郭清皓，蔡鈞，楊世疆，蔣林濤

（華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬武漢中心醫(yī)院 急診創(chuàng)傷外科，湖北 武漢 430014）

MicroRNA-203抑制骨肉瘤細胞增殖和遷移的機制研究

郭清皓，蔡鈞，楊世疆，蔣林濤

（華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬武漢中心醫(yī)院 急診創(chuàng)傷外科，湖北 武漢 430014）

目的探討microRNA-203（miR-203）對骨肉瘤細胞增殖和遷移的影響及機制。方法 通過逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）測定miR-203在正常成骨細胞hFOB及骨肉瘤細胞系中的表達，將MG-63細胞系分成miR-203組、Scramble組、RAB22A組、NC組，Lipofectamine 2000分別轉(zhuǎn)染miR-203 mimics、Scrambles、pcDNA3.1-RAB22A、空白對照質(zhì)粒；通過噻唑藍（MTT）實驗測定增殖能力，細胞劃痕實驗測定遷移能力；通過Target Scan和雙熒光素酶實驗預(yù)測及驗證miR-203與RAB22A基因的靶向調(diào)節(jié)關(guān)系；RT-PCR測定RAB22A mRNA表達水平；Western blot測定E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白表達水平。結(jié)果 miR-203在骨肉瘤細胞系SAOS-2、SOSP-9607、U2OS及MG-63中較hFOB細胞系表達降低。MTT顯示，在培養(yǎng)48和72 h后，miR-203組相對細胞數(shù)少于Scramble組（P＜0.05）；培養(yǎng)24 h后，Scramble組細胞相對劃痕面積小于miR-203組（P＜0.05）；雙熒光素酶實驗示，miR-203與RAB22A基因存在靶向調(diào)節(jié)關(guān)系。RAB22A組相對劃痕面積小于NC組（P＜0.05）；MTT顯示，在培養(yǎng)24、48和72h后，RAB22A組相對細胞數(shù)多于NC組（P＜0.05）；RAB22A組與NC組比較，E-cadherin下調(diào)表達，N-cadherin上調(diào)表達，Vimentin上調(diào)表達。結(jié)論 miR-203通過下調(diào)RAB22A基因表達，抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，進而抑制骨肉瘤細胞增殖與遷移。

miR-203；RAB22A；骨肉瘤；增殖；遷移

骨肉瘤多發(fā)于兒童或青少年，其常轉(zhuǎn)移部位是肺、胸膜[1-2]。進一步明確骨肉瘤的發(fā)病機制對提高診療水平具有重要意義。MicroRNA（miRNAs）是一類內(nèi)源性的非編碼RNAs，其通過mRNA的3’非編碼區(qū)結(jié)合而靶向下調(diào)基因表達[3-4]。miRNAs調(diào)控著細胞周期、增值、凋亡等過程[5]。研究報道，miR-203參與乳腺癌、前列腺癌、食道鱗癌等多種腫瘤的增殖、遷移及侵襲過程[6-8]。然而，目前尚無miR-203對骨肉瘤增殖遷移影響的報道，本文研究microRNA-203 （miR-203）對骨肉瘤細胞增殖和遷移的影響，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

人成骨細胞系 hFOB、SAOS-2、SOSP-9607、U2OS及MG-63骨肉瘤細胞系購自武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗中心，無血清細胞凍存培養(yǎng)基（roswell park memorial institute 1640，RPMI 1640）、胎牛血清及胰蛋白酶購自美國Hyclone公司，Trizol購自美國Invitrogen公司，實驗所需的一抗購自美國Santa Cruz公司，二抗購自武漢博士德生物科技有限公司，miR-203 mimics和Scrambles由上海吉瑪基因化學(xué)技術(shù)有限公司定制合成，pcDNA3.1-RAB22A由美國Genscript公司定制，Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒購自美國Invitrogen公司。

