔血清中抗體效價。③結果 抗原濃度分別為1×107CFU/mL、1×108CFU/mL和1×109CFU/mL時血清中抗體效價幾何均值分別為4.6357、5.7196、6.0206，濃度為1×109CFU/mL免疫效價最高；采用皮內注射、肌肉注射和皮下注射三種免疫途經的家兔血清中抗體效價幾何均值分別為為5.7195、5.4185和5.2379，皮內注射抗體凝集效價高于其他兩種方式；免疫間隔2周、3周和4周時血清中抗體效價幾何均值分別為5.2379、5.5991和5.5389，其中間隔在3周為最佳。④結論 免疫劑量為1×109CFU/mL、皮內注射、初次與二次免疫間隔在3周為最佳免疫組合。

淋病奈瑟菌 正交設計 免疫條件

[KEY WORS] Neisseria gonorrhoeae.Orthogonal design.Immune condition

淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae)為淋病(gonorrhea)的病原體。人類是淋病奈瑟菌唯一的自然宿主，主要通過性接觸而傳播。感染患者主要發(fā)生泌尿生殖系統(tǒng)損害，表現(xiàn)為尿道炎和宮頸炎，以及附睪炎、盆腔炎等并發(fā)癥，女性患者還可由于并發(fā)癥造成不育、宮外孕等嚴重后果，研制主動免疫預防和治療免疫制劑，積極采取包括疫苗研制在內的防治控制措施顯得更為迫切。目前淋病奈瑟菌疫苗主要包括淋球菌全細胞疫苗、亞單位疫苗、基因工程疫苗等幾種類型。全細胞疫苗作為傳統(tǒng)疫苗，具有保留良好的免疫原性及安全有效的優(yōu)點。確立全細胞疫苗免疫效果與其注射途徑、注射劑量及免疫接種時間的相互關系，是正確應用全細胞疫苗主動免疫淋病的關鍵[1]。本研究旨在通過正交設計優(yōu)化免疫條件，為淋病奈瑟菌滅活疫苗的應用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 CMCC 29403(購自中國食品藥品檢定所)。

1.1.2 實驗動物 健康雄性家兔，體重2.0～2.5kg，華北理工大學實驗動物中心提供。

1.2 方法

1.2.1 淋病奈瑟菌培養(yǎng) CMCC 29403標準菌珠接種于血瓊脂平板，5%～10% CO2厭氧培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)48小時,形成直徑為1.0～1.5mm無色、透明、圓形光滑菌落；無菌挑取2～3個菌落加入胎牛血清肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時，60℃恒溫水浴箱滅活20分鐘，吸取滅活后菌液培養(yǎng)液1mL加入巧克力色血瓊脂平板中培養(yǎng)，無菌落生長，證實培養(yǎng)液中淋病奈瑟菌已經完全滅活，血細胞計數(shù)板計數(shù)，以無菌胎牛血清分別稀釋為1×107CFU/mL、1×108CFU/mL、1×109CFU/mL 3種免疫濃度。

1.2.2 免疫佐劑制備 稱取羊毛脂10g加入45mL液體石蠟中加熱融化冷卻至室溫，入研缽中同方向研磨成乳劑后8磅高壓滅菌15分鐘，放至室溫后4℃冰箱冷藏備用。于上述液體中邊研磨邊逐滴加入卡介苗75mg，加完后繼續(xù)研磨成乳劑，滴于水上5～10分鐘內完全不擴散為合格；8磅高壓滅菌15分鐘，放置室溫后4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 正交設計免疫方案 選擇體質量2.0～2.5kg健康雄性家兔45只，適應性飼養(yǎng)1周后，隨機分為9組，每組5只。分別采用滅活疫苗濃度1×107CFU/mL、1×108CFU/mL和1×109CFU/mL經皮內、皮下及肌肉注射三種注射方式進行免疫，免疫劑量為1mL，初次免疫與第2次免疫時間間隔分別選擇第2、3、4周3組時間間隔進行。按L9(34)的免疫程序進行免疫，見表1。

表1 淋病奈瑟菌全細胞疫苗免疫方案正交設計表

1.2.4 免疫血清效價測定 每組家兔末次免疫7天后，抽取耳緣靜脈血2mL置于滅菌試管中，室溫靜置1小時至血液凝固后入4℃冰箱過夜析出血清，凝集試驗測定免疫血清效價。

1.3 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 13.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理，計量資料采用方差分析，檢驗水準均采用雙側α=0.05。

