牛淑冬，陶曉明，李宇，劉勇躍，王建，叢明宇，周文郁，邱長春

（1.齊齊哈爾醫(yī)學院 基礎(chǔ)醫(yī)學院，黑龍江 齊齊哈爾 161006；2.中國醫(yī)學科學院 基礎(chǔ)醫(yī)學院，北京 100005；3.內(nèi)蒙古自治區(qū)通遼市疾病控制和預(yù)防中心 流行病學教研室，內(nèi)蒙古 通遼 028099；4.齊齊哈爾醫(yī)學院 醫(yī)藥科學研究院，黑龍江 齊齊哈爾 161006）

CETP基因多態(tài)性及單倍型與蒙古族人群原發(fā)性高血壓的關(guān)系*

牛淑冬1，陶曉明2，李宇1，劉勇躍3，王建3，叢明宇1，周文郁2，邱長春4

（1.齊齊哈爾醫(yī)學院 基礎(chǔ)醫(yī)學院，黑龍江 齊齊哈爾 161006；2.中國醫(yī)學科學院 基礎(chǔ)醫(yī)學院，北京 100005；3.內(nèi)蒙古自治區(qū)通遼市疾病控制和預(yù)防中心 流行病學教研室，內(nèi)蒙古 通遼 028099；4.齊齊哈爾醫(yī)學院 醫(yī)藥科學研究院，黑龍江 齊齊哈爾 161006）

目的分析膽固醇酯轉(zhuǎn)運蛋白（CETP）基因TaqIB、D442G、I405V多態(tài)性及其單倍型與中國蒙古族人群原發(fā)性高血壓（EH）的相關(guān)性。方法 從內(nèi)蒙古自治區(qū)隨機選取高血壓患者883例、健康對照1044例進行病例對照研究。應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）和PCR產(chǎn)物直接測序法鑒定多態(tài)性位點的基因型，采用Haploview進行Hardy-Weinberg平衡和單倍型分析。結(jié)果 TaqIB、D442G2、I405V基因型及等位基因的分布在EH組與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；但B2-G、B2-G-I單倍型在EH組中的分布頻率低于對照組[B2-G：＾OR= 0.359（95%CI：0.188，0.689）P=0.001；B2-G-I：＾OR=0.329（95%CI：0.157，0.691）P=0.002]。結(jié)論 在中國內(nèi)蒙古自治區(qū)蒙古族人群中，CETP基因TaqIB、D442G、I405V 3個位點的突變不能獨立影響EH發(fā)病風險，但單倍型B2-G、B2-G-I攜帶者的EH發(fā)病風險顯著降低，可能是降低該人群EH易感性的保護性因素。

原發(fā)性高血壓；膽固醇酯轉(zhuǎn)運蛋白基因；基因多態(tài)性；單倍型；蒙古族

人類膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白（cholesterol ester transfer protein，CETP）基因位于第16號染色體長臂（16q12 21），長約25 kb，包含16個外顯子和15個內(nèi)含子。研究表明，CETP基因中有多個多態(tài)性位點可能與腦卒中、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病等心血管疾病相關(guān)[1-2]。目前關(guān)于CETP基因多態(tài)性及其血漿水平與三酰甘油（Triglyceride，TG）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）等血脂水平改變的相關(guān)性研究較多[3-4]，但CETP基因多態(tài)性對于心血管疾病另一主要風險因素——高血壓的影響卻鮮見報道。本課題以原發(fā)性高血壓（essential hypertension，EH）發(fā)病率高居我國各民族第3位（20.22%）的內(nèi)蒙古自治區(qū)蒙古族人群為研究對象，經(jīng)年齡、性別、體重指數(shù)（body mass index，BMI）、吸煙、飲酒、血脂水平等混雜因素調(diào)整，應(yīng)用多因素Logistic回歸分析，觀察CETP基因常見多態(tài)性位點TaqIB、D442G2、1405V與EH的相關(guān)性，旨在探討CETP基因多態(tài)性對我國蒙古族人群EH易感性的影響。