1.2 細胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及分組

所有細胞系采用RPMI 1640培養(yǎng)基（含10%胎牛血清和抗生素）培養(yǎng)于37℃、5%二氧化碳CO2、飽和濕度的恒溫細胞培養(yǎng)箱中。為探討miR-203過表達對MG-63細胞系增殖和遷移的影響。將對數(shù)生長期的MG-63細胞系分成兩組，分別為miR-203組和Scramble組，按Lipofectamine 2000說明書分別轉(zhuǎn)染miR-203 mimics和Scrambles，終轉(zhuǎn)染濃度為20nmol。培養(yǎng)24h后行噻唑藍[3-（4，5-dimethyl-2-thiazolyl）-2，5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT]和細胞劃痕實驗。為探討RAB22A過表達對MG-63細胞系增殖和遷移的影響及其機制，將MG-63細胞系分成兩組，即RAB22A組和NC組。采用Lipofectamine 2000分別轉(zhuǎn)染 pcDNA3.1-RAB22A和空白對照質(zhì)粒，培養(yǎng)24 h后行MTT及細胞劃痕實驗。

1.3 RNA提取和實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)

按Trizol reagent說明書，從培養(yǎng)細胞中提取總RNA，然后按照TaqMan RNA reverse transcription kit（美國ABI公司）說明書，5 ng總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。在ABI 7500實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）儀中，以β-actin作為內(nèi)參，量化miR-203的表達水平。使用SYBR Green PCR master mix試劑（美國Roche公司）在ABI 7500 qRT-PCR儀中進行qRT-PCR。miR-203正向引物：5'-GCTTTTGAGA ACGTGGATGAG-3'；反向引物：5'-CGAAGATGGTGG CATAGAGAA-3'；使用2-ΔΔCt方法定量，以U6小核RNA作為內(nèi)參，計算miR-203的相對表達量。

1.4 生物信息學(xué)分析及預(yù)測

通過 TargetScan（http：//www.targetscan.org）、mir DB（http：//mirdb.org）及PicTar（http：//pictar.bio. nyu.edu）3種生物信息學(xué)軟件預(yù)測 miR-203與RAB22A的靶向關(guān)系

1.5 熒光素酶實驗

轉(zhuǎn)染前24 h將MG-63細胞接種于24孔板中，分成3組，即突變型質(zhì)粒組、野生型質(zhì)粒組及陰性對照組，突變型質(zhì)粒組共轉(zhuǎn)染miR-203和突變型熒光素酶報告質(zhì)粒pGL3-RAB22A 3’WT；野生型質(zhì)粒組共轉(zhuǎn)染miR-203和野生型熒光素酶報告質(zhì)粒pGL3-RAB22A 3’UTR，陰性對照組共轉(zhuǎn)染miR-203和對照熒光素酶質(zhì)粒。24 h后使用雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)進行熒光活性檢測。實驗重復(fù)3次，6個復(fù)孔/次。以海腎熒光素光吸收值作為內(nèi)參，數(shù)據(jù)計算方法：螢光素酶活性=螢火蟲熒光素光吸收值/海腎熒光素光吸收值。

1.6 MTT實驗

MG-63細胞以1×104個/孔接種于12孔板中，培養(yǎng)24 h后行相應(yīng)的轉(zhuǎn)染實驗，在培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)0、12、24、48和72 h后添加5 mg/ml MTT溶液40 μl，孵育4 h后加入二甲基亞砜200 μl/孔，搖床上充分震蕩。490 nm波長測定吸光度值。相對細胞數(shù)=實驗組數(shù)值/對照組數(shù)值×100%

1.7 細胞劃痕實驗

將miR-203組和Scramble組、RAB22A組和NC 組MG-63細胞用RPMI 1640（含10%胎牛血清）培養(yǎng)在6孔板上，待融合后，用滅菌槍頭劃直線，劃痕后0～24 h，用反轉(zhuǎn)的Olympus IX50顯微鏡通過10倍物鏡和Image-Pro Plus軟件捕獲測量劃痕面積，實驗重復(fù)3次，劃痕面積越大，表示遷移能力越弱。