2 結果

抗原濃度為1×107CFU/mL、1×108CFU/mL和1×109CFU/mL時血清中抗體效價幾何均值分別為4.6357、5.7196和6.0206，濃度為1×109CFU/mL免疫效價最高，與其他兩種抗原濃度所產生的免疫效價比較，差異具有統(tǒng)計學意義；皮內注射、肌肉注射和皮下注射給藥三種免疫途經血清中抗體效價幾何均值分別為為5.7195、5.4185和5.2379，皮內注射抗體效價高于其他兩種免疫途徑產生的抗體效價，差異具有統(tǒng)計學意義；免疫間隔2周、3周和4周時血清中抗體效價幾何均值分別為5.2379、5.5991和5.5389，其中二次免疫間隔在3周為最佳選擇，與免疫間隔2周、3周時血清抗體效價幾何均值比較，差異具有統(tǒng)計學意義。因此，由正交設計確定的最佳免疫條件組合是：免疫劑量1×109CFU/mL、皮內注射、初次與二次免疫間隔為3周。見表2。

表2 正交實驗優(yōu)化淋病奈瑟菌滅活疫苗免疫條件結果

注：免疫劑量1=1×107CFU/mL,2=1×108CFU/mL,3=1×109CFU/mL;

免疫途徑1=皮內,2=皮下,3=肌肉注射;免疫時間間隔1=2周,2=3周,3=4周

3 討論

淋病為全球發(fā)病率較高的性傳播疾病之一，人類是淋病奈瑟菌的唯一宿主，經性行為傳播，多侵襲泌尿生殖道黏膜，主要引起男性急性尿道炎、前列腺炎、附睪炎等。在女性主要以隱性感染為主，常因不及時治療而導致盆腔炎、子宮內膜炎,甚至不孕證的發(fā)生[2]。近年來，淋病奈瑟菌的耐藥性日益增強，淋病的治療變得越發(fā)困難[3]。因此，研制有效的淋球菌疫苗及合理的免疫程序無疑會為淋病的防治提供有效的主動免疫方案。

目前淋病奈瑟菌疫苗的研制已發(fā)展為包括全細胞疫苗、亞單位疫苗、基因工程疫苗和DNA疫苗在內的多個種類。淋病奈瑟菌全細胞疫苗屬于顆粒性抗原，具有較強的免疫原性，可直接注射動物產生相應的抗血清[4]。機體在抗原物質的刺激下產生特異性免疫反應的過程，大體上可分為3個階段。①致敏階段(加工處理抗原階段)：當顆粒性抗原初次進入人體內時，首先被巨噬細胞吞噬。通過胞漿內溶酶體酶的作用，把抗原物質消化降解，而保留其抗原決定簇(特異性抗原成分)。經過處理的抗原與巨噬細胞的RNA結合成為抗原-RNA復合物，具有強烈吸引免疫活性細胞的作用，能把抗原-RNA復合物傳遞給免疫活性細胞(Immunologically competent cell),啟動免疫反應。②反應階段(淋巴細胞分化增殖階段)：免疫活性細胞在受到抗原信息的刺激后，發(fā)生母細胞化，進而大量增殖。由于抗原的性質不同，刺激T細胞分化成致敏淋巴細胞；刺激B細胞使其分化成漿細胞。在分化過程中小部分成為“記憶”細胞。由于“記憶”細胞的存在，即使抗原在漿內消失很久(數(shù)月至數(shù)年或更長)以后，仍能與再度進入體內的相應抗原迅速引起較強的免疫反應(回憶反應)。③效應階段(發(fā)生免疫反應階段)：當致敏淋巴細胞再次遇到相應抗原的刺激后，能釋放出多種具有生物活性的物質(淋巴因子)，參與細胞免疫反應；漿細胞可形成各種類型的免疫球蛋白(抗體)，參與體液免疫反應。在免疫期間，不同的動物，在不同的時間內抗血清效價、特異性、親合力等均可能發(fā)生變化，因此必須設計試驗進行測定，以確定其變化規(guī)律[5]。

抗原的免疫劑量是依照給予動物的種類、免疫周期以及所要求的抗體特性等不同而不同。免疫劑量過低不能引起足夠強的免疫刺激，免疫劑量過多，有可能引起免疫耐受。在一定的范圍內，抗體的效價是隨注射劑量的增加而增高。本試驗抗原為顆粒性抗原，依據(jù)其強弱、分子量大小、動物個體情況及免疫時間間隔分別選擇全細胞疫苗濃度1×107CFU/mL、1×108CFU/mL和1×109CFU/mL三個劑量[6]。

對免疫途徑的選擇決定于抗原的生物學特性和理化特性，以能使機體獲得最好免疫效果為原則。根據(jù)不同抗原及試驗要求，可選取皮內、皮下、肌肉注射、靜脈或淋巴結等不同途徑進行免疫；凡能造成全身性感染的疾病，以皮下或肌肉注射為好；而主要侵入呼吸道或體表感染的疾病，以噴霧接種疫苗的效果好；以消化道為入侵途徑的感染或消化道感染，則以口服接種方式為好[7]。