1 資料與方法

1.1 研究對象

本研究獲得中國醫(yī)學科學院及齊齊哈爾醫(yī)學院醫(yī)學倫理委員會的批準和受試者的知情同意，以內(nèi)蒙古自治區(qū)通遼市科左后旗32個自然村作為研究現(xiàn)場，隨機抽取年齡≥40歲，且≥3代無異族通婚史的常住蒙古族人為研究對象，經(jīng)問卷調(diào)查和體格檢查，納入高血壓患者883例（男性453例，女性430例），健康對照1044例（男性372例，女性672例）。

高血壓患者納入標準以1999年世界衛(wèi)生組織/國際高血壓聯(lián)盟制定的高血壓診斷標準為依據(jù)[5]：①患者之間無血緣關(guān)系；②發(fā)病年齡＜60歲；③收縮壓（systolic blood pressure，SBP）≥140 mmHg和/或舒張壓（diastolic blood pressure，DBP）≥90 mmHg；④根據(jù)詳細詢問病史、體格檢查和實驗室檢查，排除繼發(fā)性高血壓、糖尿病及肝、腎疾病患者。

對照組納入標準：按年齡、性別與地區(qū)匹配的原則，選擇無血緣關(guān)系的血壓正常受試者。①SBP＜130 mmHg，DBP＜80 mmHg；②對照組受試者與EH組受試者性別相同，年齡差別＜5歲，近5年居住在同一自然村；③根據(jù)病史、體格檢查和實驗室檢查，排除糖尿病及肝、腎疾病患者。

1.2 人體測量與生化檢測

人體測量指標包括SBP、DBP、身高、體重、腰圍和臀圍。計算BMI、腰臀圍比（waist-hip ratio，WHR）。BMI=體重/身高2（kg/m2），WHR=腰圍（cm）/臀圍（cm）。血壓測量按照國際標準化方法，使用臺式汞柱血壓計，每位研究對象連續(xù)測量血壓3次，取平均值作為被測對象的血壓值。血液樣本收集與生化指標測定：空腹抽取靜脈血5 ml置于10 ml抗凝管中（含1 ml 2%EDTA-Na2），用于測定血液生化指標及基因組DNA提?。徊捎妹阜ǎㄗ詣由瘍xErbaXL-300，德國Diagnostics Mannheim GmbH公司）測定血漿總膽固醇（total cholesterol，TC）、TG、HDL-C、LDL-C水平。

1.3 全血基因組DNA提取及基因型鑒定

采用離心柱型試劑盒法（TIANamp blood DNA midi kit，北京天根生化科技有限公司），從白細胞中提取基因組DNA（OD260/OD280約為1.80），置于-20℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆?。?yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）（PCR儀：MyCycler Thermal Cycler，美國Bio-Rad公司）和PCR產(chǎn)物直接測序（BGI北京LifeTech公司）鑒定TaqIB、D442G、1405V基因型。PCR反應(yīng)引物序列見表1。

1.4 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，用獨立樣本t檢驗，方差不齊采用t'檢驗，對明顯偏態(tài)分布的變量先進行算術(shù)平方根轉(zhuǎn)換。等位基因、基因型、單倍型頻率的比較用χ2檢驗。Hardy-Weinberg平衡和單倍型分析采用Haploview軟件。應(yīng)用Logistic回歸分析進行混雜因素調(diào)整及基因型與血壓水平關(guān)系分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

表1 CETP基因多態(tài)性位點引物序列

2 結(jié)果

2.1 臨床特征

EH組與對照組的吸煙者比率、飲酒者比率、BMI、WHR、SBP、DBP及血漿TC、TG、LDL-C、HDL-C水平比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。其中，EH組的吸煙者比率、飲酒者比率、BMI、WHR、SBP、DBP、TC、TG、LDL-C水平高于對照組，而HDL-C水平低于對照組。見表2。