1.8 Western blot檢測

培養(yǎng)24 h后消化細胞，提取細胞總蛋白，蛋白變性、上樣，每泳道上樣量為50μg蛋白。50V、100mA電泳2 h結(jié)束后，聚偏氟乙烯膜轉(zhuǎn)印。脫脂奶粉液封閉2 h。三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽水清洗，分別加入RAB22A一抗（1∶200）、E-cadherin一抗（1∶200）、N-cadherin一抗（1∶200）、Vimentin一抗（1∶200）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）一抗（1∶200），二抗?jié)舛?∶1000，增強化學(xué)發(fā)光法顯影。用軟件Image J測量Western blot相關(guān)條帶進行定量。目的蛋白的相對數(shù)值=目的Western blot定量數(shù)值/GAPDH Western blot數(shù)值。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件，用Graphpad 6.0統(tǒng)計作圖軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，兩組比較用t檢驗，多組間比較用方差分析，若方差齊則兩兩比較用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-203在骨肉瘤及正常成骨細胞系中的表達

qRT-PCR結(jié)果顯示，正常人類成骨細胞系hFOB 的miR-203相對表達量為（1.0±0.09），miR-203在骨肉瘤細胞系SAOS-2的相對表達量為（0.32±0.07）, miR-203在SOSP-9607細胞系的表達量為（0.30± 0.05），miR-203在U2OS細胞系的表達量為（0.26± 0.05），miR-203在 MG-63細胞系中表達量為（0.15±0.04），經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F= 3.841，P=0.037）；進一步兩兩比較結(jié)果，骨肉瘤細胞系SAOS-2、SOSP-9607、U2OS及MG-63細胞系中miR-203相對表達量低于人正常成骨細胞系hFOB。見圖1。

圖1 miR-203在骨肉瘤和成骨細胞系中的表達

2.2 過表達miR-203抑制MG-63細胞的增殖和遷移

轉(zhuǎn)染miR-203 mimics后，miR-203組miR-203相對表達量為（9.3±0.3），Scramble組miR-203相對表達量為（1.5±0.2），經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=37.469，P=0.021），miR-203組miR-203相對表達量高于Scramble組（見圖2A）。MTT結(jié)果示，在培養(yǎng)48 h后，miR-203組相對細胞數(shù)為（1.2±0.1），Scramble組相對細胞數(shù)為（2.5±0.2），經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=-10.069，P=0.019）；培養(yǎng)72h后，miR-203組相對細胞數(shù)為（2.1±0.2），Scramble組相對細胞數(shù)為（3.3±0.2），經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=-6.736，P=0.001），miR-203組相對細胞數(shù)少于Scramble組（見圖2B）。培養(yǎng)24 h后，Scramble組細胞相對劃痕面積為（25.4±4.3）%，miR-203組細胞相對劃痕面積為（81.5±6.3）%，經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=-12.739，P=0.031），Scramble組細胞相對劃痕面積少于miR-203組（見圖2C、D）。

圖2 過表達miR-203抑制MG-63細胞增殖和遷移

2.3 miR-203靶向抑制RAB22A基因的表達

通過TargetScan預(yù)測miR-203和RAB22A基因3'端非翻譯區(qū)的結(jié)合位點；構(gòu)建野生型RAB22A 的3’UTR端、突變型的熒光素酶報告質(zhì)粒及陰性對照熒光素酶質(zhì)粒。野生型質(zhì)粒組、突變型質(zhì)粒組、陰性對照組的相對螢光素酶活性分別為（0.19±0.08）、（1.0±0.13）、（1.0±0.15），經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=4.753，P=0.025）；進一步兩兩比較，野生型質(zhì)粒組與突變型質(zhì)粒組、陰性對照組比較，經(jīng)LSD-t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=-8.252和-9.191，P=0.003和0.012），野生型質(zhì)粒組熒光素酶活性低于突變型質(zhì)粒組和陰性對照組（見圖3A）。

圖3miR-203靶向抑制RAB22A的表達

qRT-PCR結(jié)果顯示，miR-203組的RAB22A mRNA相對表達量為（0.22±0.09），Scramble組相對表達量為（1.00±0.14），經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=-8.117，P=0.025），miR-203組RAB22AmRNA相對表達量低于Scramble組（見圖3B），Western blot檢測顯示，miR-203組RAB22A蛋白表達量為（1.38± 0.41），Scramble組表達量為（4.28±0.49），經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=-7.861，P=0.012），miR-203組RAB22A蛋白表達量低于Scramble組（見圖3C）。