兩次注射的間隔時間應長短適宜，太短起不到再次反應的效果，太長則失去了前一次激發(fā)的敏感作用[8]。一般初次免疫應答時間為7～10天左右，分泌IgM抗體；二次免疫應答在隔周；初次免疫應答以后1周達到峰值，分泌IgG抗體。因此應當選擇二次免疫應答時進行免疫可能會有較好的免疫效果。在一定范圍內，接種次數(shù)增加，免疫效果增強，但過多也會產生免疫麻痹現(xiàn)象[9]。

為了確保得到理想的試驗結果，本次試驗在免疫過程中分別加入弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑來增強機體對淋病奈瑟菌滅活疫苗的特異性免疫應答，其中初次免疫應用弗氏完全佐劑，即在弗氏不完全佐劑中加入BCG，為避免佐劑對全細胞疫苗抗原可能產生的破壞，進而影響免疫效果[10]，佐劑與抗原分別注入家兔體內，且接種部位在抗原附近或對側。

通過上述試驗條件的篩選，經過正交表L9(34)確定試驗方案進行動物免疫，根據(jù)顆粒性抗原與抗體反應可以產生肉眼可見的凝集反應的特征，采用凝集試驗進行免疫血清效價測定，各免疫組家兔的抗體結果表明：免疫劑量、免疫途徑及免疫時間間隔三個因素對淋病奈瑟菌全細胞疫苗免疫效果均有影響；三者對免疫效價影響程度順序為免疫劑量>免疫途徑>免疫時間間隔；不同免疫劑量免疫效價存在差異：抗原濃度1×107CFU/mL免疫動物后血清中抗體效價幾何均值為4.6357，抗原濃度1×108CFU/mL免疫動物后血清中抗體效價幾何均值為5.7196，抗原濃度1×109CFU/mL免疫動物后血清中抗體效價幾何均值為6.0206，其中濃度為1×109CFU/mL免疫效價最高，與其他兩種濃度抗原產生的免疫效價相比，差異具有統(tǒng)計學意義。不同免疫途徑的免疫效價同樣存在差異：皮內注射免疫動物后血清中抗體效價幾何均值為5.7195，肌肉注射免疫動物后血清中抗體效價幾何均值為5.4185，皮下注射免疫動物后血清中抗體效價幾何均值則為5.2379，皮內注射免疫效價高于其他兩種途徑，差異具有統(tǒng)計學意義。初次免疫與第二次加強免疫的時間間隔對家兔抗體的產生也有所不同：免疫間隔2周時免疫動物后血清中抗體效價幾何均值為5.2379，間隔3周時免疫動物后血清中抗體效價幾何均值為5.5991，4周時免疫動物后血清中抗體效價幾何均值為5.5389，其中二次間隔為3周時免疫效價高于其他兩種間隔時間，差異具有統(tǒng)計學意義。研究結果得到最佳免疫組合方式為：淋病奈瑟菌全細胞疫苗劑量1×109CFU/mL、初次與二次免疫間隔為3周、皮內注射的方式進行免疫。

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(2016-12-2 收稿)(張愛國 編輯)

Optimaization of inactived neisseria gonorrhoeae vaccination by orthogonal design

LILin,CHAOHongmei,PEIYinhui

(NorthChinaUniversityofScienceandTechnology,Tangshan063000,China)

Objective To optimize inactived neisseria gonorrhoeae vaccination by orthogonal design,so to establish experiment basis for further test. Methods Gonorrhea neisseria bacteria was diluted into 1×109CFU/mL,1×108CFU/mL and 1×107CFU/mL respectively,intradermal injection,intramuscular injection and subcutaneous injection were adopted for antigen entrance 2,3,4 weeks were the intervals between primary and second immune.Immunization was performed according to the orthogonal design table L9 (34).Slide agglutination test was performed to test the specific antibody titer of each groups 7 days later. Results The geometry means at the following cell density1×109CFU/mL,1×108CFU/mL and 1×107CFU/mL were 4.6357,5.7196 and 6.0206 respectively，the geometry mean with 1×109CFU/mL was higher than the others,and the difference was significantly.The geometry means with intradermal injection,intramuscular injection and subcutaneous injection were 5.7195,5.4185 and 5.2379 respectively,the geometry mean with intradermal injection was higher than the others,and the difference was significantly.The geometry means with 2,3 and 4 weeks were 5.2379,5.5991 and 5.5389 respectively,the geometry mean with 3 weeks interval was higher than the others, and the difference was significantly.Conclusion With the dosage of 109CFU/mL bacteria,intradermal injection,and 3 weeks interval between the first and the second injection are the optimization immune combination.

李 琳(1964-)，女，本科，高級實驗師。研究方向：病原生物學。

R 392.3

A

2095-2694(2017)02-085-5