表2 兩組患者臨床特征和生化指標比較

表3 兩組CETP基因型與等位基因頻率分布比較 例（%）

2.2 兩組基因型與等位基因頻率分布比較

TaqIB的3種基因型（B1B1、B1B2、B2B2）和I 405V的3種基因型（Ⅱ、Ⅳ、VV）在EH組和對照組中均有分布；而D442G多態(tài)性位點只有DD和DG基因型，在整個人群中，均無GG突變純合子攜帶者。3個位點的基因型及等位基因的分布頻率在EH組與對照組比較，經(jīng)χ2檢驗，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（見表3），按性別分組及應(yīng)用二分類回歸分析，校正年齡、性別、體重指數(shù)、吸煙、飲酒、血脂水平后差異無統(tǒng)計學意義。

2.3 兩組單倍型分布頻率比較

將TaqIB、D442G、I405V 3個位點兩兩組合，觀察其分布頻率及在EH組與對照組中的分布差異。結(jié)果表明，TaqIB-D442G 4種單倍型分布頻率均＞1%，其分布頻率由高至低依次為B1-D（57.5%）、B2-D（39.8%）、B1-G（1.4%）、B2-G（1.3%）；TaqIB-I405V 4種單倍型分布頻率均＞1%，其分布頻率依次為B1-I（44.5%）、B2-V（28.6%）、B1-V（14.6%）、B2-I（12.4%）；D442G-I405V有3種單倍型分布頻率均＞1%，其分布頻率依次為D-I（54.4%）、D-V（42.8%）、G-I（2.0%）。以上各種單倍型中，B2-G單倍型在EH組與對照組中的分布頻率比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），EH組的分布頻率低于對照組。見表4。

續(xù)表3

表4 CETP基因單倍型分布頻率比較 例（%）

TaqIB-D442G-I405V組合的6種單倍型分布頻率均＞1%，其分布頻率由高至低依次為B1-D-I （43.2%）、B2-D-V（28.3%）、B1-D-V（14.3%）、B2-DI（11.5%）、B1-G-I（1.1%）、B2-G-I（1.1%）。其中B2-G-I在EH組與對照組中的分布頻率比較（P＜0.05），差異有統(tǒng)計學意義，EH組中的分布頻率低于對照組。見表4。

3 討論

心腦血管疾病是人類首位死亡原因。前瞻性流行病學調(diào)查結(jié)果顯示，罹患心血管疾病的危險性不僅取決于個體具有某一危險因素的嚴重程度，更取決于個體同時具有危險因素的數(shù)目[6]，危險因素的數(shù)目和嚴重程度共同決定個體發(fā)生心血管疾病的危險程度。多種危險因素的共同作用稱為多重危險因素的綜合危險。高血壓、血脂異常（包括低HDL-C、LDLC、TC、TG水平升高等）是主要的心血管風險因素[7]，且在疾病發(fā)生、發(fā)展的過程中，高血壓與血脂異常相互作用，提高心血管疾病的發(fā)病風險。作為目前唯一已知具有膽固醇逆向轉(zhuǎn)運（reverse cholesterol transport，RCT）功能的蛋白質(zhì)，CETP因其對于體內(nèi)脂質(zhì)轉(zhuǎn)運及脂蛋白組成的重要影響，而得到廣泛的關(guān)注和研究。然而一項關(guān)于CETP抑制劑的研究發(fā)現(xiàn)，CETP基因多態(tài)性可能與EH發(fā)病風險相關(guān)[8]，因此，CETP基因多態(tài)性在影響血脂水平的同時是否也影響血壓水平成為一個令人關(guān)注的問題。

3.1 TaqIB、D442G、I405V多態(tài)性及其種族差異性

大量研究表明，CETP基因啟動子區(qū)、內(nèi)含子區(qū)、外顯子區(qū)、3’調(diào)控區(qū)的多個多態(tài)性位點可能與CETP表達水平、血脂水平及心血管疾病風險相關(guān)[1，3]。