2.4 過表達RAB22A促進MG-63細胞增殖和遷移

MG-63細胞系轉(zhuǎn)染 pcDNA3.1-RAB22A后，RAB22A組RAB22A蛋白表達量為（8.20±0.48），陰性對照組為（1.1±0.18），經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=23.988，P=0.039），RAB22A組RAB22A蛋白表達量高于陰性對照組（見圖4A、B）。培養(yǎng)24 h后，RAB22A組細胞相對劃痕面積為（18.4±2.3）%，陰性對照組為（41.5±5.9）%，經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=-6.318，P=0.001），RAB22A組細胞相對劃痕面積少于陰性對照組（見圖4C、D）。MTT結(jié)果顯示，在培養(yǎng)24、48和72 h后，RAB22A組相對細胞數(shù)分別為（2.3±0.16）、（2.8±0.23）和（3.5±0.31），陰性對照組相對細胞數(shù)分別為（1.6±0.13）、（2.3±0.19）和（2.9±0.23），兩組24、48和72 h相對細胞數(shù)比較，經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=5.881、2.902和2.692，P=0.002、0.021和0.027），RAB22A組相對細胞數(shù)多于陰性對照組（見圖4E）。RAB22A組與NC比較，E-cadherin下調(diào)表達 [（0.18±0.09）vs（1.1± 0.15）（t=-9.109，P=0.000）]，N-cadherin上調(diào)表達[（4.6±0.73）vs（1.13±0.24）（t=7.821，P=0.000）]，Vimentin上調(diào)表達[（5.1±0.73）vs（1.09±0.19）（t= 9.207，P=0.000）]（見圖4F）。

圖4 過表達RAB22A促進MG-63細胞的增殖和遷移

3 討論

骨肉瘤是好發(fā)于長骨端的惡性腫瘤，診斷主要依靠病史、檢驗結(jié)果及影像學(xué)資料。局部腫痛、跛行為骨肉瘤的常見臨床表現(xiàn)，軟組織腫塊和骨皮質(zhì)增生及特征性的Codmans三角為常見的影像學(xué)特征[9]。治療方法包括手術(shù)、化療、放療及免疫治療等。但骨肉瘤預(yù)后仍較差。據(jù)研究報道，年齡＜30歲的骨肉瘤患者5年生存率達60%，30～49歲的5年生存率達50%，＞50歲的5年生存率僅為30%[10]。近年來，一系列的醫(yī)學(xué)研究指出，miRNAs在不同腫瘤組織中表達異常，并對腫瘤的發(fā)生有著重要的作用[5-8]。因此miRNAs被認為是一種潛在的腫瘤診斷與治療的新靶標。近期報道指出，miR-203與乳腺癌、前列腺癌、食管鱗癌、膀胱癌,的增殖與遷移相關(guān)[6-8，11-13]。WANG等[6]報道，沉默miR-203可通過靶向BIRC5 和LASP1蛋白而抑制三陰乳腺癌增殖和遷移。miR-203被報道在前列腺癌組織中低表達，是抑癌基因，過表達miR-203可抑制前列腺癌細胞增殖、遷移和侵襲[7]。在食管鱗癌中，miR-203可通過Np63信號通路抑制食管鱗癌細胞增殖[8]。梁佳等[12]報道，miR-203在食管癌細胞及組織中呈低表達，呈高甲基化狀態(tài)，且與TNM分期及組織分化程度相關(guān)。胡俊華等[13]報道，miR-203轉(zhuǎn)染胃癌細胞系SGC7901后，侵襲能力減弱，凋亡增加，并通過靶向調(diào)控SNAI 2降低胃癌細胞侵襲能力，促進其凋亡。徐磊等[14]報道，miR-203可靶向調(diào)節(jié)Bmi-1基因，下調(diào)其表達，通過下調(diào)Bmi-1基因表達抑制H1975肺腺癌細胞株的侵襲轉(zhuǎn)移，可作為一種潛在的抑制轉(zhuǎn)移的分子。

本研究探討miR-203對骨肉瘤細胞的增殖和遷移的影響及其調(diào)控機制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-203在骨肉瘤細胞系SAOS-2、SOSP-9607、U2OS及MG-63中呈顯著低表達，說明miR-203在骨肉瘤細胞系中表達異常。這與miR-203在前列腺癌、乳腺癌等腫瘤中的表達情況相一致[6-8]。通過在MG-63細胞過表達miR-203，發(fā)現(xiàn)miR-203組的相對細胞數(shù)少于對照組，細胞劃痕面積大于對照組，提示miR-203抑制MG-63的細胞增殖及遷移能力，與前列腺癌、食管磷癌及乳腺癌中的報道相一致[6-8]。

RAB22A是Ras GTP酶超家族成員[15]。有研究表明，RAB22A是一個原癌基因，并與多種腫瘤關(guān)系密切[16]。例如，RAB22A促進胃癌的增殖及侵襲[17]。本課題探討miR-203對RAB22A基因的表達調(diào)控作用。實驗發(fā)現(xiàn)，miR-203抑制RAB22A 3’UTR介導(dǎo)的螢光素酶活性，并下調(diào)其基因和蛋白表達水平。因此，miR-203能直接抑制RAB22A基因的表達，RAB22A是miR-203的直接作用靶標。進一步實驗發(fā)現(xiàn)，RAB22A組MG-63細胞劃痕面積低于對照組，相對細胞數(shù)高于對照組。因此，RAB22A過表達能促進MG-63的細胞增殖及遷移，進一步發(fā)現(xiàn)，RAB22A下調(diào)E-cadherin，上調(diào)N-cadherin和Vimentin基因的表達。因此，RAB22A能抑制MG-63細胞的上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化。該結(jié)果與前述RAB22A在胃癌中的細胞調(diào)控功能相一致[17]。

綜上所述，miR-203通過抑制RAB22A基因的表達，進而抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，而抑制骨肉瘤細胞的增殖及遷移。這是一種調(diào)控骨肉瘤細胞增殖與遷移的新機制，為骨肉瘤發(fā)病機制的研究提供新的線索。miR-203可望成為骨肉瘤診斷的一種潛在的生物標志物，并可能成為治療的新靶標。

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（童穎丹 編輯）

Mechanism of microRNA-203 inhibiting proliferation and migration of osteosarcoma cells

Qing-hao Guo,Jun Cai,Shi-jiang Yang,Lin-tao Jiang
(Department of Emergency and Trauma Surgery,the Central Hospital of Wuhan,Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology, Wuhan,Hubei 430014,China)

ObjectiveTo investigate the potential role of miR-203 in the regulation of the proliferation and migration of osteosarcoma cells,as well as the regulatory mechanism.Methods The expression levels of miR-203 in the osteosarcoma cells and the normal osteoblasts were measured by RT-PCR.The MG-63 cell line was divided into miR-203 group transfected with miR-203 mimics,scramble group transfected with scrambles,RAB22A group transfected with pcDNA3.1-RAB22A plasmid and NC group transfected with blank plasmid by Lipofectamine 2000.The cell migration ability was measured by wound healing assay.Cell number was examined by MTT assay.The target relationship between miR-203 andRAB22Agene was predicted and verified by Target Scan software and double luciferase assay.The expression level ofRAB22AmRNA was measured by RT-PCR.The expression levels of E-cadherin,N-cadherin,Vimentin and RAB22A protein were measured by Western blot.Results Compared with the hFOB cells,the expression of miR-203 was significantly low in the osteosarcoma cell lines SAOS-2,SOSP-9607,U2OS and MG-63.MTT method showed that the number of MG-63 cells in the miR-203 group was significantly smaller than that in the scramble group aftercultured for 48 and 72 h (P＜0.05).After cultured for 24 h,the relative scratch area of the scramble group was significantly smaller than that of the miR-203 group(P＜0.05).TargetScan software and double luciferase assay verified the target relationship between miR-203 andRAB22Agene.The relative scratch area in the RAB22A group was significantly smaller than that in the NC group (P＜0.05).MTT method showed that the number of the MG-63 cells was significantly increased in the RAB22A group compared with the NC group after cultured for 24,48 and 72 h(P＜0.05).Compared with the NC group,E-cadherin expression was down-regulated,N-cadherin and Vimentin expressions were up-regulated in the RAB22A group.Conclusions MiR-203 inhibits proliferation and migration of osteosarcoma cells by inhibiting RAB22A gene expression and epithelialmesenchymal transition.

microRNA-203;RAB22A;osteosarcoma;proliferation;migration

R738.1

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.06.007

1005-8982（2017）06-0032-06

2016-09-27

蔣林濤，E-mail：lintaojiang99@21cn.com