TaqIB（rs708272）是第1內(nèi)含子第277位核苷酸的G/A突變，該突變導致Taq IB酶切識別位點消失。具有酶切位點的等位基因稱為B1，而失去酶切位點的等位基因則稱為B2。該突變在各種族人群中普遍存在，如美國白人分布頻率為0.42[9]，日本人為0.39[10]，中國臺灣地區(qū)人群為0.42[11]。本研究結(jié)果顯示，內(nèi)蒙古自治區(qū)蒙古人群分布頻率為0.41；D442G （rs2303790）是外顯子15第55個核苷酸堿基的A/G突變，導致CETP第422位天冬氨酸（aspartic acid，Asp）被甘氨酸（Glycine，Gly）取代。該突變以雜合子的個體較為多見，且在亞洲人群中較為常見，而在歐美白人中尚未見報道。亞洲人群中，又以日本人群分布頻率最高，一般群體可達0.08[12]，而中國漢族一般人群約為0.02[13]。本研究結(jié)果顯示，內(nèi)蒙古自治區(qū)蒙古人群突變率約為0.03；I405V為CETP基因第14外顯子第405密碼子中的A/G突變，該突變導致表達產(chǎn)物異亮氨酸（Isoleucine，I）變?yōu)槔i氨酸（Valine，V），405V等位基因的頻率在非裔美國人群和亞洲人群的分布分別為0.61和0.62，白種人為0.32[14]。本項研究結(jié)果顯示，內(nèi)蒙古自治區(qū)蒙古人群突變率為0.43。

3.2 TaqIB、D442G、I405V多態(tài)性與原發(fā)性高血壓

2010年，SCHECHTER等[8]通過對1998～2003年搜集的CETP多態(tài)性研究資料的分析發(fā)現(xiàn)，CETP基因I405V突變引起CETP活性降低、血清HDL-C水平升高，并可顯著降低高血壓風險。根據(jù)文獻檢索的結(jié)果，這是首次關(guān)于CETP基因多態(tài)性與EH的相關(guān)性的報道。本研究選擇TaqIB、D442G、I405V 3個常見多態(tài)性位點進行與EH相關(guān)性的分析，結(jié)果顯示，TaqIB、D442G、I405V與中國蒙古族EH無關(guān)。由于CETP基因型與表型之間的關(guān)聯(lián)可能受吸煙、飲酒、性別等因素的影響[15]，本研究應(yīng)用二分類回歸分析校正年齡、性別、體重指數(shù)、吸煙、飲酒、血脂水平，結(jié)果表明，TaqIB、D442G、I405V基因型及等位基因分布在EH組與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義，提示上述多態(tài)性位點的突變不能獨立影響蒙古族人群EH發(fā)病風險。

3.3 TaqIB、D442G、I405V單倍型與原發(fā)性高血壓

大量基因關(guān)聯(lián)研究顯示，在EH等多基因復(fù)雜疾病的病因?qū)W研究中，單個位點多態(tài)性的作用可能會由于其他與之連鎖不平衡的位點的影響而被混淆，連鎖不平衡分析及單倍型分析對于基因型-表型的關(guān)聯(lián)研究可能會更為有效。本研究結(jié)果顯示，在EH組與對照組，TaqIB與D442G、TaqIB與I405V均存在較弱的連鎖不平衡，D442G與I405V則有中度的連鎖不平衡，因此，本研究分析3個位點的兩兩組合單倍型和3位點單倍型對EH易感性的影響，結(jié)果表明，單倍型B2-G、B2-G-I攜帶者EH發(fā)病風險降低，可能是降低EH易感性的保護性因素。

目前，CETP基因多態(tài)性降低EH發(fā)病風險的機制還不清楚，推測可能與下述因素有關(guān)：①CETP基因多態(tài)性導致內(nèi)皮細胞內(nèi)CETP表達水平降低，對內(nèi)皮細胞的功能起到保護性調(diào)節(jié)作用；②CETP基因多態(tài)性改變血脂水平及其各成分的比例、結(jié)構(gòu)，具有抗動脈硬化作用，進而保護動脈管壁的彈性和對血壓的緩沖功能[8]。

近年來，大量證據(jù)顯示，遺傳性CETP低水平具有調(diào)脂及降低心、腦血管疾病風險的效應(yīng)。因此，CETP抑制劑已成為心血管系統(tǒng)新藥開發(fā)的熱點[16]。盡管CETP抑制劑可提高HDL-C水平，降低LDL-C水平，但是關(guān)于CETP抑制劑是否能降低動脈粥樣硬化和心血管疾病發(fā)病率，目前仍有爭議。有研究表明，CETP抑制劑的調(diào)脂效果與CETP基因多態(tài)性應(yīng)相關(guān)，但CETP基因多態(tài)性與血壓的相關(guān)性尚不確定[8，17]。通過了解CETP抑制劑的臨床效應(yīng)與CETP基因多態(tài)性的關(guān)系，可進一步明確CETP抑制劑的療效和臨床應(yīng)用范圍。因此CETP基因多態(tài)性與血脂、血壓的相關(guān)性不僅是心血管疾病病因?qū)W研究的內(nèi)容之一，也是CETP抑制劑臨床應(yīng)用的重要理論支撐。

本研究以人口流動性小、遺傳背景單純、穩(wěn)定，生活環(huán)境及生活習慣一致的內(nèi)蒙古自治區(qū)蒙古族人群為研究對象，降低人群分層的影響，可有效提高研究結(jié)果的準確性。對照組血壓＜130/80 mmHg，可降低選擇性偏倚，保證結(jié)果的準確性。但由于B2-G和B2-G-I在人群中分布頻率較低，擬在進一步研究中擴大研究位點的范圍，并分析各位點的聯(lián)合效應(yīng)，以期更深入的了解CETP基因多態(tài)性與EH的關(guān)系。

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（童穎丹編輯）

Associations ofCETPgene polymorphisms and haplotypes with essential hypertension in Chinese Mongolian population*

Shu-dong Niu1,Xiao-ming Tao2,Yu Li1,Yong-yue Liu3,Jian Wang3, Ming-yu Cong1,Wen-yu Zhou2,Chang-chun Qiu4
(1.College of Basic Medical Sciences,Qiqihar Medical University,Qiqihar,Heilongjiang 161006,China;2.Institute of Basic Medical Sciences,Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing 100005,China;3.Department of Epidemiology,Tongliao Center for Disease Control and Prevention,Tongliao,Inner Mongolia Autonomous Region 028099,China;4.Research Institute of Medical Pharmacy,Qiqihar Medical University,Qiqihar, Heilongjiang 161006,China)

ObjectiveTo explore the associations of cholesteryl ester transfer protein (CETP)gene TaqIB, D442G and 1405V polymorphisms and haplotypes with essential hypertension (EH)in Chinese Mongolian population.Methods In this case-control study,883 hypertensive patients (EH group)and 1,044 normal controls (controlgroup)were randomly selected from the InnerMongolia Autonomous Region,China. Polymerase chain reaction (PCR)and direct sequencing of PCR product were used to identify the genotypes. Hardy-Weinberg (H-W)equilibrium and haplotypes distribution were analyzed using the Haploview software.Results There were no significant differences in the distributions of the alleles or genotypes of TaqIB,D442G or 1405V between the EH group and the control group (P＞0.05);while the distribution frequencies of B2-G and B2-G-I haplotypes were significantly lower in the EH group than in the control group [B2-G: ＾OR= 0.359 (95%CI:0.188,0.689),P=0.001;B2-G-I: ＾OR=0.329 (95%CI:0.157,0.691),P=0.002]. Conclusions The TaqIB,D442G and 1405V polymorphisms of theCETPgene could not independently affect the risk of developing EH in Mongolian population,while B2-G and B2-G-I haplotypes obviously decrease the susceptibility to EH and may be protective factors for the development of EH in Mongolian population.

cholesteryl ester transfer protein gene;essentialhypertension;polymorphism;haplotype; Mongolian population

R544.1

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.06.008

1005-8982（2017）06-0038-06

2016-03-31

國家自然科學基金（No：31440054、31371208）；美國中華醫(yī)學基金（No：CMB96-657）；北京市自然科學基金重點項目（No：7001004）

邱長春，E-mail：changchun_qiu@163.com；Tel：0452-2663389